凝胶层析法分离纯化蛋白质.pptx

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1、会计学1凝胶层析法分离纯化蛋白质凝胶层析法分离纯化蛋白质【目的目的】掌握凝胶层析的基本原理掌握凝胶层析的基本原理掌握凝胶层析的基本原理掌握凝胶层析的基本原理学习利用凝胶层析法分离纯化学习利用凝胶层析法分离纯化学习利用凝胶层析法分离纯化学习利用凝胶层析法分离纯化蛋白质的实验技能蛋白质的实验技能蛋白质的实验技能蛋白质的实验技能第1页/共20页 【原理原理】凝胶层析也称分子筛层析、凝胶层析也称分子筛层析、排阻层析。是利用具有网状结排阻层析。是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据构的凝胶的分子筛作用，根据被分离被分离物质的分子大小不同物质的分子大小不同来来进行分离的技术。进行分离的技术。第2页/共

2、20页 凝胶层析是按照蛋凝胶层析是按照蛋白质分子量大小进行分白质分子量大小进行分离的技术，又称之凝胶离的技术，又称之凝胶过滤、分子筛层析或排过滤、分子筛层析或排阻层析。阻层析。单个凝胶珠本身象单个凝胶珠本身象“筛子筛子”。不同类型凝。不同类型凝胶的筛孔的大小不同。胶的筛孔的大小不同。凝胶过滤层析凝胶过滤层析第3页/共20页带网孔的带网孔的葡聚糖珠葡聚糖珠小分子进入小分子进入葡聚糖珠内葡聚糖珠内大分子大分子不能进不能进入珠内，入珠内，经珠之经珠之间缝隙间缝隙流出流出凝胶过滤层析过程示意图凝胶过滤层析过程示意图第4页/共20页凝胶过滤层析过程示意凝胶过滤层析过程示意图图小分小分子子大分大分子子凝胶

3、基凝胶基质质凝胶凝胶珠珠第5页/共20页总结：总结：相对分子质量较大相对分子质量较大相对分子质量较大相对分子质量较大的物质由于直径大于凝胶网孔的物质由于直径大于凝胶网孔的物质由于直径大于凝胶网孔的物质由于直径大于凝胶网孔被完全被完全被完全被完全排阻排阻排阻排阻在孔外，在孔外，在孔外，在孔外，只能在凝胶颗粒外的空间向下流动，因此只能在凝胶颗粒外的空间向下流动，因此只能在凝胶颗粒外的空间向下流动，因此只能在凝胶颗粒外的空间向下流动，因此流程较短，移动速度快；所以流程较短，移动速度快；所以流程较短，移动速度快；所以流程较短，移动速度快；所以首先流出首先流出首先流出首先流出。相对分子质量较小相对分子质

4、量较小相对分子质量较小相对分子质量较小的物质由于直径小于凝胶网孔，可的物质由于直径小于凝胶网孔，可的物质由于直径小于凝胶网孔，可的物质由于直径小于凝胶网孔，可完完完完全渗透全渗透全渗透全渗透进入凝胶颗粒的网孔，在向下移动过程中，因此进入凝胶颗粒的网孔，在向下移动过程中，因此进入凝胶颗粒的网孔，在向下移动过程中，因此进入凝胶颗粒的网孔，在向下移动过程中，因此流程较长，移动速率慢；所以流程较长，移动速率慢；所以流程较长，移动速率慢；所以流程较长，移动速率慢；所以最后流出最后流出最后流出最后流出。中等大小的分子中等大小的分子中等大小的分子中等大小的分子，它们在凝胶颗粒内外，它们在凝胶颗粒内外，它们在

5、凝胶颗粒内外，它们在凝胶颗粒内外部分渗透部分渗透部分渗透部分渗透，渗透，渗透，渗透，渗透的程度取决于它们分子的大小，所以它们流出的时间介的程度取决于它们分子的大小，所以它们流出的时间介的程度取决于它们分子的大小，所以它们流出的时间介的程度取决于它们分子的大小，所以它们流出的时间介于二者之间，这样于二者之间，这样于二者之间，这样于二者之间，这样分子大的组分先流出，分子小的组分分子大的组分先流出，分子小的组分分子大的组分先流出，分子小的组分分子大的组分先流出，分子小的组分后流出。后流出。后流出。后流出。这样样品经过凝胶层析后，各个组分便按分子这样样品经过凝胶层析后，各个组分便按分子这样样品经过凝胶

6、层析后，各个组分便按分子这样样品经过凝胶层析后，各个组分便按分子从大到小的顺序依次流出，从而达到了分离的目的。从大到小的顺序依次流出，从而达到了分离的目的。从大到小的顺序依次流出，从而达到了分离的目的。从大到小的顺序依次流出，从而达到了分离的目的。第6页/共20页【实验器材实验器材】层析柱层析柱层析柱层析柱恒流泵恒流泵恒流泵恒流泵紫外检测仪紫外检测仪紫外检测仪紫外检测仪部分收集器部分收集器部分收集器部分收集器试管等普通玻璃器皿试管等普通玻璃器皿试管等普通玻璃器皿试管等普通玻璃器皿第7页/共20页第8页/共20页第9页/共20页第10页/共20页第11页/共20页【实验试剂实验试剂】待分离样品待

7、分离样品待分离样品待分离样品葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶 Sephadex G-100Sephadex G-100洗脱液：洗脱液：洗脱液：洗脱液：0.1mol/L pH6.80.1mol/L pH6.8磷酸缓冲磷酸缓冲磷酸缓冲磷酸缓冲液液液液第12页/共20页【操作方法操作方法】一、凝胶的处理一、凝胶的处理一、凝胶的处理一、凝胶的处理Sephadex G-100干粉经蒸干粉经蒸馏水室温充分溶胀馏水室温充分溶胀48h，或沸，或沸水浴中煮沸水浴中煮沸2h，冷却至室温后，冷却至室温后抽真空脱去颗粒空隙中的空气。抽真空脱去颗粒空隙中的空气。第13页/共20页二、装柱二、装柱二、装柱二、装柱

8、 关闭出口，向柱内关闭出口，向柱内加入洗脱加入洗脱液液约约1cm高，将浓浆状的凝胶缓高，将浓浆状的凝胶缓慢地倾入柱中，使之慢地倾入柱中，使之自然沉降自然沉降，凝胶沉降约凝胶沉降约1高度后打开出水高度后打开出水口，继续加入凝胶浆，直到凝胶口，继续加入凝胶浆，直到凝胶沉积至一定高度即可。装柱要求沉积至一定高度即可。装柱要求连续，均与，无气泡，无连续，均与，无气泡，无“纹路纹路”。第14页/共20页三、平衡三、平衡三、平衡三、平衡 将洗脱液与恒流泵相连，恒将洗脱液与恒流泵相连，恒流泵出口端与层析柱入口相连，流泵出口端与层析柱入口相连，用用23倍倍柱床体积的洗脱液平衡，柱床体积的洗脱液平衡，流速为流速

9、为0.5ml/min。第15页/共20页四、加样与洗脱四、加样与洗脱四、加样与洗脱四、加样与洗脱 将柱中多余的液体放掉出，将柱中多余的液体放掉出，使使液面刚好盖过凝胶液面刚好盖过凝胶，关闭出口，关闭出口，将将1ml样品沿层析柱管壁小心加样品沿层析柱管壁小心加入，加完后打开底端出口，使入，加完后打开底端出口，使液液面降至与凝胶面相平面降至与凝胶面相平时关闭出口，时关闭出口，加洗脱液至液层加洗脱液至液层4cm左右，接上左右，接上恒流泵，开始洗脱（恒流泵，开始洗脱（0.5ml/min）。）。第16页/共20页五、收集与测定五、收集与测定五、收集与测定五、收集与测定 用部分收集器收集洗脱液。用部分收集

10、器收集洗脱液。紫外检测仪紫外检测仪280nm处检测，将检处检测，将检测信号输入色谱工作站系统，绘测信号输入色谱工作站系统，绘制洗脱曲线。制洗脱曲线。第17页/共20页六、凝胶柱的处理六、凝胶柱的处理六、凝胶柱的处理六、凝胶柱的处理 凝胶用过后，反复用蒸馏水凝胶用过后，反复用蒸馏水通过柱通过柱（23倍床体积）倍床体积）即可。即可。第18页/共20页注意事项注意事项n n各接头不能漏气，连续用的小乳胶管不要有破损，各接头不能漏气，连续用的小乳胶管不要有破损，各接头不能漏气，连续用的小乳胶管不要有破损，各接头不能漏气，连续用的小乳胶管不要有破损，否则造成漏气、漏液。注意恒压瓶内的排气管应否则造成漏气

11、、漏液。注意恒压瓶内的排气管应否则造成漏气、漏液。注意恒压瓶内的排气管应否则造成漏气、漏液。注意恒压瓶内的排气管应无液体，并随着柱下口溶液的流出不断有气泡产无液体，并随着柱下口溶液的流出不断有气泡产无液体，并随着柱下口溶液的流出不断有气泡产无液体，并随着柱下口溶液的流出不断有气泡产生，则表示恒压瓶不漏气。操作过程中，层析柱生，则表示恒压瓶不漏气。操作过程中，层析柱生，则表示恒压瓶不漏气。操作过程中，层析柱生，则表示恒压瓶不漏气。操作过程中，层析柱内液面不断下降，则表示整个系统有漏气之处，内液面不断下降，则表示整个系统有漏气之处，内液面不断下降，则表示整个系统有漏气之处，内液面不断下降，则表示整

12、个系统有漏气之处，应仔细检查并加以纠正。应仔细检查并加以纠正。应仔细检查并加以纠正。应仔细检查并加以纠正。n n始终保持柱内液面高于凝胶表面，否则水分挥发，始终保持柱内液面高于凝胶表面，否则水分挥发，始终保持柱内液面高于凝胶表面，否则水分挥发，始终保持柱内液面高于凝胶表面，否则水分挥发，凝胶变干。也要防止液体流干，使凝胶混入大量凝胶变干。也要防止液体流干，使凝胶混入大量凝胶变干。也要防止液体流干，使凝胶混入大量凝胶变干。也要防止液体流干，使凝胶混入大量气泡，影响液体在柱内的流动，导致分离效果变气泡，影响液体在柱内的流动，导致分离效果变气泡，影响液体在柱内的流动，导致分离效果变气泡，影响液体在柱内的流动，导致分离效果变坏，不得不重新装柱。坏，不得不重新装柱。坏，不得不重新装柱。坏，不得不重新装柱。第19页/共20页