研究生PCR聚合酶链反应.pptx

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1、PCR的用途的用途体外扩增特异体外扩增特异体外扩增特异体外扩增特异DNADNA片段片段片段片段的技术，能的技术，能的技术，能的技术，能快速快速快速快速、特异特异特异特异地扩增目的地扩增目的地扩增目的地扩增目的DNADNA片段。片段。片段。片段。pp能通过试管内的数小时反应将特定的能通过试管内的数小时反应将特定的能通过试管内的数小时反应将特定的能通过试管内的数小时反应将特定的DNA DNA 片段扩增数百万倍。片段扩增数百万倍。片段扩增数百万倍。片段扩增数百万倍。pp迅速获取大量的单一核酸片段，为分子生迅速获取大量的单一核酸片段，为分子生迅速获取大量的单一核酸片段，为分子生迅速获取大量的单一核酸片

2、段，为分子生 物学研究提供了强大的工具。物学研究提供了强大的工具。物学研究提供了强大的工具。物学研究提供了强大的工具。第1页/共82页19531953年，年，年，年，WatsonWatson和和和和CrickCrick提出提出提出提出DNADNA双螺旋结构及双螺旋结构及双螺旋结构及双螺旋结构及半保留复制半保留复制半保留复制半保留复制模型。模型。模型。模型。19581958年，年，年，年，MeselsonMeselson和和和和StahlStahl用实验证实用实验证实用实验证实用实验证实DNADNA半保留复制模型。半保留复制模型。半保留复制模型。半保留复制模型。7070年年年年代代代代以以以以来

3、来来来，人人人人们们们们采采采采用用用用两两两两种种种种思思思思路路路路去去去去尝尝尝尝试试试试建建建建立立立立基基基基因因因因的的的的无无无无性性性性繁繁繁繁殖殖殖殖体体体体系系系系，一一一一是是是是基基基基因因因因克隆克隆克隆克隆技术，二是技术，二是技术，二是技术，二是体外扩增体外扩增体外扩增体外扩增技术。技术。技术。技术。发展历程发展历程第2页/共82页19711971年年年年，KhoranaKhorana（美美美美国国国国MITMIT教教教教授授授授，19681968年年年年诺诺诺诺贝贝贝贝尔尔尔尔医医医医学学学学奖奖奖奖得得得得主主主主）：“经经经经过过过过DNADNA变变变变性性性

4、性，与与与与合合合合适适适适引引引引物物物物杂杂杂杂交交交交，用用用用DNADNA聚聚聚聚合合合合酶酶酶酶延延延延伸伸伸伸引引引引物物物物，并并并并不不不不断断断断重重重重复复复复该该该该过过过过程程程程便便便便可可可可克克克克隆隆隆隆tRNAtRNA基因。基因。基因。基因。”核酸体外扩增最早设想被遗忘原因核酸体外扩增最早设想被遗忘原因核酸体外扩增最早设想被遗忘原因核酸体外扩增最早设想被遗忘原因:（1 1）很难进行测序和合成寡核苷酸引物；）很难进行测序和合成寡核苷酸引物；）很难进行测序和合成寡核苷酸引物；）很难进行测序和合成寡核苷酸引物；（2 2）19701970年年年年SmithSmith等

5、发现了等发现了等发现了等发现了IIII型限制性内切酶，体外克隆基因已成为可能。型限制性内切酶，体外克隆基因已成为可能。型限制性内切酶，体外克隆基因已成为可能。型限制性内切酶，体外克隆基因已成为可能。第3页/共82页19761976年年年年，台台台台籍籍籍籍科科科科学学学学家家家家钱钱钱钱嘉嘉嘉嘉韵韵韵韵（Alice Alice ChienChien）从从从从黄黄黄黄石石石石国国国国家家家家公公公公园园园园的的的的嗜嗜嗜嗜热热热热菌菌菌菌Thermus Thermus aquaticusaquaticus中分离出热稳定的中分离出热稳定的中分离出热稳定的中分离出热稳定的Taq DNATaq DNA

6、聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶。19851985年年年年，美美美美国国国国CetusCetus公公公公司司司司人人人人类类类类遗遗遗遗传传传传研研研研究究究究室室室室的的的的MullisMullis发发发发明明明明聚聚聚聚合合合合酶酶酶酶链链链链反反反反应应应应（Polymerase Polymerase Chain Chain ReactionReaction，PCRPCR），SaikiSaiki等等等等首首首首次次次次应应应应用用用用PCRPCR法法法法成成成成功功功功地地地地扩扩扩扩增增增增了了了了人人人人 -珠珠珠珠蛋蛋蛋蛋白白白白的的的的DNADNA，并应用于镰刀状红细胞贫血的产前诊断。，

7、并应用于镰刀状红细胞贫血的产前诊断。，并应用于镰刀状红细胞贫血的产前诊断。，并应用于镰刀状红细胞贫血的产前诊断。第4页/共82页19881988年年年年SaikiSaiki开开开开始始始始将将将将耐耐耐耐热热热热性性性性Taq Taq DNADNA聚聚聚聚合合合合酶酶酶酶应应应应用用用用于于于于PCRPCR，整整整整个个个个反反反反应应应应只只只只加加加加一一一一次次次次酶酶酶酶即可，扩增特异性和效率都明显改善，操作大为简化。即可，扩增特异性和效率都明显改善，操作大为简化。即可，扩增特异性和效率都明显改善，操作大为简化。即可，扩增特异性和效率都明显改善，操作大为简化。19891989年被誉为年

8、被誉为年被誉为年被誉为“分子年分子年分子年分子年”，列，列，列，列PCRPCR为十余项发明之首。为十余项发明之首。为十余项发明之首。为十余项发明之首。19931993年，年，年，年，MullisMullis荣获诺贝尔化学奖。荣获诺贝尔化学奖。荣获诺贝尔化学奖。荣获诺贝尔化学奖。第5页/共82页PCR的基本原理的基本原理试管中进行的试管中进行的试管中进行的试管中进行的DNADNA复制反应，依据复制反应，依据复制反应，依据复制反应，依据DNADNA半保留复制半保留复制半保留复制半保留复制的机理；的机理；的机理；的机理；体外体外体外体外DNADNA分子于不同温度下可分子于不同温度下可分子于不同温度下

9、可分子于不同温度下可变性和复性变性和复性变性和复性变性和复性的性质；的性质；的性质；的性质；通过人为控制体外合成系统的温度，使通过人为控制体外合成系统的温度，使通过人为控制体外合成系统的温度，使通过人为控制体外合成系统的温度，使双链双链双链双链DNADNA变成单链变成单链变成单链变成单链，单链单链单链单链DNADNA与人工合成的与人工合成的与人工合成的与人工合成的引物退火引物退火引物退火引物退火，DNADNA聚合酶使聚合酶使聚合酶使聚合酶使引物沿着单链模板延伸为双链引物沿着单链模板延伸为双链引物沿着单链模板延伸为双链引物沿着单链模板延伸为双链DNADNA。第6页/共82页待扩增片段待扩增片段待

10、扩增片段待扩增片段第7页/共82页第8页/共82页高温变性高温变性第9页/共82页低温退火低温退火第10页/共82页中温延伸中温延伸第11页/共82页第12页/共82页第13页/共82页第14页/共82页第15页/共82页第16页/共82页第17页/共82页第18页/共82页第19页/共82页第20页/共82页uuPCRPCR每每每每一一一一步步步步的的的的转转转转换换换换通通通通过过过过温温温温度度度度的的的的改改改改变变变变控控控控制制制制。DNADNA模模模模板板板板解解解解链链链链（变变变变性性性性）、引引引引物物物物与与与与模模模模板板板板结结结结合合合合（退退退退火火火火）、DNA

11、DNA聚聚聚聚合合合合酶酶酶酶催催催催化化化化新新新新生生生生DNADNA的的的的合合合合成成成成（延延延延伸伸伸伸）三三三三个个个个步步步步骤骤骤骤构构构构成成成成PCRPCR反应的一个循环。反应的一个循环。反应的一个循环。反应的一个循环。uu此循环反复进行，可使目的此循环反复进行，可使目的此循环反复进行，可使目的此循环反复进行，可使目的DNADNA得以迅速扩增。得以迅速扩增。得以迅速扩增。得以迅速扩增。第21页/共82页uu理论扩增率：理论扩增率：理论扩增率：理论扩增率：2 2n n递增递增递增递增（n n为循环次数），为循环次数），为循环次数），为循环次数），25253030循环，目标循

12、环，目标循环，目标循环，目标DNADNA可增加可增加可增加可增加10109 9倍。倍。倍。倍。uu实际扩增率：实际扩增率：实际扩增率：实际扩增率：()n n，X X为为为为PCRPCR的实际扩增率，的实际扩增率，的实际扩增率，的实际扩增率，平均约为平均约为平均约为平均约为75%75%。uu由由由由于于于于引引引引物物物物和和和和底底底底物物物物的的的的消消消消耗耗耗耗，酶酶酶酶活活活活力力力力的的的的下下下下降降降降等等等等因因因因素素素素，扩扩扩扩增增增增产产产产物物物物的的的的增增增增加加加加，逐逐逐逐渐渐渐渐由由由由指指指指数数数数形形形形式式式式变变变变为为为为线线线线性性性性形形形形

13、式式式式，所所所所以以以以实实实实际际际际上上上上进进进进行行行行3030个个个个循循循循环环环环后后后后，扩扩扩扩增增增增倍倍倍倍数数数数一一一一般般般般可可可可达达达达10106 610107 7。uu以上以上以上以上“变性、退火、延伸变性、退火、延伸变性、退火、延伸变性、退火、延伸”三部曲为三部曲为三部曲为三部曲为PCRPCR一轮循环。一轮循环。一轮循环。一轮循环。第22页/共82页PCRPCR扩增曲线扩增曲线扩增曲线扩增曲线第23页/共82页PCR 反应体系与流程反应体系与流程反应体系反应体系反应体系反应体系模板模板模板模板（DNADNA或或或或RNARNA）引物引物引物引物Taq D

14、NATaq DNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶10PCR10PCR缓冲液缓冲液缓冲液缓冲液1.51.54 4 mM mM MgMg2+2+0.20.2 mMmM dNTPdNTP反应流程反应流程反应流程反应流程预变性预变性预变性预变性变性变性变性变性退火退火退火退火延伸延伸延伸延伸延伸完全延伸完全延伸完全延伸完全终止终止终止终止25253535循环循环循环循环第24页/共82页一、PCR 的反应体系1.引物（primer）2.酶（Taq DNA polymerase）3.dNTP4.模板（template）5.Mg2+（magnesium）第25页/共82页1、引物引物：决定引物：决定PCRPCR

15、反应的特异性反应的特异性PCR PCR 产物的特异性取决于引物与模板产物的特异性取决于引物与模板DNADNA互补的程度互补的程度理论上，只要知道任何一段模板理论上，只要知道任何一段模板DNADNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，用做引物，用 PCRPCR就可将模板就可将模板DNADNA在体外大量扩增在体外大量扩增第26页/共82页u基本原则是最大限度地提高扩增效率和特异性，同时尽可能抑制非特异性扩增。引物设计的原则第27页/共82页引物长度：15-30bp，常用20bp左右 引物的有效长度不能大于 38 bp，否则最适 延伸温度会超过TaqDNA聚合

16、酶的最适温度 （74），不能保证PCR扩增产物的特异性引物扩增跨度：以500bp为宜 特定条件下可扩增长至10kb的片段第28页/共82页引物碱基：引物碱基：引物碱基：引物碱基：G+CG+C含量以含量以含量以含量以40-60%40-60%为宜为宜为宜为宜 G+C G+C太少扩增效果不佳，太少扩增效果不佳，太少扩增效果不佳，太少扩增效果不佳，G+C G+C 过多易出现非过多易出现非过多易出现非过多易出现非特异条带特异条带特异条带特异条带 ATGC ATGC最好随机分布，避免最好随机分布，避免最好随机分布，避免最好随机分布，避免5 5个以上的嘌呤或个以上的嘌呤或个以上的嘌呤或个以上的嘌呤或嘧啶核苷

17、酸的成串排列，尤其嘧啶核苷酸的成串排列，尤其嘧啶核苷酸的成串排列，尤其嘧啶核苷酸的成串排列，尤其33端不应超过端不应超过端不应超过端不应超过3 3 个连续个连续个连续个连续的的的的GG或或或或C C，因为这样会使引物在，因为这样会使引物在，因为这样会使引物在，因为这样会使引物在G+CG+C富集区富集区富集区富集区 引发错引发错引发错引发错误延伸误延伸误延伸误延伸避免引物内部出现二级结构和引物间互补避免引物内部出现二级结构和引物间互补避免引物内部出现二级结构和引物间互补避免引物内部出现二级结构和引物间互补 特别避免特别避免特别避免特别避免 33端的互补，否则会形成引物二聚体，端的互补，否则会形成

18、引物二聚体，端的互补，否则会形成引物二聚体，端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异性的扩增条带产生非特异性的扩增条带产生非特异性的扩增条带产生非特异性的扩增条带 第29页/共82页第30页/共82页引物 3端的碱基要求严格配对（不能做任何修饰）特别是最末及倒数第二个碱基，以避免因末端 碱基不配对而导致PCR失败引物5端可修饰 引物5端限定着PCR产物的长度，但对扩增特 异性影响不大；引物5端碱基可不与模板DNA 互补而呈游离状态；引物5端最多可加10个碱 基而对PCR反应无影响 第31页/共82页3 3 5 5 35 5 限制性内切酶的识别序列限制性内切酶的识别序列限制性内切酶的识别序列限

19、制性内切酶的识别序列启动子序列启动子序列启动子序列启动子序列定点突变定点突变定点突变定点突变探针标记探针标记探针标记探针标记第32页/共82页引物的特异性：引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性引物量：引物量：每条引物的浓度每条引物的浓度0.1 0.50.1 0.5 MM，以最低引物量产生所需要的结果为好，以最低引物量产生所需要的结果为好引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会的机会第33页/共82页实例：设计人类实例：设计人类GAPDH

20、GAPDH基因基因mRNAmRNA的引物的引物1.1.用用Primer PremierPrimer Premier软件设计引物；软件设计引物；2.2.在在UCSC Genome BrowserUCSC Genome Browser上验证（如果失败则重新设计）上验证（如果失败则重新设计）第34页/共82页第35页/共82页第36页/共82页第37页/共82页第38页/共82页第39页/共82页第40页/共82页第41页/共82页第42页/共82页第43页/共82页1.1.我们设计的引物，是根据我们设计的引物，是根据我们设计的引物，是根据我们设计的引物，是根据GAPDHGAPDH的的的的mRNAm

21、RNA序列设计的，理论扩增长度是序列设计的，理论扩增长度是序列设计的，理论扩增长度是序列设计的，理论扩增长度是318bp318bp，但它却在人类基因组上扩增出了，但它却在人类基因组上扩增出了，但它却在人类基因组上扩增出了，但它却在人类基因组上扩增出了两个片段两个片段两个片段两个片段；2.2.第一个片段来自第一个片段来自第一个片段来自第一个片段来自1212号染色体号染色体号染色体号染色体的扩增，长度为的扩增，长度为的扩增，长度为的扩增，长度为2409bp2409bp；第二个片段来自；第二个片段来自；第二个片段来自；第二个片段来自X X染色体染色体染色体染色体的扩增，片段长度是的扩增，片段长度是的

22、扩增，片段长度是的扩增，片段长度是318bp318bp。那么，那个扩增片段才是正确的呢？我们设计的这一对引物可否用于扩增人类那么，那个扩增片段才是正确的呢？我们设计的这一对引物可否用于扩增人类那么，那个扩增片段才是正确的呢？我们设计的这一对引物可否用于扩增人类那么，那个扩增片段才是正确的呢？我们设计的这一对引物可否用于扩增人类GAPDHGAPDH基因片段呢？基因片段呢？基因片段呢？基因片段呢？第44页/共82页第45页/共82页第46页/共82页 1212号染色体扩增出的序列是真正的号染色体扩增出的序列是真正的GAPDHGAPDH基因。基因。在下面的序列比对中，我们可以发现，在下面的序列比对中

23、，我们可以发现，X X染色体上被扩增出的序列实际上是染色体上被扩增出的序列实际上是GAPDHGAPDH的的加工的假基因加工的假基因（processed pseudogeneprocessed pseudogene）。）。因此，如果我们能保证作为模板的因此，如果我们能保证作为模板的cDNAcDNA不混杂有染色体不混杂有染色体DNADNA，就可以用这一，就可以用这一对引物扩增对引物扩增GAPDHGAPDH。第47页/共82页2、酶及其浓度n目前有两种 Taq DNA 聚合酶供应天然酶：从水生嗜热杆菌中提纯基因工程酶：大肠菌合成n一个典型的 PCR反应约需酶量1-2.5U/100 ul体系n浓度过高

24、可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少第48页/共82页DNADNA聚合酶聚合酶l l KlenowKlenow片段片段 l l T4 DNAT4 DNA聚合酶聚合酶 l l TaqTaq DNA DNA聚合酶聚合酶（应用最广）（应用最广）l l 其他其他DNADNA聚合酶：聚合酶：TthTth DNA DNA聚合酶聚合酶 VentVent DNA DNA聚合酶聚合酶 PfuPfu DNA DNA聚合酶聚合酶等等第49页/共82页Taq 酶的保真性不高53聚合酶活性和53外切酶活性，无35外切活性;在PCR反应中如发生某些碱基的错配，该酶是没有校正功能的。保真性不如PfuDNA聚合酶等。

25、第50页/共82页3、dNTP 的质量与浓度在在在在PCRPCR反应中，反应中，反应中，反应中，dNTPdNTP应为应为应为应为5050200200 MM，浓度，浓度，浓度，浓度过低会降低过低会降低过低会降低过低会降低PCRPCR产物的产量产物的产量产物的产量产物的产量注意注意注意注意4 4种种种种dNTPdNTP的浓度要相等（等摩尔配制的浓度要相等（等摩尔配制的浓度要相等（等摩尔配制的浓度要相等（等摩尔配制 ）,如其中任何一种浓度不同于其它几种时（偏如其中任何一种浓度不同于其它几种时（偏如其中任何一种浓度不同于其它几种时（偏如其中任何一种浓度不同于其它几种时（偏高或偏低），就会引起错配高或偏

26、低），就会引起错配高或偏低），就会引起错配高或偏低），就会引起错配高浓度的高浓度的高浓度的高浓度的dNTPdNTP可与可与可与可与MgMg2+2+结合，使游离的结合，使游离的结合，使游离的结合，使游离的MgMg2+2+浓度下降，影响浓度下降，影响浓度下降，影响浓度下降，影响DNADNA聚合酶的活性聚合酶的活性聚合酶的活性聚合酶的活性 第51页/共82页4、模板DNA模板DNA的来源：微生物中提取DNA从细胞中提取DNA：血细胞、绒毛、尿样、毛发、精斑、口腔上皮细胞固定和包埋的组织标本：脱蜡、蛋白酶K消化模板DNA的浓度：0.12ug/100ul体系PCR产量随模板DNA浓度的增加而显著升高模板

27、DNA浓度过高导致非特异性产物增加第52页/共82页5、Mg2+浓度Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.52.0mmol/L为宜Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低TaqDNA聚合酶的活性，使反应产物减少第53页/共82页二、PCR 的反应流程1.温度与时间的设置2.循环次数3.常见问题第54页/共82页1、温度与时间的设置设置变性-退火-延伸三个温度点标准反应中采用三温度点法，双链DNA在9095变性，再迅速冷却至4060退火，然后快速升温至7075延伸，对于较短靶基因（长度

28、100300bp）可采用二温度点法，将退火与延伸温度合二为一，一般采用94变性，65左右退火与延伸。第55页/共82页 变性温度与时间：一般9394，1min足以使模板变性若低于93则需延长时间但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。第56页/共82页 退火(复性)温度与时间：退火温度是影响PCR特异性的重要因素退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基因序列的长度对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55作为选择最适退火温度的起点较为理想第57页/共82页引物的复性温度引物的复性温度通过以下公式帮助选择合适的温度：Tm（解链温度）4(G+C)+2(A+T)复性温

29、度=Tm值（510）在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性复性时间一般为3060s，足以使引物与模板之间完全结合第58页/共82页 延伸温度与时间：TaqDNA聚合酶的生物学活性：7080150核苷酸/S/酶分子7060核苷酸/S/酶分子5524核苷酸/S/酶分子高于90时，DNA合成几乎不能进行第59页/共82页 延伸温度与时间：延伸温度：一般选择在7075之间常用温度为72过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。延伸反应时间：根据待扩增片段长度而定1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min（足够）34kb的靶序列需34min扩增10k

30、b需延伸至15min延伸时间过长会导致非特异性扩增对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些第60页/共82页2、循环次数循环次数决定PCR扩增程度循环次数主要取决于模板DNA的浓度循环次数：选在3040次之间循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多第61页/共82页如何提高如何提高PCRPCR中的中的DNADNA聚合酶的保真性？聚合酶的保真性？在在PCRPCR反反应应体体系系中中，除除使使用用TaqTaq DNADNA聚聚合合酶酶，掺掺入入少少量量的的具具有有3535外外切切酶酶活活性性的的耐耐热热DNADNA聚聚合合酶酶，如如PfuPfu，VentVent，PwoPwo等等，错错配配率率可可降降

31、为为原原来来的的 1/101/10；MgMg2+2+浓度浓度尽可能低，但不影响尽可能低，但不影响DNADNA合成；合成；减少高温反应时间，这样减少高温反应时间，这样DNADNA热损伤将减少；热损伤将减少；减少循环数。减少循环数。第62页/共82页如何提高如何提高PCR扩增的特异性？扩增的特异性？升高退火温度可增加引物与模板结合的特异性；升高退火温度可增加引物与模板结合的特异性；升高退火温度可增加引物与模板结合的特异性；升高退火温度可增加引物与模板结合的特异性；缩缩缩缩短短短短退退退退火火火火和和和和延延延延伸伸伸伸时时时时间间间间，可可可可减减减减少少少少错错错错误误误误引引引引发发发发及及及

32、及多多多多余余余余的的的的DNADNA聚合酶分子参与酶促延伸的机会；聚合酶分子参与酶促延伸的机会；聚合酶分子参与酶促延伸的机会；聚合酶分子参与酶促延伸的机会；降降降降低低低低引引引引物物物物和和和和酶酶酶酶的的的的浓浓浓浓度度度度也也也也可可可可以以以以减减减减少少少少错错错错误误误误引引引引发发发发，尤尤尤尤其是能减少引物二聚体的引发；其是能减少引物二聚体的引发；其是能减少引物二聚体的引发；其是能减少引物二聚体的引发；改变改变改变改变MgMg2+2+的浓度可进一步提高扩增的特异性。的浓度可进一步提高扩增的特异性。的浓度可进一步提高扩增的特异性。的浓度可进一步提高扩增的特异性。第63页/共82

33、页引物设计的特异性；引物设计的特异性；减少循环次数；减少循环次数；热热启启动动（Hot Hot StartStart）。即即首首先先将将模模板板变变性性，然然后后在在较较高高温温度度时时加加入入TaqTaq DNADNA聚聚合合酶酶、引引物物及及MgClMgCl2 2等等一一些些重重要要成成分分，这这样样使使得得引引物物在在较较高高温温度度下下与与模模板板退退火火，提提高高了了反反应应的的严严谨谨性性，使使扩扩增增更特异；更特异；采采用用二二对对引引物物即即外外引引物物和和内内引引物物进进行行扩扩增增来来提提高高扩增的特异性。扩增的特异性。第64页/共82页p RT-PCR及定量RT-PCR（

34、1 1）RT-PCRRT-PCR（reverse transcription-PCRreverse transcription-PCR）原原理理：先先在在逆逆转转录录酶酶的的作作用用下下、以以mRNAmRNA为为模模板板合合成成互互补补的的cDNAcDNA（complementary complementary DNADNA），再再以以cDNAcDNA为模板进行为模板进行PCRPCR反应。反应。是是一一种种快快速速、简简便便、敏敏感感性性极极高高的的检检测测mRNAmRNA表表达达的方法。的方法。PCR技术的主要类型技术的主要类型第65页/共82页第66页/共82页常用的两种逆转录酶常用的两种

35、逆转录酶AMVAMV（avian myeloblastosis virusavian myeloblastosis virus）：）：酶活性最适温度酶活性最适温度4242MMLVMMLV（Moloney murine leukemia virusMoloney murine leukemia virus）：）：酶活性最适温度酶活性最适温度3737第67页/共82页（2 2）定量）定量）定量）定量RT-PCRRT-PCR（qRT-PCRqRT-PCR）：）：）：）：利用利用利用利用RT-PCRRT-PCR对对对对mRNAmRNA水平进行半定量或绝对定量分析。水平进行半定量或绝对定量分析。水平进行

36、半定量或绝对定量分析。水平进行半定量或绝对定量分析。第68页/共82页半定量半定量半定量半定量RT-PCRRT-PCR选用在组织中普遍表达、表达量比较恒定的管家选用在组织中普遍表达、表达量比较恒定的管家选用在组织中普遍表达、表达量比较恒定的管家选用在组织中普遍表达、表达量比较恒定的管家基因基因基因基因mRNAmRNA作为内源性基因模板标准。作为内源性基因模板标准。作为内源性基因模板标准。作为内源性基因模板标准。管家基因管家基因管家基因管家基因mRNAmRNA和目的和目的和目的和目的mRNAmRNA混合物共同进行逆混合物共同进行逆混合物共同进行逆混合物共同进行逆转录，在各自的引物引导下扩增。转录

37、，在各自的引物引导下扩增。转录，在各自的引物引导下扩增。转录，在各自的引物引导下扩增。计算出扩增后计算出扩增后计算出扩增后计算出扩增后目的基因扩增子目的基因扩增子目的基因扩增子目的基因扩增子/管家基因扩增子管家基因扩增子管家基因扩增子管家基因扩增子的的的的比值，从而达到半定量的目的。比值，从而达到半定量的目的。比值，从而达到半定量的目的。比值，从而达到半定量的目的。第69页/共82页pp 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR常规定量常规定量PCRPCR技术：技术：对对PCRPCR扩增反应的扩增反应的终产物终产物进行定量进行定量 重复性差重复性差 半定量半定量实时定量实时定量PCRPCR技术：技

38、术：对对PCRPCR扩增反应中扩增反应中每一个循环的产物每一个循环的产物进行定量进行定量 第70页/共82页实时荧光定量PCR原理在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。第71页/共82页（1）Ct 值是荧光定量PCR的一个重要的概念，C代表Cycle，t代表threshold。含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。第72页/共82页（2）荧光域值（threshold）的设定PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号荧光域值是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：threshold

39、=10SDcycle3-15第73页/共82页Ct值的确定第74页/共82页（3）Ct值与起始模板的关系理想的理想的PCRPCR反应：反应：X=XX=X0 0*2*2n n非理想的非理想的PCRPCR反应：反应：X=XX=X0 0(1+Ex)(1+Ex)n n n n：扩增反应的循环次数：扩增反应的循环次数 X X：第：第n n次循环后的产物量次循环后的产物量 X X0 0：初始模板量：初始模板量 ExEx：扩增效率：扩增效率第75页/共82页在扩增产物达到阈值线时在扩增产物达到阈值线时在扩增产物达到阈值线时在扩增产物达到阈值线时:X XCtCt=X=X0 0 (1+Ex)(1+Ex)CtCt

40、=M (1)=M (1)X XCtCt：荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量。荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量。荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量。荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量。在阈值线设定以后，它是一个常数，我们设为在阈值线设定以后，它是一个常数，我们设为在阈值线设定以后，它是一个常数，我们设为在阈值线设定以后，它是一个常数，我们设为MM。方程式方程式方程式方程式(1)(1)两边同时取对数得两边同时取对数得两边同时取对数得两边同时取对数得:log M=log X log M=log X0 0(1+Ex)(1+Ex)CtCt (2)(2)整理方程式整理方程式整理方程式整理

41、方程式(2)(2)得得得得:log log X X0 0=-log(1+Ex)*=-log(1+Ex)*CtCt+log M+log M (3)(3)Log Log浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到到到到域值的循环数即域值的循环数即域值的循环数即域值的循环数即CtCt值，值，值，值，就可计算出样品中所含的模就可计算出样品中所含的模就可计算出样品中所含的模就可计算出样品中所含的模板量。板量。板量。板量。第76页/共82页q 模板模板模板模板DNADNADNADNA量越多，荧光达

42、到域值的循环数越少，量越多，荧光达到域值的循环数越少，量越多，荧光达到域值的循环数越少，量越多，荧光达到域值的循环数越少，即即即即CtCtCtCt值越小值越小值越小值越小q LogLogLogLog浓度与循环数呈线性关系，通过已知起始浓度与循环数呈线性关系，通过已知起始浓度与循环数呈线性关系，通过已知起始浓度与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，根据样品拷贝数的标准品可作出标准曲线，根据样品拷贝数的标准品可作出标准曲线，根据样品拷贝数的标准品可作出标准曲线，根据样品CtCtCtCt值，值，值，值，就可以计算出样品中所含的模板量就可以计算出样品中所含的模板量就可以计算出样品中所含的模板量就可以计算出样品中所含的模板量第77页/共82页q确定未知样品的确定未知样品的 C(t)C(t)值值 q通过标准曲线由未知样品的通过标准曲线由未知样品的C(t)C(t)值推算出其初始值推算出其初始量量Sample25第78页/共82页（4）荧光标记方法可分为两种：荧光探针（Taqman）荧光染料（SYBRGreen）第79页/共82页第80页/共82页第81页/共82页感谢您的观看！第82页/共82页