真核细胞周期调控分子机制唐旭东级.pptx

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1、2001年年10月月8日美国人日美国人LelandHartwell、英国、英国人人PaulNurse、TimothyHunt因对细胞周期调因对细胞周期调控机理的研究而荣获控机理的研究而荣获诺贝尔生理医学奖诺贝尔生理医学奖第第2页页/共共65页页第1页/共65页第一节第一节 细胞周期及调控的概述细胞周期及调控的概述第第3页页/共共65页页第2页/共65页细细胞胞周周期期间期间期(interphase)分裂期分裂期(M)G1期(合成前期)S期(DNA合成期)G2期(合成后期)前期(prophase)中期(metaphase)后期(anaphase)末期(telophase)一、细胞周期一、细胞周期

2、(cellcycle)有丝有丝分裂分裂(mitosis)胞质分裂胞质分裂(cytokinesis)第第4页页/共共65页页第3页/共65页第第5页页/共共65页页第4页/共65页细胞周期的不同时相(phase)G0裂殖酵母裂殖酵母第第6页页/共共65页页第5页/共65页二、细胞周期调控的主要分子机制细胞周期引擎异二聚体蛋白激酶复合体 包括二个亚单位：调节亚单位：细胞周期蛋白（cyclin）cyclin浓度随细胞周期不断变化催化亚单位：细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dependent kinase，CDK)-CDK单独存在时无活性，与cyclin结合才具有激酶的活性;-cyclin不仅起

3、激活CDK的作用，还决定了CDK何时、何处、将何种底物磷酸化。第第7页页/共共65页页第6页/共65页三种控制细胞周期进程的细胞周期蛋白-CDK复合体：G1、S期和有丝分裂-CDK复合体（G1-CDK复合体的合成和活性的调节是细胞周期的主要调控机制）前复制复合体（pre-replication complex，pre-RC）：其磷酸化既可启动DNA的复制，又可防止新的前复制复合体组装翻译后调节机制：蛋白磷酸化、泛素依赖的蛋白降解第第8页页/共共65页页第7页/共65页三、研究细胞周期调控的实验体系（一）细胞的DNA含量提示其所处的细胞周期时相 用与DNA结合的荧光染料处理细胞，再用流式细胞术(

4、FCM)测定每一细胞的DNA含量。荧光激活的细胞分选仪（FACS)（二）细胞融合实验（三）互补实验第第9页页/共共65页页第8页/共65页G0+G1SG2+MG0+G1SG2+MControlDrug-treated细胞周期阻滞于细胞周期阻滞于S期期第第10页页/共共65页页第9页/共65页ControlG0+G1G0+G1G0+G1G0+G1G2+MG2+MG2+MG2+MSSSS细胞周期阻滞于细胞周期阻滞于G2期期第第11页页/共共65页页第10页/共65页参与细胞周期调控的分子参与细胞周期调控的分子第二节第第12页页/共共65页页第11页/共65页一、细胞周期蛋白（cyclin）种类：目

5、前分离出30余种 脊椎动物：A1-2、B1-3、C D1-3、E1-2、F、G、H等 人类：A、B、C、D、E。分类：不同时相发挥作用 G1周期蛋白：在G1期发挥作用（CDE）（S和）M期周期蛋白：AB在G2/M调控点发挥作用第第13页页/共共65页页第12页/共65页一、细胞周期蛋白（cyclin）共同结构：均含有一段约100150个氨基酸的保守序列，称为周期蛋白盒（cyclin box)，是与CDK结合的关键区。功能：不同的cyclin识别不同的CDK，组成不同的cyclin-CDK复合物，表现出不同的CDK激酶的活性。第第14页页/共共65页页第13页/共65页G1周期蛋白表达顺序：先c

6、yclin C D，再cyclin Ecyclin D和E，为细胞通过限制点所必需cyclin D亚类：D1 D2 D3cyclin D CDK：4、6cyclin D功能：使下游蛋白磷酸化 如：CDK4/6-cyclin D使视网膜母细胞瘤（retinoblastoma，Rb）蛋白磷酸化释放转录因子释放转录因子E2F促进促进CDK2、cyclinE表达表达进一步磷酸化进一步磷酸化Rb阳性反馈回路阳性反馈回路*此时细胞周期不依赖此时细胞周期不依赖CDK4/6-cyclinD复合体的活性复合体的活性第第15页页/共共65页页第14页/共65页细胞周期的调控 CDK1/Cyc B*CyclinD和

7、和E在在G1期表达，为细胞期表达，为细胞通过限制点所通过限制点所必需必需第第16页页/共共65页页第15页/共65页S和M期周期蛋白合成顺序：A早于B（1）cyclin A：与CDK1和CDK2形成复合物（2）cyclin B亚类：B1 B2 B3合成：在胚胎细胞周期中连续合成，但在有丝分裂后期（晚期）迅速降解。？CDK：1第第17页页/共共65页页第16页/共65页二、细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）种类：目前动物中发现9种，人类7种（17)共同结构：相似的激酶结构域，是一段保守序列，与周期蛋白的结合有关。至少有两个结构域：T-loop、ATP结合位点激活：Cyclin与CDK结合为CDK发

8、挥酶活性所必需但CDK仅与Cyclin结合并不能使CDK激活只有T-loop中的Thr161残基磷酸化才能使CDK激活。第第18页页/共共65页页第17页/共65页二、细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）功能：在不同细胞时相，特定的CDK与特定的cyclin形成细胞周期特异的蛋白激酶复合体，调节细胞周期进程。激活的CDK1可将靶蛋白磷酸化而产生相应的生理效应。第第19页页/共共65页页第18页/共65页脊椎动物细胞脊椎动物细胞CDK-细胞周期蛋白复合体细胞周期蛋白复合体CDK细胞周期蛋白细胞周期蛋白功能功能CDK1cyclinB1,B2,B3有丝分裂有丝分裂cyclinAG2/MCDK2cycli

9、nAS期期cyclinEG1/SCDK3？G1/S?CDK4/6cyclinD1,D2,D3G1期期第第20页页/共共65页页第19页/共65页三、泛素与APC泛素（ubiquitin)组成和分布：由76个氨基酸组成，高度保守，普遍存在于真核细胞，故名泛素；作用：共价结合泛素的蛋白质能被蛋白酶体识别和降解，这是细胞内短寿命蛋白和一些异常蛋白降解的普遍途径。第第21页页/共共65页页第20页/共65页把泛素加到周期蛋白或其他蛋白需要3个酶:泛素激活酶(E1):泛素-COS-Cys-E1(活化)泛素结合酶(E2):泛素-COS-Cys-E2(转硫酯）泛素连接酶(E3):泛素-CONH-Lys-底物

10、蛋白(标记)泛素与被选择降解的蛋白质形成共价连接，使后者标记并被激活，称为泛素化。蛋白酶体可迅速将泛素化的底物蛋白降解后期促进复合体（anaphase promoting complex，APC）就是一种E3,可将泛素连到M期周期蛋白上作用机制：作用机制：第第22页页/共共65页页第21页/共65页分裂期周期蛋白B的N端有一段序列与其降解有关，称破坏作用盒(destruction box)；APC使E2-泛素复合体找到破坏作用盒，并将泛素转移到位于盒C端的Lys残基；泛素化-多泛素化 共价结合一串泛素的过程，称为多泛素化(polyubiquitination)。周期蛋白B被蛋白酶体识别而降解周

11、期蛋白B(cyclin B)如何降解？第第23页页/共共65页页第22页/共65页细胞周期蛋白的破坏作用盒与降解途径细胞周期蛋白的破坏作用盒与降解途径第第24页页/共共65页页第23页/共65页其他蛋白的降解G1期周期蛋白也通过类似的途径降解，但其N端没有破环作用盒，C端有一段PEST序列与其降解有关。PEST序列：指富含脯氨酸（P)、谷氨酸（E)、天冬氨酸、丝氨酸（S)和苏氨酸（T)的残基序列缺氧诱导因子-1(Hypoxia inducible factor 1 ，HIF-1)第第25页页/共共65页页第24页/共65页ExpressionandactivationofHIF-1arereg

12、ulatedbytheoxygenconcentration*Undernormoxicconditions:hydroxylationinteractionwithvonHippel-Lindau(pVHL)pVHLisanimportantcomponentoftheE3ubiquitinligasecomplex.ubiquitinizationanddegradation*Underhypoxicconditions:InhibitionofhydroxylationSuppressionofdegradationaccumulationHypoxiainduciblefactor1(

13、HIF-1)第第26页页/共共65页页第25页/共65页四、生长因子(growthfactor)生长因子是一大类与细胞增殖有关的信号物质，目前发现的生长因子多达几十种；多数有促进细胞增殖的功能，故又称有丝分裂原（mitogen），如表皮生长因子（EGF）、神经生长因子（NGF）等；少数具有抑制作用（或称生长抑制因子）如抑素(chalone)、肿瘤坏死因子（TNF）、c-mos原癌基因产物、p39mos(Mos)。第第27页页/共共65页页第26页/共65页生长因子的作用机理 第第28页页/共共65页页第27页/共65页五、周期蛋白-激酶抑制因子（CDK-kinaseinhibitor，CKI）

14、CKI对细胞周期起负调控作用CKI分为两大家族：INK4(Inhibitorofkinase4)家族CIP/KIP家族CIP:CDKinhibitoryproteinKIP:Kinaseinhibitoryprotein第第29页页/共共65页页第28页/共65页一、INK4 家族的CKI包括：P16(INK4a)、P15(INK4b)、P18(INK4c)、P19(INK4d)共同结构：4个锚（ankyrin）重复序列CDK：识别CDK 4、6，不识别CDK 2功能：通过与cyclin D竞争结合CDK 4而引起细胞周期在G1期停滞第第30页页/共共65页页第29页/共65页一、INK4 家

15、族的CKI（一）P16功能：结合CDK4和CDK6，抑制CDK-cyclin D复合体的催化活性使细胞周期在G1期停滞意义：P16的严格调节对维持细胞的正常生长是必需的 常在肿瘤和癌细胞中缺失或灭活（甲基化）第第31页页/共共65页页第30页/共65页一、INK4 家族的CKI（二）P15诱导剂：转化生长因子（TGF-）意义：甲基化使P15启动子沉默在血液恶性病变中起重要作用P15的异常甲基化对估计预后具有意义P15和和P16都具有抑制端粒酶活性和抑都具有抑制端粒酶活性和抑制细胞生长的作用（具有肿瘤抑制作用）制细胞生长的作用（具有肿瘤抑制作用）第第32页页/共共65页页第31页/共65页二、C

16、IP/KIP家族的CKI包括:：P21(CIP1/WAF1/SDI)、P27(KIP1)、P57(kip2）等共同结构：N端CDK抑制性功能域功能：抑制CDK2-细胞周期蛋白A和CDK2-细胞周期蛋白E的激酶活性。过多表达引起G1期细胞周期蛋白停滞。P21和P27是CDK4的激活因子。第第33页页/共共65页页第32页/共65页（一）P21结构特点：启动子上有P53结合位点功能：DNA损伤时G1期停滞的关键性决定因素在G2/M转折中起作用参与细胞的终末分化和衰老与DNA聚合酶的辅助因子PCNA结合，直接抑制DNA的合成。表达调节：P53的转录激活调节P53-非依赖的调节：P202、STAT信号

17、通路、癌基因产物的负性调节（c-Myc、Set、Her2）第第34页页/共共65页页第33页/共65页第第35页页/共共65页页第34页/共65页（二）P27表达调节：上调信号：phosphataseandtensionhomolog(PTEN)Forkhead转录因子(Afx、Fkhr、Fkhr-L1）下调信号：CpG岛过度甲基化癌蛋白（c-Myc、Her2)（三）P57在Beckwith-Wiedeman综合征（BWS)中丢失受IGF-II的负调节第第36页页/共共65页页第35页/共65页三、新的CKI-14-3-314-3-3家族的成员之一与细胞分裂周期(cell division c

18、ycle，CDC)有关的基因CDC2、CDK2和CDK4相互作用抑制CDK活性阻断细胞周期进展第第37页页/共共65页页第36页/共65页Cell cycle主要直接依赖于一系列异二聚体蛋白激酶复合体的调节；蛋白激酶复合体的活性依赖于各种cyclins的合成与降解；Cyclins的合成受各种生长因子影响；Cyclins的降解与泛素降解途径有关；蛋白激酶复合体的活性还受CKI抑制。小结第第38页页/共共65页页第37页/共65页第三节细胞周期的运行细胞周期的运行第第39页页/共共65页页第38页/共65页细胞周期和其他的一些细胞生理过程就像多米诺骨牌 第第40页页/共共65页页第39页/共65页

19、细胞在生长因子的刺激下，G1期cyclin D表达；并与CDK4、CDK6结合而活化激酶；G1-CDK使下游的蛋白质如Rb磷酸化，磷酸化的Rb释放出转录因子E2F；促进许多基因的转录，如编码cyclinE、A和CDK12的基因。在G1-S期，cyclinE与CDK2结合，促进细胞通过G1/S限制点而进入S期。一、细胞周期的启动（一、细胞周期的启动（G0G1）第第41页页/共共65页页第40页/共65页生长因子促进细胞进入细胞周期 第第42页页/共共65页页第41页/共65页Cyclin D与CDK结合使Rb释放结合的转录因子E2F 第第43页页/共共65页页第42页/共65页二、DNA复制（G

20、1S）在G1-S期，cyclinE与CDK2结合，促进细胞通过G1/S限制点而进入S期。DNA的复制是由复制起始点（origins of replication）开始的;复制起始点也就是自主复制序列，散布在染色体上;在整个细胞周期中，复制起始点上结合有起始识别复合体（Origin recognition complex,ORC）;第第44页页/共共65页页第43页/共65页CDC6是一个调节因子，在G1期CDC6含量瞬间提高;细胞分裂周期(cell division cycle，CDC)基因CDC6结合在ORC上，在ATP供能下，促进6个亚单位构成的小染色体维持蛋白（mini-chromati

21、n maintenance protein,MCM）复合体和其他一些蛋白结合到ORC上，形成前复制复合体（pre-RC）;-MCM实际上就是DNA解螺旋酶（helicase）第第45页页/共共65页页第44页/共65页起始识别复合体起始识别复合体起始复制点起始复制点第第46页页/共共65页页第45页/共65页S-CDK触发pre-RC的启动，同时阻止了DNA再次进行复制;因为S-CDK将CDC6磷酸化，使其脱离ORC;磷酸化的CDC6随后被SCF(skpi-cullin-F-box protein)参与的泛素化途径降解；(SCF复合体将泛素连接到G1/S期cyclin)S-CDK还可以将某些M

22、CM磷酸化，使其被输出细胞核;其它一些CDK也参与阻止pre-RC的再次形成，从而保证了DNA仅复制一次。第第47页页/共共65页页第46页/共65页每每条条染染色色体体在在一一个个细细胞胞周周期期仅仅复复制制一一次次第第48页页/共共65页页第47页/共65页三、进入M期(G2-M)在G2-M期，cyclinA、cyclinB与CDK1结合，形成 M-CDK；M期CDK的激活起始于分裂期cyclin的积累，在胚胎细胞周期中cyclin一直在合成，其浓度决定于降解的速度；但在大多数细胞的有丝分裂周期中，cyclin的积累是因为在G2-M期M-cyclin基因转录的增强;第第49页页/共共65页

23、页第48页/共65页随着M-cyclin的积累，结合周期蛋白的M-CDK（CDK1）增加，但是没有活性;-因为抑制因子Wee1激酶将CDK1的Thr14和Tyr15磷酸化#52 -这种机制保证了CDK-cyclin能够不断积累，然后在需要的时候突然释放。#53.第第50页页/共共65页页第49页/共65页CDK1的激活需要Thr14和Tyr15去磷酸化和Thr 161的磷酸化，它是在CDK激酶(CDK activating kinase,CAK)的作用下完成的 第第51页页/共共65页页第50页/共65页在M期，一方面Wee1的活性下降;另一方面CDC25使CDK去磷酸化，去除了CDK活化的障

24、碍;CDC25可被两种激酶激活，一是polo激酶，另一个是M-CDK本身;激活的M-CDK还可以抑制它的抑制因子Wee1的活性，形成一个正反馈循环;只要有少量的CDK1被CDC25或polo激酶激活，立即就会有大量的CDK被活化。第第52页页/共共65页页第51页/共65页在中期当成熟促进因子(maturationpromotingfactor,MPF)或称为有丝分裂和减数分裂促进因子（mitosisandmeiosispromotingfactor,MPF)活性达到最高时，激活APC;APC将泛素连接在cyclinB上，导致cyclinB被蛋白酶体（proteasome）降解;完成一个细胞周

25、期。第第53页页/共共65页页第52页/共65页Cyclin B的降解途径 第第54页页/共共65页页第53页/共65页第四节第四节细胞周期检验点与周期阻滞细胞周期检验点与周期阻滞第第55页页/共共65页页第54页/共65页细胞要分裂，必须正确复制DNA和达到一定的体积，在获得足够物质支持分裂以前，细胞不可能进行分裂;细胞周期的运行，是在一系列称为细胞周期检验点（check point）的严格监控下进行的;检验点的作用：当DNA受到损伤时,复制不完全或纺锤体形成不正常，周期将被阻断。检验点的组成：由感受异常事件的感受器、信号传导通路和效应器构成。第第56页页/共共65页页第55页/共65页主要

26、检验点有：G0/G1检验点:控制从静止状态的G0期进入G1期G1/S检验点:在哺乳动物中称限制点(restriction point)或简称 R点，控制细胞由G1进入DNA合成期。#17 细胞可能的3种命运：继续增殖、暂不增殖、不增殖而分化S期检验点：DNA复制是否完成？G2/M检验点：是决定细胞一分为二的控制点。相关的事件包括：DNA损伤？细胞体积足够大？中-后期检验点（纺锤体组装检验点）：任何一个着丝点没有正确连接到纺锤体上，都会引起细胞周期中断。第第57页页/共共65页页第56页/共65页主要的检验点 第第58页页/共共65页页第57页/共65页第五节第五节细胞周期与癌症细胞周期与癌症第

27、第59页页/共共65页页第58页/共65页促细胞周期进展促细胞周期进展细胞增殖、分裂细胞增殖、分裂CDK-Cyclin有激酶活性有激酶活性+CyclinCDK无激酶无激酶活性活性CKICDK-CKICyclin无激酶活性无激酶活性第第60页页/共共65页页第59页/共65页Rb、E2F与肿瘤在哺乳动物细胞中，G1期受正性和负性调节信号的严格控制；Rb通过细胞周期依赖性的磷酸化/去磷酸化监控这些信号，决定细胞是否通过G1期检验点、是否进行分裂；Rb对细胞周期的调控是通过转录因子E2F来实现的；至少有1/3的人类肿瘤存在Rb基因缺失或突变。第第61页页/共共65页页第60页/共65页CDK4-Cy

28、clinD2(有有Kinase活性活性)Rb-E2FATPADP促转录促转录(如如myc,DNA聚合酶聚合酶)Rb-P+E2FRb调节细胞周期调节细胞周期细胞增殖细胞增殖第第62页页/共共65页页第61页/共65页DNADamageP21?GADD45BAXKinases(DNA-PK)DNARepairp53p53PP53与肿瘤与肿瘤CyclinD/CDK4Bcl-2 Apoptosis G1/SblockG2/MblockCell Cycle Arrest第第63页页/共共65页页第62页/共65页14-3-3与肿瘤14-3-3受P53诱导，参与DNA损伤的调节，在P53非依赖的调节机制中可能起作用功能丧失促进恶性转化P27与肿瘤表达下降与癌症的发生和低存活有关，是癌症进展的标志表达下降可能与泛素介导的降解增加有关受c-Myc的调节第第64页页/共共65页页第63页/共65页第第65页页/共共65页页第64页/共65页感谢您的观看！第65页/共65页