dnaran琼脂糖凝胶电泳.pptx

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1、核酸核酸DNARNAGenomic DNA(原核、真核、病毒原核、真核、病毒)细胞器细胞器DNA(叶绿体、线粒体等叶绿体、线粒体等)质粒质粒DNA(细菌、放线菌等细菌、放线菌等)mRNA (1%-5%)rRNA (80%-85%)tRNA(小分子RNA)(15%-20%)核 酸(nucleic acid)核酸的提取是分子生物学实验技术中最重要、最基本的操作。第1页/共47页核酸的理化性质核酸的理化性质理化性质理化性质 DNADNA化学性质稳定，物理上易碎，粘度大化学性质稳定，物理上易碎，粘度大 RNARNA化学性质比化学性质比DNADNA活泼，易受活泼，易受RNARNA酶的污染酶的污染溶解性

2、均溶于水 不溶于一般有机溶剂,在70%乙醇中形成沉淀 第2页/共47页核酸分离、纯化原则核酸分离、纯化原则 1、保持核酸分子一级结构的完整性 温度不要太高 控制pH值范围(pH值5-9)保持一定离子强度 减少物理因素对核酸的机械剪切力第3页/共47页核酸分离、纯化原则核酸分离、纯化原则核酸酶能消化核酸链中的磷酸二酯键，破坏核酸一级结构。所用器械和一些试剂需高温灭菌提取缓冲液中需加核酸酶抑制剂2 2、防止核酸的生物降解、防止核酸的生物降解第4页/共47页DNADNA酶抑制剂酶抑制剂金属离子螯合剂：DNA酶需要金属二价离子Mg2+、Ca2+的激活，常用EDTA(乙二胺四乙酸)离子螯合剂，可抑制DN

3、A酶活性。阴离于型表面活性剂 SDS除对核酸酶有抑制作用外，还能使蛋白质变性，并与变性蛋白结合成带负电荷的复合物，该复合物有核酸酶抑制剂作用。第5页/共47页RNARNA酶（酶（RNAase)RNAase)抑制剂抑制剂DEPC(二乙基焦碳酸盐)粘性液体，很强的核酸酶抑制剂。与蛋白质中His 结 合使蛋白变性。使用注意：1.DEPC也能破坏单链核酸中大部分腺嘌呤环。2.容易降解，保存在4 或液氮中；3.剧毒。第6页/共47页 1：手指头 2：枪头 3：水/缓冲液 4：实验台面 5：内源 Rnase 6：RNA 样品 7：质粒抽提 8：RNA 保存 9：阳离子(Ca,Mg)10：后续实验所用的酶

4、Rnase 污染的10大来源第7页/共47页DNA提取的基本步骤I.材料准备II.裂解III.分离、纯化IV.沉淀或吸附核酸V.溶解第8页/共47页材料准备使用新鲜材料，样品材料不要反复冻融提取血液基因组DNA时，要选择有核细胞（白细胞）含病毒的液体材料DNA含量较少，提取前先富集基因组DNA的提取第9页/共47页细胞裂解细胞裂解 裂解液经典的裂解液几乎都含有去污剂和盐，可以抑制样品中的核酸酶含蛋白酶的裂解方法：基因组DNA高浓度蛋白变性剂的裂解方法：RNA含CTAB的裂解法：富含多糖的样品的基因组 DNA含SDS碱裂解法：质粒DNA第10页/共47页核酸分离、纯化核酸分离、纯化蛋白质的去除：

5、酚/氯仿抽提使用变性剂变性（SDS、异硫氰酸胍等）高盐洗涤 核酸-蛋白质加入NaCl后，破坏静电吸力，使氢键破坏，核蛋白解聚；蛋白酶处理第11页/共47页核酸分离、纯化核酸分离、纯化 多糖的去除：高盐法：用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入1/2体积的5M NaCl，高盐可溶解多糖。用多糖水解酶将多糖降解。在提取缓冲液中加一定量的氯苯，氯苯可以与多糖的羟基作用，从而去除多糖。第12页/共47页核酸沉淀、溶解核酸沉淀、溶解重新调整核酸的浓度；去除溶液中某些盐离子与杂质。第13页/共47页乙醇 优点：对盐类沉淀少，沉淀中所含乙醇易挥发除去，不影响以后实验。缺点：需要量大，一般要求低温操作。异丙醇 优点

6、：需体积小，速度快，适于浓度低、体积大的DNA样品沉淀。一般不需低温。缺点：易使盐类、蔗糖与DNA共沉淀异丙醇难以挥发除去。所以，最后用70乙醇漂洗。有机沉淀剂有机沉淀剂第14页/共47页核酸的保存(1)(1)对对DNADNA DNA DNA样品溶于样品溶于pH8.0pH8.0的的TETE，4 4 或或-20-20 保存；保存；长期保存样品中可加入长期保存样品中可加入1 1滴氯仿。滴氯仿。(2)(2)对对RNA RNA RNA RNA样品溶于样品溶于0.3 mol/L NaAc(pH5.2)0.3 mol/L NaAc(pH5.2)或双蒸灭菌水中，或双蒸灭菌水中，-70-70 保存保存;长期保

7、存可以沉淀形式贮于乙醇中长期保存可以沉淀形式贮于乙醇中;第15页/共47页DNADNA提取的常用方法提取的常用方法q基因组基因组DNADNA的提取的提取 SDS法其它第16页/共47页q原理原理基因组基因组DNADNASDSSDS法法SDS在高温（5565）条件下能裂解细胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸；上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。第17页/共47页 组份组份 Tris-HCl（pH8.0）EDTA（pH8.0）NaCl SDS 终浓度终浓度 100mM 20 mM1.4M2%(W/V)SDS提取缓冲液的配方Tris-HCl（pH8.0）提供一个缓

8、冲环境，防止提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；核酸被破坏；EDTA螯合螯合Mg2+或或Mn2+离子，抑制离子，抑制DNase活活性；性；NaCl 提供一个高盐环境，使提供一个高盐环境，使DNA充分溶解，充分溶解，存在于液相中；存在于液相中；SDS 裂解细胞，使蛋白变性，染色体离析；裂解细胞，使蛋白变性，染色体离析；第18页/共47页吸附材料结合法：吸附材料结合法：q根据核酸分离纯化方式的不同有：高盐低pH值结合核酸，低盐高pH值洗脱。快捷高效。低盐高pH值结合核酸，高盐低pH值洗脱。适用于纯度要求高的实验。磁性微粒挂上不同基团可吸附不同的目的物，从而达到分离目的。其他方法其他方法硅质材料阴离子

9、交换树脂磁珠低盐高pH值结合核酸，高盐低pH值洗脱。适用于纯度要求高的实验。阴离子交换树脂磁珠低盐高pH值结合核酸，高盐低pH值洗脱。适用于纯度要求高的实验。阴离子交换树脂磁性微粒挂上不同基团可吸附不同的目的物，从而达到分离目的。磁珠低盐高pH值结合核酸，高盐低pH值洗脱。适用于纯度要求高的实验。阴离子交换树脂磁珠硅质材料高盐低pH值结合核酸，低盐高pH值洗脱。快捷高效。硅质材料低盐高pH值结合核酸，高盐低pH值洗脱。适用于纯度要求高的实验。阴离子交换树脂高盐低pH值结合核酸，低盐高pH值洗脱。快捷高效。硅质材料阴离子交换树脂低盐高pH值结合核酸，高盐低pH值洗脱。适用于纯度要求高的实验。阴离

10、子交换树脂阴离子交换树脂低盐高pH值结合核酸，高盐低pH值洗脱。适用于纯度要求高的实验。阴离子交换树脂磁珠磁性微粒挂上不同基团可吸附不同的目的物，从而达到分离目的。磁珠第19页/共47页Trizol是直接从细胞或组织中提取总RNA 的试剂，内含异硫氰酸胍，酚等物质，异硫氰酸胍能迅速溶解蛋白质，导致细胞结构破碎。核酸由于核蛋白二级结构的破坏而解离下来。异硫氰酸胍同时抑制细胞释放出的核酸酶，保持RNA 的完整性。TRIZOL法提RNA 第20页/共47页第21页/共47页 目前有不少商业化的核酸抽目前有不少商业化的核酸抽提试剂盒可供选用，具体操作步提试剂盒可供选用，具体操作步骤参考各种产品说明书。

11、骤参考各种产品说明书。第22页/共47页问题一：DNA降解1.1.材料不新鲜、反材料不新鲜、反复冻融或细胞衰复冻融或细胞衰老老2.2.提取操作过于剧提取操作过于剧烈，烈，DNADNA被打被打断断3.3.外源核酸酶污染外源核酸酶污染1.1.低温保存，避免反复冻融低温保存，避免反复冻融2.2.液氮研磨或匀浆组织，应在解冻前液氮研磨或匀浆组织，应在解冻前加入裂解缓冲液加入裂解缓冲液3.3.增加裂解液中螯合剂的含量增加裂解液中螯合剂的含量4.4.细胞裂解后操作应尽量轻柔细胞裂解后操作应尽量轻柔5.5.试剂用无菌水配制，耗材经高温灭试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌菌6.6.DNADNA分装保存于缓冲液，

12、避免反复分装保存于缓冲液，避免反复冻融冻融核酸提取常见的问题核酸提取常见的问题第23页/共47页问题二：DNA样品不纯 1.1.DNADNA中含有蛋白、中含有蛋白、多糖、多酚类杂质多糖、多酚类杂质2.2.DNADNA在溶解前，有在溶解前，有酒精残留，酒精抑酒精残留，酒精抑制后续酶解反应制后续酶解反应3.3.DNADNA中残留有金属中残留有金属离子离子1.1.重新纯化重新纯化DNADNA，去除蛋白、，去除蛋白、多糖、多酚等杂质多糖、多酚等杂质2.2.重新沉淀重新沉淀DNADNA，让酒精充，让酒精充分挥发分挥发3.3.增加增加7070乙醇洗涤的次数乙醇洗涤的次数（2-32-3次）次）第24页/共4

13、7页1.1.实验材料不佳或量少实验材料不佳或量少2.2.破壁或裂解不充分破壁或裂解不充分3.3.沉淀不完全沉淀不完全4.4.洗涤时洗涤时DNADNA丢失丢失1.1.尽量选用新鲜（幼嫩）的材料尽量选用新鲜（幼嫩）的材料2.2.动植物要匀浆研磨充分，裂解时间适当动植物要匀浆研磨充分，裂解时间适当延长（对于动物细胞、细菌可增加延长（对于动物细胞、细菌可增加PKPK的的用量）用量）3.3.低温沉淀，延长沉淀时间低温沉淀，延长沉淀时间4.4.加辅助物，促进沉淀加辅助物，促进沉淀5.5.洗涤时，最好用枪头将洗涤液吸出，勿洗涤时，最好用枪头将洗涤液吸出，勿倾倒倾倒问题三：DNA提取量少第25页/共47页RN

14、A提取常见问题一：样品不纯 1.1.蛋白蛋白2.2.多糖多酚多糖多酚3.3.DNADNA4.4.离子离子1.1.保证彻底的裂解和一定转数一定时间的保证彻底的裂解和一定转数一定时间的离心离心2.2.增加有机溶剂抽提的次数，用吸附柱纯增加有机溶剂抽提的次数，用吸附柱纯化化3.3.加入不含加入不含RNaseRNase的的DNaseDNase处理处理4.4.增加洗涤次数增加洗涤次数第26页/共47页RNA提取常见问题二：得率低 1.1.样品太多或太少样品太多或太少2.2.RNARNA在柱子上未洗出在柱子上未洗出3.3.洗出液中有酒精洗出液中有酒精1.1.减少或增加样品使用量减少或增加样品使用量2.2.

15、加入加入RNaseFree,RNaseFree,放置几分钟再离心放置几分钟再离心3.3.漂洗后再次离心漂洗后再次离心第27页/共47页RNA提取常见问题三：降解 1.1.样品不新鲜或保存样品不新鲜或保存不当不当2.2.RNaseRNase污染污染3.3.RNARNA溶液储存不当溶液储存不当1.1.取新鲜的样品；取样后立即放取新鲜的样品；取样后立即放入液氮或储存液保存入液氮或储存液保存2.2.研磨样品及时补充液氮研磨样品及时补充液氮3.3.严格处理相应的器具和试剂严格处理相应的器具和试剂4.4.-70-70 冻存，分装使用冻存，分装使用第28页/共47页 为了检测提取核酸的浓度和内参，需要继续做

16、琼脂糖凝胶电泳实验第29页/共47页实验原理（1）DNADNA分子在碱性缓冲液中带负电荷，在外加分子在碱性缓冲液中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。电场作用下向正极泳动。分子质量越小跑得越快，分子质量越小跑得越快，紧密构型快于松散型开环分子或线性分子，从而紧密构型快于松散型开环分子或线性分子，从而可以分离大小不同的可以分离大小不同的DNA或或RNA分子。分子。（2 2）琼脂糖是一种）琼脂糖是一种线性多糖聚合物线性多糖聚合物，可以形成具有，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强浓度越高，孔隙

17、越小，其分辨能力就越强。琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳第30页/共47页琼脂糖凝胶缓冲液第31页/共47页（1）制备凝胶和胶板：100ml(1TBE)+1g琼脂糖（三角瓶），煮胶，溶解，冷却至60(不烫手)，加EB替代物，倒板(4-6mm)，室温下充分凝固，竖直拔下梳子。第32页/共47页（2）加样：5l质粒DNA+1l loading buffer，混匀 5lPCR产物+1l loading buffer，混匀（3）电泳：电压80-120V，注意电极 方向 15min（4）观察：紫外透射分析仪下观察。第33页/共47页第34页/共47页电泳常见问题分析DNA降解：避免核酸酶污染。降解：避免核酸

18、酶污染。电泳缓冲液陈旧：电泳缓冲液多次用后，离子强度降低，电泳缓冲液陈旧：电泳缓冲液多次用后，离子强度降低，pH值上升，缓冲能力减弱，从而影响电泳效果。建值上升，缓冲能力减弱，从而影响电泳效果。建议经常更换电泳缓冲液。议经常更换电泳缓冲液。DNA变性：电泳前勿加热，可以在电泳仪上面放冰袋，变性：电泳前勿加热，可以在电泳仪上面放冰袋，避免温度高变性避免温度高变性第35页/共47页条带浅，Marker弥散了-那要么就是胶的问题，要不就是buffer的问题。化胶的时候一定要化匀，buffer尽量用新鲜的实验室跑一般都是120V,最多跑到150V第36页/共47页DNA电泳常见问题分析问题问题原因原因解决办法解决办法DNADNA带缺失带缺失1)小DNA带走出凝胶缩短电泳时间，降低电压，增强凝胶浓度2)分子大小相近的DNA带不易分辨增加电泳时间，核准正确的凝胶浓度3)DNA变性电泳前请勿高温加热DNA链，以20mM NaCl Buffer稀释DNA4)DNA链巨大，常规凝胶电泳不合适 在脉冲凝胶电泳上分析第37页/共47页第38页/共47页第39页/共47页第40页/共47页第41页/共47页第42页/共47页第43页/共47页第44页/共47页第45页/共47页第46页/共47页感谢您的欣赏！第47页/共47页