实验二 常见细菌种属的鉴定课件.pptx

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1、一、目的要求1 1、了解常见细菌种属的鉴定程序、了解常见细菌种属的鉴定程序2 2、掌握细菌的生理生化指标鉴定方法、掌握细菌的生理生化指标鉴定方法第1页/共18页二、基本原理（一）微生物分类鉴定的方法（一）微生物分类鉴定的方法多相分类法多相分类法 多相分类法多相分类法：Colwell1970Colwell1970年提出，指利用微生物多年提出，指利用微生物多种不同的信息，包括表型的、基因型的和系统发育种不同的信息，包括表型的、基因型的和系统发育的信息，综合研究微生物分类和系统进化的过程。的信息，综合研究微生物分类和系统进化的过程。多相分类法几乎包括了现代分类中所有的方面，如多相分类法几乎包括了现代

2、分类中所有的方面，如传统分类、化学分类、分子分类、数值分类等，被传统分类、化学分类、分子分类、数值分类等，被认为是目前研究各级分类单元最有效的手段，可用认为是目前研究各级分类单元最有效的手段，可用于所有水平上的分类单元的描述和定义。于所有水平上的分类单元的描述和定义。第2页/共18页1、传统分类法 也称描述分类，主要指以形态特征、也称描述分类，主要指以形态特征、培养特征以及生理生化特征等培养特征以及生理生化特征等表观表观分类指征，分类指征，对微生物分类单元进行的描述分类。对微生物分类单元进行的描述分类。传统分类是认识微生物实际重要性和传统分类是认识微生物实际重要性和研究生物进化的基础。研究生物

3、进化的基础。第3页/共18页 是随着信息数字化时代的发展，根据是随着信息数字化时代的发展，根据微生物分类学信息，应用计算数学原理和技微生物分类学信息，应用计算数学原理和技术辅助定义微生物分类单元的一种方法。术辅助定义微生物分类单元的一种方法。主要是向分类学家提供准确的、可主要是向分类学家提供准确的、可重复的、大信息量的处理手段。重复的、大信息量的处理手段。2、数值分类第4页/共18页3、化学分类 是研究微生物细胞不同化学特性，是研究微生物细胞不同化学特性，并利用这些特性对生物个体进行分类和鉴定。并利用这些特性对生物个体进行分类和鉴定。由于细胞化学成分及分子结构的稳由于细胞化学成分及分子结构的稳

4、定性好，因此化学分类是原核微生物系统分定性好，因此化学分类是原核微生物系统分类学的主要方法之一。类学的主要方法之一。第5页/共18页3、化学分类的常用方法uu细胞（壁）化学组分分析细胞（壁）化学组分分析uu枝菌酸分析（诺卡氏菌）枝菌酸分析（诺卡氏菌）uu磷酸类脂分析磷酸类脂分析uu脂肪酸组分分析脂肪酸组分分析uu醌组分分析醌组分分析uu全细胞蛋白全细胞蛋白SDS-PAGESDS-PAGE分析分析uu核糖体蛋白双向凝胶电泳（核糖体蛋白双向凝胶电泳（2D-PAGE2D-PAGE）第6页/共18页4、分子分类 从分子水平上，对生物个体的从分子水平上，对生物个体的DNADNA、RNARNA和蛋和蛋白质

5、进行研究，并根据获得的基因型信息对生物个白质进行研究，并根据获得的基因型信息对生物个体进行分类的方法。体进行分类的方法。uuDNA G+DNA G+mol%mol%uuDNA DNA 分子指纹分析分子指纹分析uuDNA-DNADNA-DNA杂交杂交uu核酸序列分析（核酸序列分析（16srDNA16srDNA、ITSITS等）等）第7页/共18页（二）微生物的生理生化反应1 1、淀粉水解实验、淀粉水解实验2 2、糖发酵试验、糖发酵试验3 3、MRMR（甲基红）（甲基红）4 4、V-PV-P（伏（伏-普）普）第8页/共18页1 1、淀粉水解实验、淀粉水解实验 不同微生物对不同大分子的水解能力不同，

6、说明它们有着不同的酶不同微生物对不同大分子的水解能力不同，说明它们有着不同的酶系统。系统。淀粉遇到碘液会产生蓝色，但是细菌水解淀粉的区域，用碘测试不淀粉遇到碘液会产生蓝色，但是细菌水解淀粉的区域，用碘测试不再产生蓝色，表明细菌产生淀粉酶。再产生蓝色，表明细菌产生淀粉酶。第9页/共18页2 2、糖发酵试验、糖发酵试验 糖发酵试验是常用的鉴别微生物的生化糖发酵试验是常用的鉴别微生物的生化反应，在肠道菌的鉴定上尤为重要。反应，在肠道菌的鉴定上尤为重要。绝大多数细菌都能利用糖类作为碳源和绝大多数细菌都能利用糖类作为碳源和能源，但在分解糖类物质的能力上差别很大。能源，但在分解糖类物质的能力上差别很大。有

7、的能产酸和气体，有的只产酸不产气。有的能产酸和气体，有的只产酸不产气。发酵产酸时，溴甲酚紫（发酵产酸时，溴甲酚紫（pH6.8pH6.8）变）变为黄色（为黄色（pH5.2pH5.2）。气体的产生可以由倒扣的）。气体的产生可以由倒扣的杜氏小管中有无气泡来证明。杜氏小管中有无气泡来证明。第10页/共18页3 3、MRMR（甲基红试验）（甲基红试验）用来检测由葡萄糖产生的有机酸，如甲酸、乙酸、乳酸等。当细菌代用来检测由葡萄糖产生的有机酸，如甲酸、乙酸、乳酸等。当细菌代谢糖产酸时，甲基红试剂会由橘黄色（谢糖产酸时，甲基红试剂会由橘黄色（6.36.3）变为红色（）变为红色（4.24.2），即为甲基红），即

8、为甲基红阳性反应。阳性反应。第11页/共18页4 4、V-PV-P VP VP试验是用来测定某些细菌利用葡萄试验是用来测定某些细菌利用葡萄糖产生非酸性或中性末端产物的能力，如丙酮糖产生非酸性或中性末端产物的能力，如丙酮酸。酸。此化合物在碱性条件下能被空气中的此化合物在碱性条件下能被空气中的氧气氧化成二乙酰。二乙酰与蛋白质中的精氨氧气氧化成二乙酰。二乙酰与蛋白质中的精氨酸的胍基作用，生成红色化合物，即为酸的胍基作用，生成红色化合物，即为VPVP试试验阳性。验阳性。第12页/共18页1.1.菌种菌种 枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、普通变形杆菌枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、普通变形杆菌2 2、培养基、培养基固体

9、淀粉培养基、葡萄糖发酵培养基、乳糖发酵培养基葡萄糖蛋白胨水培养基等3 3、仪器或其他用具、仪器或其他用具三、器材第13页/共18页1.1.淀粉水解试验淀粉水解试验uu将固体淀粉培养基溶化后冷却至将固体淀粉培养基溶化后冷却至5050，无菌操作制成平板。，无菌操作制成平板。uu用记号笔在平板底步划成三部分，将枯草、大肠杆菌、变形用记号笔在平板底步划成三部分，将枯草、大肠杆菌、变形杆菌等分别划线接种，并在平板背面标注菌种名称。杆菌等分别划线接种，并在平板背面标注菌种名称。uu37 37 倒置培养倒置培养24-4824-48小时小时uu观察各种细菌的生长情况。将平板打开盖子，滴入少量观察各种细菌的生长

10、情况。将平板打开盖子，滴入少量LugolsLugols碘液，轻轻旋转，使碘液均匀铺满整个平板碘液，轻轻旋转，使碘液均匀铺满整个平板uu观察菌落周围有没有透明圈出现。透明圈和菌落的直径大小观察菌落周围有没有透明圈出现。透明圈和菌落的直径大小可以初步判断菌体解淀粉的活性。可以初步判断菌体解淀粉的活性。四、操作步骤第14页/共18页2 2、糖发酵试验、糖发酵试验uu用记号笔在装有糖发酵培养基的试管壁上分别表明培养用记号笔在装有糖发酵培养基的试管壁上分别表明培养基名称和所接种的细菌菌名。基名称和所接种的细菌菌名。uu取葡萄糖发酵培养基试管取葡萄糖发酵培养基试管3 3支，分别接入大肠杆菌、枯支，分别接入

11、大肠杆菌、枯草杆菌、普通变形杆菌，对照不接种。草杆菌、普通变形杆菌，对照不接种。另取乳糖发酵培另取乳糖发酵培养基试管养基试管3 3支，操作同上。支，操作同上。uu接种后，轻轻摇动试管使其混合均匀，防止倒置的小管接种后，轻轻摇动试管使其混合均匀，防止倒置的小管进入气泡。进入气泡。uu将接过种的和作为对照的将接过种的和作为对照的6 6支管均置于支管均置于3737培养培养24482448小时。小时。uu观察各试管颜色变化以及杜氏小管有无气泡。观察各试管颜色变化以及杜氏小管有无气泡。第15页/共18页3 3、MRMR、VPVP试验试验uu配制蛋白胨水培养基，接种试验菌种。配制蛋白胨水培养基，接种试验菌

12、种。uu培养培养4848小时后，将一支葡萄糖蛋白胨水培养物中加小时后，将一支葡萄糖蛋白胨水培养物中加入甲基红试剂入甲基红试剂2 2滴，培养基若变为红色者，为阳性，滴，培养基若变为红色者，为阳性，变黄色者为阴性。变黄色者为阴性。uu取另外一支培养取另外一支培养4848小时后的葡萄糖蛋白胨水培养物，小时后的葡萄糖蛋白胨水培养物，加入加入510510滴滴40%40%的的KOHKOH，然后加入等量的，然后加入等量的5%5%的的a-a-萘酚溶液，用力振荡，再放入萘酚溶液，用力振荡，再放入3737温箱中保温温箱中保温15301530分钟，以加快反应速度。培养物呈红色者，为分钟，以加快反应速度。培养物呈红色

13、者，为V-PV-P反反应阳性。应阳性。第16页/共18页1.1.记录实验结果记录实验结果P 118.1P 118.1；P120.1 P120.1；P123.1P123.1根据实验结果推测根据实验结果推测1 1、2 2、3 3号菌种分别是何菌？号菌种分别是何菌？2.2.思考题思考题（1 1）你怎样解释淀粉酶是胞外酶而非胞内酶？）你怎样解释淀粉酶是胞外酶而非胞内酶？（2 2）加入某种微生物可以有氧代谢葡萄糖，发酵试验是什么结果？）加入某种微生物可以有氧代谢葡萄糖，发酵试验是什么结果？（3 3）为什么大肠杆菌是）为什么大肠杆菌是MRMR阳性，而枯草杆菌是阴性？这个实验，与阳性，而枯草杆菌是阴性？这个实验，与V-V-P P试验最初底物与最终产物有何异同？为什么会不同？试验最初底物与最终产物有何异同？为什么会不同？五、实验报告第17页/共18页感谢您的观看。第18页/共18页