薄层色谱讲解学习.ppt

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1、薄层色谱色谱法色谱法GCLCCE填充柱色谱法填充柱色谱法毛细管柱色谱法毛细管柱色谱法柱色谱柱色谱平面色谱法平面色谱法高效高效液相液相 色谱法色谱法经典液相经典液相 色谱法色谱法吸附柱色谱吸附柱色谱分配柱色谱分配柱色谱离子交换色谱离子交换色谱凝胶色谱凝胶色谱薄层色谱薄层色谱纸色谱纸色谱（毛细管电泳色谱法）（毛细管电泳色谱法）(HPLC)薄层色谱薄层色谱（Thin Layer Chromatography）v薄层色谱又称薄层层析，是以涂布于支薄层色谱又称薄层层析，是以涂布于支持板上的支持物作为固定相，以合适的持板上的支持物作为固定相，以合适的溶剂为流动相，对混合样品进行分离、溶剂为流动相，对混合样

2、品进行分离、鉴定和定量的一种层析分离技术。鉴定和定量的一种层析分离技术。常用常用TLC表示。表示。v属于固属于固-液色谱的一种液色谱的一种 相关参数相关参数分类及分类及操作步骤操作步骤 特特 点点 应应 用用 基本原理基本原理基本原理基本原理 薄薄层层色色谱谱法法是是利利用用各各成成分分对对同同一一吸吸附附剂剂吸吸附附能能力力不不同同，使使其其在在流流动动相相（溶溶剂剂）流流过过固固定定相相（吸吸附附剂剂）的的过过程程中中，连连续续的的产产生生吸吸附附、解解吸吸附附、再再吸吸附附、再再解解吸吸附附，从从而而达达到到各各成成分分的互相分离的目的。的互相分离的目的。固固 定定 相：吸附剂相：吸附剂

3、 流流 动动 相：展开剂相：展开剂分离原理：分离原理：吸附、吸附、解吸附解吸附v例如例如：用硅胶作用硅胶作吸附剂吸附剂，其主要是，其主要是根据吸根据吸附附力与分配系数的不同，使混合物得以分离。力与分配系数的不同，使混合物得以分离。当溶剂沿着当溶剂沿着硅胶硅胶吸附剂移动时，带着样品中吸附剂移动时，带着样品中的各组分一起移动，同时发生连续吸附的各组分一起移动，同时发生连续吸附、解解吸吸、反复分配作用。由于各组分在溶剂中的反复分配作用。由于各组分在溶剂中的溶解度不同，以及吸附剂对它们的吸附能力溶解度不同，以及吸附剂对它们的吸附能力的差异，最终将混合物分离成一系列斑点的差异，最终将混合物分离成一系列斑

4、点，从而达到分离的目的。从而达到分离的目的。相关参数相关参数比移值（比移值（Rf）组分组分二二组分一组分一被分离混被分离混合物合物Rf 的范围：的范围：0 Rf1 Rf=0.20.8（常用）（常用）Rf=0.30.5（最佳）（最佳）v影响影响Rf值的因素：值的因素：（1）展开温度展开温度：室温对分离影响不明显。其他条件相同，温：室温对分离影响不明显。其他条件相同，温度低比温度高时展开慢，分离好。度低比温度高时展开慢，分离好。（2）薄层厚度薄层厚度：板厚度变化对比移值影响明显；厚度达：板厚度变化对比移值影响明显；厚度达0.2mm时，影响较小；在时，影响较小；在0.25mm时，分离效果最佳。时，分

5、离效果最佳。（3）吸附剂含水量吸附剂含水量：与吸附剂的种类、使用时的加水量、风：与吸附剂的种类、使用时的加水量、风干时间、活化温度、活化时间等因素有关。干时间、活化温度、活化时间等因素有关。（4）层析缸中蒸层析缸中蒸气气：缸中蒸：缸中蒸气气未达饱和时，比移值不能重现。未达饱和时，比移值不能重现。为使缸中蒸为使缸中蒸气气饱和，可以在缸内壁附上一层滤纸，让展开剂饱和，可以在缸内壁附上一层滤纸，让展开剂全部湿润；把展开剂放入层析缸一段时间后全部湿润；把展开剂放入层析缸一段时间后再再放薄层板；尽放薄层板；尽可能在恒定温度下层析。可能在恒定温度下层析。（5）其他影响因素其他影响因素：展开剂的：展开剂的p

6、H、展开时间、展开距离、样、展开时间、展开距离、样品浓度、点样量、薄层板所用吸附剂中的粘合剂的种类和用品浓度、点样量、薄层板所用吸附剂中的粘合剂的种类和用量等，都有可能影响样品组分比移值的大小。量等，都有可能影响样品组分比移值的大小。薄层色谱分类薄层色谱分类v常规制备薄层色谱常规制备薄层色谱（PTLC）v加压制备薄层色谱加压制备薄层色谱（OPLC）v离心薄层色谱离心薄层色谱(CTLC)常规制备薄层色谱常规制备薄层色谱1.固定相（吸附剂）的选择固定相（吸附剂）的选择 在在吸吸附附薄薄层层色色谱谱中中，固固定定相相的的选选择择十十分分重重要。其选择应从两个方面考虑：要。其选择应从两个方面考虑：a.

7、被被分分离离物物质质的的性性质质（如如极极性性、酸酸碱碱性性、溶溶解解度等）度等）b.吸附剂吸附能力的强弱。吸附剂吸附能力的强弱。若若被被分分离离物物质质极极性性强强，应应选选择择吸吸附附能能力力弱弱的的吸吸附剂；附剂；若若被被分分离离物物质质极极性性弱弱，应应选选择择吸吸附附能能力力强强的的吸吸附剂。附剂。v吸附剂就其性质而吸附剂就其性质而言言，可分为有机吸附剂，可分为有机吸附剂（如聚酰胺、纤维素和葡聚糖等）和无机吸（如聚酰胺、纤维素和葡聚糖等）和无机吸附剂（如氧化铝、硅胶、硅藻土、磷酸钙、附剂（如氧化铝、硅胶、硅藻土、磷酸钙、磷酸镁和硅酸钙镁等）。磷酸镁和硅酸钙镁等）。最常用的是最常用的是

8、氧氧化铝化铝和硅胶，它们的吸附性能好，适用于多种化和硅胶，它们的吸附性能好，适用于多种化合物的分离。合物的分离。v常用的吸附剂厚度为常用的吸附剂厚度为0.52.5mm，色谱板的，色谱板的尺寸一般为尺寸一般为20cm20cm或或20cm40cm。薄。薄层厚度与薄层板的尺寸限制了层厚度与薄层板的尺寸限制了PTLC可以分离可以分离的样品量。的样品量。v1.0mm厚的硅胶板最多可上样厚的硅胶板最多可上样5mgcm2。硅胶是最常用的吸附剂，可用它来分离亲脂硅胶是最常用的吸附剂，可用它来分离亲脂或亲水性物质。或亲水性物质。PTLC板板可可以以自自己己制制备备，也也有有预预制制板板出出售售。自自制制PTLC

9、板板的的优优点点在在于于吸吸附附剂剂的的厚厚度度及及组组成成可可调调节节(最最厚厚可可达达5mm)，也也可可以以在在吸吸附附剂剂中中掺掺入入硝硝酸酸银银及及缓冲物质。缓冲物质。硅硅 胶胶黏和剂黏和剂混合混合平铺平铺涂铺器涂铺器自然干燥一夜自然干燥一夜105115活化活化 煅石膏或煅石膏或羧甲基纤维素钠水溶液羧甲基纤维素钠水溶液v注意事项注意事项调制时慢慢搅拌，勿使产生气泡。调制时慢慢搅拌，勿使产生气泡。均匀涂布在玻璃板上，摇动摊平，晾干。均匀涂布在玻璃板上，摇动摊平，晾干。使使用用前前放放入入烘烘箱箱内内，在在105-115105-115左左右右烘烘干干40-40-50min50min。冷却后

10、使用。冷却后使用。2.流动相（流动相（展开剂）的选择展开剂）的选择 展开剂选择是否适当是薄层分离的重要条件之一。展开剂选择是否适当是薄层分离的重要条件之一。在吸附薄层色谱中，选择展开剂主要是由被分离物质在吸附薄层色谱中，选择展开剂主要是由被分离物质的极性、吸附剂的活性以及展开剂本身的极性来决定的极性、吸附剂的活性以及展开剂本身的极性来决定.在在薄薄层层色色谱谱中中，一一般般先先选选择择单单一一溶溶剂剂作作展展开开剂剂，但但对对难难分分离离组组分分，则则需需要要使使用用二二元元、三三元元甚甚至至多多元元的的溶溶剂剂。先先用用一一种种极极性性较较小小的的溶溶剂剂为为基基础础溶溶剂剂展展开开混混合合

11、物物，若若展展开开不不好好，用用极极性性较较大大的的溶溶剂剂与与前前一一溶溶剂剂混混合合，调调整整极极性性，再再次次试试验验，直直到到选选出出合合适适的的展展开开剂剂组组合合为为止。止。v对普通酸性组分对普通酸性组分：特别是离解度较大的弱酸性特别是离解度较大的弱酸性组分应在展开剂中加入一定比例的酸，可防止组分应在展开剂中加入一定比例的酸，可防止拖尾现象；拖尾现象；v对于对于碱性物质碱性物质：如某些生物碱，多数情况是选如某些生物碱，多数情况是选用氧化铝为吸附剂，选用中性溶剂为展开剂。用氧化铝为吸附剂，选用中性溶剂为展开剂。若采用硅胶为吸附剂，则选用碱性展开剂为宜；若采用硅胶为吸附剂，则选用碱性展

12、开剂为宜；但对某些碱性较弱的生物碱可使用中性展开剂。但对某些碱性较弱的生物碱可使用中性展开剂。v理想的展开剂应能使混合物分离后各组分的理想的展开剂应能使混合物分离后各组分的Rf值相差尽可能大。值相差尽可能大。v各组分理想的比移值在各组分理想的比移值在0.2-0.8之间之间。v化合物的极性、吸附剂的活化合物的极性、吸附剂的活性性及展开剂的及展开剂的极性配合极性配合a.分离非极性物质时，应选择非极性展开剂和高分离非极性物质时，应选择非极性展开剂和高活性吸附剂；活性吸附剂；b.分离强极性物质时，则应选择强极性展开剂和分离强极性物质时，则应选择强极性展开剂和活性较低的吸附剂；活性较低的吸附剂；c.分离

13、中等极性物质，则应选择中等极性物质和分离中等极性物质，则应选择中等极性物质和中等活性吸附剂。中等活性吸附剂。v操作步骤操作步骤1.点样点样 上上样样是是进进行行PTLC分分离离的的一一个个最最关关键键的的步步骤骤。上上样样之之前前薄薄层层板板最最好好先先用用溶溶剂剂展展开开一一次次，以以减减少少所所需需化化合合物物从吸附剂洗脱下来时可能混入的杂质。从吸附剂洗脱下来时可能混入的杂质。样样品品溶溶解解：上上样样前前先先将将样样品品溶溶于于少少量量溶溶剂剂，难难挥挥发发性性溶溶剂剂可可引引起起点点样样带带变变宽宽，因因此此最最好好选选用用挥挥发发性性溶溶剂剂(如如己己烷烷、二二氯氯甲甲烷烷、乙乙酸酸

14、乙乙酯酯、甲甲醇醇、乙乙醇醇、丙丙酮酮、氯氯仿仿等等)，最最好好用用与与展展开开剂剂极极性性相相似似的的溶溶剂剂，应应尽尽量量使使点点样样后后溶溶剂剂能能迅迅速速挥挥发发，以以减减少少色色斑斑的的扩扩散散。水水溶溶性性样样品品，可可先先用用少少量量水水使使其其溶溶解解，再再用用甲甲醇或乙醇稀释定容。醇或乙醇稀释定容。点样示意图点样示意图反应混合反应混合液样液样原料样原料样1-2cm1cm点间距点间距1.5cm点样直径点样直径2mmv点样注意事项点样注意事项a.样样品品的的浓浓度度应应在在510左左右右。点点样样带带应应尽尽可可能能狭狭窄窄，以以获获得得更更好好的的分分离离效效果果。溶溶解解样样

15、品品的的溶溶剂剂要要尽尽量量避避免免用用水水，因因为为水水溶溶液液斑斑点点容容易易扩扩散散，且且不不易易挥挥发。发。b.适适当当的的点点样样量量，可可使使斑斑点点集集中中，点点样样量量过过大大，易易拖拖尾尾或或扩扩散散；点点样样量量过过少少，不不易易检检出出。点点样样量量多多少少，应应视视薄薄层层的的性性能能及及显显色色剂剂的的灵灵敏敏度度而而定定，此此外外还还应应考虑薄层的厚度。一般是几微克到几十微克。考虑薄层的厚度。一般是几微克到几十微克。c.尽尽量量用用小小的的点点样样管管，如如果果有有足足够够的的耐耐性性，最最好好只只用用1微微升升的的点点样样管管。这这样样，点点的的斑斑点点较较小小，

16、展展开开的的色色谱谱图分离度好，颜色分明。图分离度好，颜色分明。2.展开展开 将将点点好好样样的的薄薄板板与与流流动动相相接接触触，使使两两相相相相对对运运动动并带动样品组分迁移的过程称为展开。并带动样品组分迁移的过程称为展开。展开示意图展开示意图 一一般般硬硬板板常常用用上上行行法法展展开开。将将点点样样后后的的薄薄板板直直立立于于已已盛盛有有展展开开剂剂的的直直立立形形层层析析槽槽的的凸凸出出处处，不不接接触触底底部部的的展展开开剂剂，加加盖盖饱饱和和，再再迅迅速速将将薄薄板板置置于于槽槽底底使使之之浸浸入入展展开开剂剂中中展展开开，直直至至展展开开剂剂上上升升一一段段距距离离（一一般般约

17、约15cm），取取出出薄薄板板，用用铅铅笔笔画画出出溶溶剂剂前前沿沿位位置，以便测量置，以便测量Rf值。值。v边缘效应边缘效应：展开时薄板展开时薄板边缘的边缘的Rf值高于中部的值高于中部的Rf值的现象。值的现象。它它主要是主要是由于色谱槽中的不饱和由于色谱槽中的不饱和状态和展开剂在薄板不状态和展开剂在薄板不同部位分配不同而引起同部位分配不同而引起的。的。v影响展开的因素有影响展开的因素有:相相对对湿湿度度;溶溶剂剂蒸蒸汽汽（a 展展开开室室的的饱饱和和 b预预吸附）吸附）;温度温度；展距展距。展开剂要接触到吸附剂展开剂要接触到吸附剂下沿，但切勿接触到样下沿，但切勿接触到样点。点。薄层板呈倾斜状

18、。薄层板呈倾斜状。盖上盖子，盖上盖子，容器密闭容器密闭。防止边缘效应。防止边缘效应。3.显色与定位显色与定位常见的显色方法：常见的显色方法：物理显色法：物理显色法：荧光样品，不少有机物在紫外灯照射下会出现不荧光样品，不少有机物在紫外灯照射下会出现不同的荧光，许多金属离子与同的荧光，许多金属离子与8-羟基喹啉的化合物在羟基喹啉的化合物在紫外线下也会呈现不同色调的荧光；紫外线下也会呈现不同色调的荧光；荧光背景，含荧光剂的薄层板在紫外线照射激发荧光背景，含荧光剂的薄层板在紫外线照射激发下背景显荧光，无荧光性样品斑点呈暗色。下背景显荧光，无荧光性样品斑点呈暗色。生化显色法：生化显色法：一些生化物质对某

19、些微生物的生长具有显著的促进一些生化物质对某些微生物的生长具有显著的促进或抑制作用。或抑制作用。化学显色法：化学显色法：喷射显色，采用适宜的显色剂与样品组分发生化学喷射显色，采用适宜的显色剂与样品组分发生化学反应生成有色物质；反应生成有色物质；蒸气显色，当薄层板展开后放入氨气、溴蒸蒸气显色，当薄层板展开后放入氨气、溴蒸气、碘蒸气中直接显色；气、碘蒸气中直接显色；硫酸显色，用硫酸显色，用96 的硫酸喷射薄板并直接在的硫酸喷射薄板并直接在火焰上或于火焰上或于100加热，有机组分被碳化呈现加热，有机组分被碳化呈现黑色斑点。黑色斑点。绝绝大大多多数数的的PTLC吸吸附附剂剂中中含含有有荧荧光光指指示示

20、剂剂，它它可可帮帮助助确确定定被被分分开开的的、具具有有紫紫外外吸吸收收化化合合物物的的色色带带位位置置。对对于于没没有有紫紫外外吸吸收收的的化化合合物物，可可采采用用下下列列几几种种方方法定位：法定位：v向板上喷洒水向板上喷洒水(如用于皂苷类化合物如用于皂苷类化合物)；v在板上覆盖一块玻璃板，并在板的边缘喷洒显在板上覆盖一块玻璃板，并在板的边缘喷洒显色剂；色剂；v加入一种参照物。加入一种参照物。4.样品的收集样品的收集 在在确确定定色色带带位位置置后后，可可用用刮刮刀刀或或一一与与真真空空收收集集器器相相连连的的管管形形刮刮离离器器将将该该色色带带吸吸附附剂剂从从板板上上刮刮下下。后后一一种

21、种方方法法并并不不适适用用于于敏敏感感的的物物质质，因因吸吸附附剂剂持持续续与与气气流流接接触触，所所含含的的纯纯化化合合物物有有被氧化的危险。被氧化的危险。v注意注意a.无无论论采采用用何何种种回回收收方方法法，都都应应以以极极性性尽尽可可能能小小的的溶溶剂剂将将化化合合物物从从吸吸附附剂剂中中提提取取出出来来(1g吸吸附附剂剂约使用约使用5ml溶剂溶剂)。b.化化合合物物与与吸吸附附剂剂接接触触的的时时间间越越长长，被被破破坏坏的的可可能能性性越越大大。可可先先用用4型型玻玻璃璃砂砂芯芯漏漏斗斗过过滤滤洗洗脱脱液液，然后再用孔径为然后再用孔径为0.20.45m的滤膜过滤。的滤膜过滤。c.甲

22、甲醇醇可可溶溶解解硅硅胶胶及及其其中中含含有有的的一一些些杂杂质质，因因此此，并并不不适适用用于于从从吸吸附附剂剂上上洗洗脱脱被被分分离离的的化化合合物物，较合适的溶剂是丙酮、乙醇或氯仿。较合适的溶剂是丙酮、乙醇或氯仿。加压制备薄层色谱加压制备薄层色谱v在在加加压压薄薄层层色色谱谱装装置置中中，有有一一弹弹性性的的气气垫垫覆覆盖盖在在水水平平的的薄薄层层色色谱谱板板上上。外外压压使使得得薄薄层层色色谱谱在在分分离离过过程程中中没没有有气气相相存存在在。展展开开剂剂被被强强制制流流动动，使使得得样样品品展展开开速速度度加加快快。与与靠靠毛毛细细作作用用的的色色谱谱方方法法相相比比，OPLC由由于

23、于采采用用更更细细颗颗粒粒的的吸吸附附剂剂及更长的色谱板，因而分离效果更好。及更长的色谱板，因而分离效果更好。v优点：优点：分离所需时间短，扩散效应相应减小分离所需时间短，扩散效应相应减小；加压使得某些润湿能力较差的流动相也可应用。加压使得某些润湿能力较差的流动相也可应用。加压制备薄层色谱加压制备薄层色谱示意图示意图离心薄层色谱法离心薄层色谱法v离离心心薄薄层层色色谱谱技技术术主主要要是是在在经经典典的的PTLC基基础础上上运运用用离离心心力力以以促促使使流流动动相相加加速速流流动动，是是一一种种强强迫迫流流动动相移动的方法。相移动的方法。v 在在使使用用该该仪仪器器时时，先先将将吸吸附附剂剂

24、与与洗洗脱脱剂剂的的混混合合物物加加到到两两块块直直径径为为30era的的水水平平薄薄板板之之间间，像像三三明明治治一一样样。离离心心力力使使过过量量的的溶溶剂剂排排出出，然然后后将将样样品品混混合合物物加加到到仍仍然然潮潮湿湿的的吸吸附附剂剂薄薄层层上上，采采用用常常规规方方法法进进行色带的洗脱。行色带的洗脱。特特 点点v优点优点 方法简便易行方法简便易行；分析速度快；分析速度快；分离分离能力强能力强；检出检出灵敏度高；灵敏度高；应用面广；应用面广；v缺点缺点 对生物高分子的分离效果不对生物高分子的分离效果不很很理想。理想。应应 用用 薄薄层层色色谱谱法法具具有有操操作作简简单单、快快速速，

25、设设备备投投资资小小、检检测测运运行行成成本本低低等等特特点点，在在医医药药、生生物物、环环境境、食食品品等等各各领域得到了广泛的应用。领域得到了广泛的应用。A.医药方面医药方面 由由于于薄薄层层色色谱谱的的快快速速、简简便便与与实实效效性性，广广泛泛应应用用于于中中草草药药品品种种鉴鉴别别和和成成分分分分析析、中中成成药药鉴鉴别别和和质质量量标标准准研研究究、合合成成药药物物的的定定性性鉴鉴别别、纯纯度度检检查查、稳稳定定性性考考察察和和药药物物代代谢谢以以及及合合成成工工艺艺监控分析、生化和抗生素研究等方面。监控分析、生化和抗生素研究等方面。应应用用薄薄层层扫扫描描即即薄薄层层色色谱谱与与

26、紫紫外外分分光光光光度度或或荧荧光光光光度度分分析析联用，可进行各种药物的定量分析。联用，可进行各种药物的定量分析。B.生物样品与毒物分析生物样品与毒物分析 薄层色谱法分析的生物样品多为血清、血浆或尿液等薄层色谱法分析的生物样品多为血清、血浆或尿液等,用来进行用来进行药物生物利用度的分析药物生物利用度的分析,检测临床用药的血药浓度检测临床用药的血药浓度,以利于诊断以利于诊断临床疾病等。毒物分析临床疾病等。毒物分析如如植物毒素、真菌毒素、兴奋剂、药物植物毒素、真菌毒素、兴奋剂、药物中毒、走私毒品、农药以及尸检、刑侦破案等方面的样品分析。中毒、走私毒品、农药以及尸检、刑侦破案等方面的样品分析。C.

27、环境有害物质的分析环境有害物质的分析 对农药及农药残留分析、有毒金属测定和多环芳烃测定等。对农药及农药残留分析、有毒金属测定和多环芳烃测定等。D.食品分析食品分析分离测定食品中所含有的碳水化合物、维生素、有机酸、氨基分离测定食品中所含有的碳水化合物、维生素、有机酸、氨基酸等天然营养成分，也用于食品添加剂如色素、防腐剂等酸等天然营养成分，也用于食品添加剂如色素、防腐剂等。E.其他领域的分析其他领域的分析无机及金属有机化合物分析、染料及化妆品分析、石油和煤分无机及金属有机化合物分析、染料及化妆品分析、石油和煤分析、手性化合物分离和化工及高分子材料分析。析、手性化合物分离和化工及高分子材料分析。v薄层色谱视频薄层色谱视频此课件下载可自行编辑修改，仅供参考！此课件下载可自行编辑修改，仅供参考！感谢您的支持，我们努力做得更好！谢谢感谢您的支持，我们努力做得更好！谢谢