第五讲基因定点诱变技术PPT讲稿.ppt
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1、第五讲基因定点诱变技术第五讲基因定点诱变技术第1页,共24页,编辑于2022年,星期三n nM.Smith(加拿大生物化学家)1993年诺贝尔化学奖,1978年发明了寡核苷酸定点诱变技术。利用寡核苷酸定点诱变技术,可以认为地通过基因的改变来修饰、改造某一已知的蛋白质,从而可以研究蛋白质的结构及其与功能的关系、蛋白质之间的相互作用。寡核苷酸定点诱变技术寡核苷酸定点诱变技术第2页,共24页,编辑于2022年,星期三基因诱变的应用n n1 结构和功能n n2 基因的注释n n3 代谢途径-分子育种n n4 蛋白质的修饰n n5 分子设计-分子进化工程第3页,共24页,编辑于2022年,星期三缺失诱变
2、缺失诱变n n1 简单缺失 通过对DNA片段中具有的相应的酶切位点进行切割,而后用T4连接酶进行连接。n n2 系统缺失 核酸外切酶III、S1核酸酶、Klenow大片段第4页,共24页,编辑于2022年,星期三插入突变插入突变n n1 人工合成片段n n2 Transposon insertion(Tn5)n n3 同源重组n n4 PCR第5页,共24页,编辑于2022年,星期三 基因的体外诱变第6页,共24页,编辑于2022年,星期三Kunkel法法 或称或称”U”法法 dut dut-:dUTPdUTP酶(酶(dUTPasedUTPase)缺陷,细胞不能把)缺陷,细胞不能把dUTPdU
3、TP转化为转化为dUMP,dUMP,因此细胞内因此细胞内dUTPdUTP的含量大为增的含量大为增加,其中一些加,其中一些dUTPdUTP可掺入可掺入DNADNA中正常情况下有中正常情况下有“T”“T”占据的位置。占据的位置。ung ung-:UDGUDG酶缺陷,酶缺陷,UDGUDG酶(尿嘧啶酶(尿嘧啶-N-N-糖基糖基化酶)可除去化酶)可除去DNADNA中的尿嘧啶中的尿嘧啶第7页,共24页,编辑于2022年,星期三E.Coli(dut-,ung-)n n合成的DNA中含有尿嘧啶,M13噬菌体DNA中将含有20-30个尿嘧啶碱基。n nCJ236(dut-,ung-,F+)第8页,共24页,编辑
4、于2022年,星期三ssDNA制备载体制备载体n n1 单链噬菌体载体 M13n n2 phagemid载体-辅助噬菌体第9页,共24页,编辑于2022年,星期三所用酶类所用酶类n nT4噬菌体聚合酶:诱变几率65%n nT7噬菌体聚合酶:3-5外切活性强,持续合成DNA的能力强,遇到引物时会停止。诱变几率83%n nKlenowDNA聚合酶:前端有引物或双链时,可能会替换。诱变几率36%第10页,共24页,编辑于2022年,星期三影响因素影响因素n n1 引物:热动力学(配对),突变碱基的左右8-10bpn n2 T4连接酶n n3 5端磷酸化n n4 单链结合蛋白:解决颈环结构第11页,共
5、24页,编辑于2022年,星期三n n基因扩增(gene amplification)主要内容:主要内容:1.1.体外扩增体外扩增 2.2.通过体外重组和转化,将目的基因在宿主细胞通过体外重组和转化,将目的基因在宿主细胞进行扩增进行扩增 3.在环境作用下,生物体内相关基因的扩增。4.4.程序基因扩增程序基因扩增 5.5.进化过程中的基因扩增进化过程中的基因扩增第12页,共24页,编辑于2022年,星期三n nPCRPCR技术技术 在在19831983年,美国年,美国CetusCetus公司人类遗传研公司人类遗传研究室的科学家究室的科学家K.B.MullisK.B.Mullis发明的。发明的。P
6、CR PCR是一种在体外快速扩增特定基因或是一种在体外快速扩增特定基因或DNADNA序列的方法,有称之为体外扩增法。序列的方法,有称之为体外扩增法。第13页,共24页,编辑于2022年,星期三(c)(c)(b)(b)引物引物引物引物2 2553333335555(d)(d)新引物新引物新引物新引物5533靶靶靶靶DNADNA的扩增的扩增的扩增的扩增(a)(a)5533引物引物引物引物1 13 3 553355引物引物引物引物2 2互补链互补链互补链互补链引物引物引物引物1 1互补链互补链互补链互补链单位长度的链单位长度的链单位长度的链单位长度的链不同长度的链不同长度的链不同长度的链不同长度的链
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