酶促反应动力学2.pptx

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1、第四章 酶促反应动力学基本要求：掌握简单催化反应动力学、有抑制的和酶失活反应动力学，掌握影响酶催化反应速率的因素，以及动力学参数的求取。重点：各种情况下的酶动力学方程。难点：酶催化反应动力学机理方程的推导。学时：6学时第1页/共84页第2页/共84页第一节 酶促反应学的特点第3页/共84页第二节 均相酶促反应动力学第4页/共84页2.1 酶促反应动力学的基础第5页/共84页（一）反应速率及其测定反应速率：单位时间内反应物或生成物浓度的改变量。数学表示方法:或tr反应速率与时间的关系第6页/共84页（二）反应分子数和反应级数1.反应分子数反应分子数是在反应中真正相互作用的分子数目。（1）单分子反

2、应根据质量作用定律，单分子反应的动力学方程：第7页/共84页（2）双分子反应根据质量作用定律，双分子反应的动力学方程：第8页/共84页2.反应级数 根据实验结果，整个化学反应反应的速率服从哪种分子反应速率方程式，则这个反应就是几级。（1）一级反应反应速率只与反应物的浓度的一次方成正比关系，为一级反应。第9页/共84页移项积分得则当第10页/共84页代入则因而tk一级反应lnc与时间关系第11页/共84页（2）二级反应反应速率只与反应物的浓度的二次方成（或两种底物浓度的乘积）正比关系，为二级反应。当用a、b分别代表反应物A和B的初始浓度，x表示反应时间t时已发生反应的物质浓度，则有：第12页/共

3、84页情况1：A和B的初始浓度相同，则移项积分情况1：A和B的初始浓度不同，则移项积分kt第13页/共84页（3）零级反应与反应物的浓度无关，而受其它因素的影响，为积分xtk第14页/共84页2.2 酶促反应动力学方程式（一）Michaelis-Menten 方程基于快速平衡理论方程推导三点假设(平衡假设)：与底物浓度S相比，酶的浓度E是很小的，因而可忽略由于生成中间复合物ES而消耗的底物。不考虑这个逆反应的存在。若要忽略该反应的存在，则必须是产物P为零，换言之，该方程适用于反应的初始状态。认为基元反应的反应速率最慢，为该反应速率的控制步骤，而这一反应速率最快，并很快达到平衡状态。第15页/共

4、84页对酶催化反应过程的机理，得到大量实验结果支持的是活性中间复合物学说，该学说认为酶催化反应至少包括两步，首先是底物S和酶E相结合形成中间复合物ES，然后该复合物分解成产物P，并释放出酶E。例如：酶反应 其反应机理可表示为第16页/共84页根据化学动力学，反应速率通常以单位时间、单位反应体系中某一组分的变量来表示。对均相酶的催化反应，单位反应体系常用单位体积表示。反应的速率可表示为 r rs s：底物底物S S的消耗速率的消耗速率（mol/Lsmol/Ls）r rp p：产物产物P P生成速率生成速率（mol/Lsmol/Ls）v v：反应体系的体积：反应体系的体积（L L）n ns s、n

5、 np p：底物：底物S S和产物和产物P P的质量的质量（molmol）t t：时间时间（s s）第17页/共84页根据质量作用定律，P的生成速率可表示为：速率控制步骤在反应动力学中是一个重要的概念。在一个多步骤的反应体系中，其中反应速率最慢的一步称为速率的控制步骤，并且控制步骤的速率决定了该反应的速率。第18页/共84页根据上述假定（3），可列出 K S 为解离常数（mol/l）反应体系中酶的总浓度 为 第19页/共84页 代入 得米氏方程或称MM方程 rp,max：P的最大生成速率 E0：酶的总浓度，亦为酶的初始浓度 第20页/共84页Briggs和JBHaldane对上述第三点假设进行

6、修正，提出了“拟稳态”假设。（二）Michaelis-Menten 方程修正第一步：第二步：ESPE+“拟稳态”假设合成的ES=分解ES第21页/共84页 认为由于反应体系中底物浓度要比酶的浓度高得多，中间复合物分解时所得到的酶又立即与底物相结合，从而使反应体系中复合物的浓度维持不变，即中间复合物的浓度不再随时间而变化。消去 得km：米氏常数(mol/l)第22页/共84页km与ks的关系为由两种推导方法所得速率方程式形式基本相同，不同的是ks值代表反应的平衡常数，而km值称为米氏常数，它代表动态的平衡常数，表示实际的恒态时的浓率关系。当 时，km值才接近于ks第23页/共84页 米氏方程rr

7、maxrmax/2Kms酶浓度一定时底物浓度对反应速率的影响第24页/共84页对米氏方程的讨论：当sKm时，属零级反应。当sKm时，。Km在数量上等于反应速度达到最大反应速度一半时的底物浓度。第25页/共84页例4-1：有一均相酶催化反应，km值为210-3mol/l，当底物的初始浓度S0为110-5mol/l时，若反应进行1 min，则有2%的底物转化为产物。试求：（1）当反应进行了3 min，底物转化为产物的百分数是多少？此时底物和产物的浓度分别为多少？（2）当S0为110-6mol/l时，也反应了3 min，底物和产物的浓度又是多少？（3）最大反应速率rmax值为多少？第26页/共84页

8、解：（1）根据题意，此时一般可认为按一级反应处理，其动力学方程可表示为：mol/l时第27页/共84页将已知数据代入上式中，求得 min-1、当 t=3min时，可以求得 mol/l xS=6%mol/l 第28页/共84页（2）当S0为110-6mol/l时，仍可视为一级反应，t=3 min时，同样可求得 xS=6%mol/l mol/l 第29页/共84页3）据 得 mol/lmin 第30页/共84页（1）米氏常数的意义 是酶的一个特性常数：的大小只与酶的性质有关，而与酶浓度无关。值随测定的底物浓度、反应的温度、pH及离子强度而改变。根据km值可以推断酶和底物的亲和力。如果酶的专一性不高

9、，可催化几种底物发生反应时，km值最小的就表示酶与这一底物的亲和力最大，反之，则最小。（三）动力学参数的意义第31页/共84页根据km值，可以估计胞内基质浓度，如 是没有意义的。第32页/共84页若已知某个酶的Km值，就可以计算出在某一底物浓度时，其反应速率相当于Vmax的百分率。Km值可以帮助推断某一代谢反应的方向和途径。催化可逆反应的酶，对正逆两向底物的Km不同。第33页/共84页Km可以帮助推断某一反应的方向和途径乳酸脱氢酶乳酸丙酮酸脱氢酶乙酰CoA丙酮酸脱羧酶乙醛Km=1.7x10-5mol/LKm=1.3x10-3 mol/LKm=1.0 x10-3mol/L 丙酮酸第34页/共84

10、页（2）Vmax和K3(Kcat)的意义 在一定的酶浓度下，酶对特定底物的Vmax也是一个常数。当s很大时，Vmax=K3E。Vmax与K3成线性关系，而直线的斜率为K3。K3 表示当酶被底物饱和时每秒钟每个酶分子转换底物的分子数，这个常数又叫转换数（简称TN)，通称催化常数（catalytic constant,kcat).Kcat值越大，表示酶的催化效率越高。第35页/共84页四、酶动力学图解法 要建立一个完整的动力学方程，必须通过动力学实验确定其动力学参数。对Michaelis-Menten方程，就是要确定rmax（或k+2）和km值。但直接应用Michaelis-Menten方程求取动

11、力学参数所遇到的主要困难在于该方程为非线性方程。为此常将该方程加以线性化，通过作图法直接求取动力学参数。第36页/共84页1.双倒数图解法（Lineweaver Burk图解）双倒数 1 Km 1 1 =+V Vmax S Vmax（一）图解法第37页/共84页-1/Km1/Vmax斜率=Km/Vmax第38页/共84页双倒数法应用广泛，但有两个缺点：1、选用基质浓度不宜等量增加，否则在作图时，点都会集中在纵轴附近，难于正确作图。基质浓度以选用1.0、1.11、1.25、1.43、1.67、2.0、2.5、3.33，5和10等为宜，这样倒数值几乎是等量递增的。2、反应速率测定稍有误差，其倒数值

12、误差必将扩大，特别是在低浓度基质测定时，引起的误差更大，这样将影响直线斜率，影响 rmax及Km值 的测定。第39页/共84页2.v-v/S作图法(Eadie-Hofstee)将米氏方程改写：第40页/共84页3.Hanes-Woolf作图法将米氏方程改写：第41页/共84页4.Eisenthal和Cornish-Bowden直接线性作图将米氏方程改写：第42页/共84页（二）积分法Henri Michaelis Menten积分方程式 有时在酶反应过程中，基质或产物的浓度可以测得，但反应初速度则难以测定。这时，就可选用积分方程式来测定酶的Vmax和Km。第43页/共84页式中：S为时间t时的

13、基质浓度(S0-P),(S0-P)为时间t内所用去的基质浓度，也为时间t内所生成的产物浓度P。上式可改写为:上式也是直线方程式，斜率为 ，直线交点于纵坐标 ，与横坐标交于 。第44页/共84页例4-2：在pH=5.1，15时测得葡萄糖淀粉酶水解麦芽糖的初速度为：S 103(M)5.55 8.33 11.11 13.69 16.66 22.22 27.77 V 104(M/min）1.63 2.11 2.41 2.76 3.01 3.39 3.47试从测定结果求这个酶反应的 Km 和Vmax 值。第45页/共84页解：从表S及V值，计算得 1/S 及 1/V 值，作图。从连接各点所得的直线，求得

14、 第46页/共84页第三节有抑制的酶催化反应动力学 在酶催化反应中，由于某些外源化合物的存在而使反应速率下降，这种物质称为抑制剂。抑制作用分为可逆抑制与不可逆抑制两大类。如果某种抑制可用诸如透析等物理方法把抑制剂去掉而恢复酶的活性，则此类抑制称为可逆抑制，此时酶与抑制剂的结合存在着解离平衡的关系。如果抑制剂与酶的基因成共价结合，则此时不能用物理方法去掉抑制剂。此类抑制可使酶永久性地失活。例如重金属离子Hg2+”、Pb2+”等对木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶的抑制都是不可逆抑制。第47页/共84页根据产生抑制的机理不同不可逆抑制可逆抑制v竞争性抑制v非竞争性抑制v反竞争性抑制第48页/共84页1.竞争性

15、抑制动力学 若在反应体系中存在有与底物结构相类似的物质，该物质也能在酶的活性部位上结合，从而阻碍了酶与底物的结合，使酶催化底物的反应速率下降。这种抑制称为竞争性抑制，该物质称为竞争性抑制剂。其主要特点是，抑制剂与底物竞争酶的活性部位，当抑制剂与酶的活性部位结合之后，底物就不能再与酶结合，反之亦然。在琥珀酸脱氢酶催化琥珀酸为延胡索酸时，丙二酸是其竞争性抑制剂。第49页/共84页式中：I为抑制剂；(EI)为非活性复方物。第50页/共84页底物的反应速率方程为:又：第51页/共84页经整理后可得KI抑制剂的解离常数（mol/l）KmI有竞争性抑制时的米氏常数（mol/l）可以看出，竞争性抑制动力学的

16、主要特点是米氏常数值的改变，rmax不受竞争性抑制剂的影响。由于有抑制剂的存在，须有较高的基质浓度，才能维持一定的rmax值。第52页/共84页竞争性抑制动力学的主要特点：竞争性抑制剂的抑制程度取决于S，I，Km和KmI，当I增加，或KI减小，都会使KmI值增大，使酶与底物的结合能力下降，活性复合物减少，因而使底物反应速率下降。若I不变，增加S，抑制程度降低；若S不变，增加I，抑制程度增加。在一定的S和I条件下，KI值越低，抑制程度越大。第53页/共84页竞争性抑制的s-r关系图：第54页/共84页竞争性抑制的双倒数方程式或第55页/共84页第56页/共84页又以KmI对I作图，据此图可求出K

17、m和KI值.竞争性抑制的KI与I关系图第57页/共84页抑制剂的解离常数 由此可看出，KI愈小，表明抑制剂与酶的结合力愈强，对酶催化反应能力的抑制作用就越强。当酶的活性部位与一个抑制剂分子相结合时，KmI与I的关系为一直线，可称为线型竞争抑制；如果酶的活性部位与两个以上的抑制剂分子相结合，则与的关系为一抛物线，可称为抛物线型竞争抑制。第58页/共84页例4-3：在一定的酶浓度、pH和温度条件下，没有催化剂时，酶催化反的反应速率为r0；当抑制剂浓度为510-3M时，酶反应速率为rsI，底物浓度与对应的反应结果如下表，求Km、KmI、rmax值。1.251.000.750.50r0(任意单位)15

18、113811893rsI(任意单位)83.972.458.841.9第59页/共84页解：根据数据作图。有抑制剂时，抑制作用为竞争性抑制第60页/共84页(二)非竞争性抑制动力学若抑制剂可以在酶的活性部位以外与酶相结合，并且这种结合与底物的结合没有竞争关系，这种抑制称为非竞争性抑制。此时抑制剂既可与游离的酶相结合，也可以与复合物ES相结合，生成了底物酶抑制剂的复合物SEI。绝大多数的情况是复合物SEI为一无催化活性的端点复合物，不能分解为产物，即使增大底物的浓度也不能解除抑制剂的影响。还有一种是三元复合物SEI也能分解为产物，但对酶的催化反应速率仍然产生了抑制作用。如核苷对霉菌酸性磷酸酯酶的抑

19、制属于非竞争性抑制。第61页/共84页 非竞争性抑制的普遍机理式可表示为第62页/共84页式中：为非竞争性抑制时的最大反应速率.第63页/共84页对非竞争性抑制，由于抑制剂的作用使最大反应速率降低了 倍，并且增加I、KI减小都使其抑制程度增加。此时rSI对S的关系如图。第64页/共84页第65页/共84页根据LB作图法，上式可整理成或 以 作图，可得一直线，并求出Km和 rI,max值。第66页/共84页第67页/共84页又根据式可通过实验测得不同I下rI,max的，进而确定KI值。第68页/共84页如果SEI也能分解为产物，同样可整理出形式与 类似的速率方程式，所不同的只是rI,max所包含

20、的参数上。如何判断复合物SEI是否分解为产物，可通过改变抑制剂用量并测定底物的反应速率来判断。当I增加到某一程度，rSI减小直至趋于0，则为SEI不能分解为产物；如果随着I的增加，rSI趋于一定值，则SEI能分解为产物。第69页/共84页非竞争性抑制与竞争性抑制的主要不同点是：对竞争性抑制，随着底物浓度的增大，抑制剂的影响可减弱；而对非竞争性抑制，即使增大底物浓度也不能减弱抑制剂的影响。从这个意义上说，竞争性抑制作用是可逆的，非竞争性抑制作用是不可逆的。第70页/共84页第四节 酶的失活动力学酶是一种不稳定的物质，常因温度、pH等因素的影响而产生不可逆的活性下降。酶在保存和参与反应时均可能失活

21、。前者的失活又称为稳定性。在使用时酶的失活规律对于酶催化反应过程的设计和控制都是十分重要的。其中酶的热失活，或称作热变性是最重要的一种酶失活形式。第71页/共84页一、未反应时的热失活动力学 了解未反应时酶的热稳定性关系到酶的保存。测定酶未反应时的热稳定的方法，是在一定条件下，使酶溶液恒温保持一定的时间，然后在最适宜的pH和温度下测定残存的酶活力，即残存酶活。第72页/共84页在不同温度下反复测定，即可得到一条曲线。该曲线可以表示的酶失活特性，称为酶的热稳定性。若改变保温时间，则会得到不同的稳定曲线。第73页/共84页如要了解酶在未反应时的失活速率，可将残存的酶活性对其失活时间作图，则又可得到

22、一条曲线，该曲线称为失活曲线。第74页/共84页这些曲线反映了酶的真正热稳定性。酶的热变性失活很复杂。一般将其分为可逆失活与不可逆失活两大类，并提出了多种失活动力学模型。下面主要介绍一步失活模型。第75页/共84页 该模型又称为一级失活模型。以E和D分别表示活性酶与失活酶，则失活反应方程式可表示为 Kd和Kr分别表示正、逆反应的速率常数。时间为t时，活性酶E的浓度为Et，则活性酶的浓度随时间的净减少速率为第76页/共84页系统中酶的总浓度若以E0表示，则存在下式D为失活的酶浓度。代入上式，并利用初始条件t=0，Et=E0，经整理可得下式 对不可逆失活反应，Kr=0。因此 第77页/共84页 多

23、数酶的热失活服从上式，kd可称为衰变常数，单位为 。kd的倒数称为时间常数td。当Et为E0的一半的时间称为半衰期。用 表示。kd、td和 之间的关系为第78页/共84页二、反应时酶的热失活动力学 反应时酶的稳定性将直接关系到酶的使用寿命，因而特别重要。酶在反应中的稳定性称为操作稳定性。假如做不同温度下反应转化率随时间的变化曲线，即反应过程曲线，可得到如图所示的结果。（a）以温度T为参数，转化率X与时间t的关系曲线（b）以时间t为参数，转化率X温度T的关系曲线 第79页/共84页 从图中可以看出，在时间一定时，随着温度的升高，反应速率在增大，因而转化率在提高；但当温度高到某一数值时，其转化率反

24、而下降。这时因为当温度升高到某一值，酶的热失活速率也在加速，致使活性酶的量在减少，因而反应速率下降，最终为0。又从图中曲线可看出，对某一反应时间，就有一转化率最高的温度，该温度称为最佳温度。不同的反应时间，有不同的最佳温度。最佳温度是温度对酶催化速率和酶失活速率双重作用的结果。第80页/共84页 对于底物浓度的变化对酶稳定性的影响，提出了下述模型。第81页/共84页 根据上述机理可看出，无论是游离酶还是酶的复合物均有可能失活，其失活速率方程可表示为 式中 其中 为底物对酶稳定性的影响系数,Ef为游离酶浓度。第82页/共84页根据上述模型可知：时，底物对酶失活没有影响；时，酶完全被底物所保护，复合物ES 完全不失活，此时只有游离酶失活；时，底物对酶有部分保护作用，能在 一定程度上抑制酶的失活；时，底物加速酶的失活。第83页/共84页感谢您的观看！第84页/共84页