基因工程5学习.pptx

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1、基本概念DNADNA重组 不同来源的DNADNA分子可以通过末端共价连接（磷酸二酯键）而形成重新组合的DNADNA分子，这一过程称为DNADNA重组。19731973年 重组DNADNA技术建立第1页/共110页克隆克隆 作作名词名词使用时，是指由一个细胞经过使用时，是指由一个细胞经过无性繁无性繁殖殖以后所形成的子代群体。以后所形成的子代群体。作作动词动词使用时，是指产生这一群体的过程。使用时，是指产生这一群体的过程。第2页/共110页基因克隆基因克隆 是指在体外，借助于能自我复制的载体，将目是指在体外，借助于能自我复制的载体，将目的基因引入到宿主细胞中进行增殖，以获得大量的的基因引入到宿主细

2、胞中进行增殖，以获得大量的特定特定DNADNADNADNA片段。也称为片段。也称为重组重组DNADNADNADNA，分子克隆，分子克隆。第3页/共110页基因工程基因工程 指在体外将基因进行克隆，并利用克隆的基因指在体外将基因进行克隆，并利用克隆的基因指在体外将基因进行克隆，并利用克隆的基因指在体外将基因进行克隆，并利用克隆的基因表达、制备特定的蛋白质或多肽产物，或定向改表达、制备特定的蛋白质或多肽产物，或定向改表达、制备特定的蛋白质或多肽产物，或定向改表达、制备特定的蛋白质或多肽产物，或定向改造细胞乃至生物体的特性所用的方法及相关的工造细胞乃至生物体的特性所用的方法及相关的工造细胞乃至生物体

3、的特性所用的方法及相关的工造细胞乃至生物体的特性所用的方法及相关的工作。作。作。作。第4页/共110页基因工程的目的基因工程的目的分离获得某一感兴趣的基因或分离获得某一感兴趣的基因或DNADNADNADNA获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）第5页/共110页第一节工 具 酶第6页/共110页一、限制酶一、限制酶定义定义是是一一类类内内切切核核酸酸酶酶，又又称称限限制制性性核核酸酸内内切切酶酶。能能够够识识别别双双链链DNA内内部部特特异异序序列列,并并在在识识别别位位点点或或其周围切割双链其周围切割双链DNA。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC G

4、+Bam H第7页/共110页作用作用与与甲甲基基化化酶酶共共同同构构成成细细菌菌的的限限制制修修饰饰系系统统，限限制制外外源源DNA，保保护护自自身身DNA。分类分类、（基因工程技术中常用（基因工程技术中常用型）型）第8页/共110页分类分类型型型型型型限限 制制-修修 饰饰 活活 性性 限制和修饰活性限制和修饰活性限制酶与修饰酶分限制酶与修饰酶分开开限制和修饰活性限制和修饰活性蛋蛋 白白 质质 结结 构构 三种不同亚基三种不同亚基相同亚基相同亚基二种不同亚基二种不同亚基辅辅助助因因子子 Mg Mg 2+2+、ATPATP、SAMSAMMg Mg 2+2+Mg Mg 2+2+、ATPATP、

5、SAM*SAM*切切割割位位点点 非特定，在识别非特定，在识别位点下游位点下游100-100-1000bp 1000bp 特定，在识别位点特定，在识别位点内，切割位点的序内，切割位点的序列可知、固定列可知、固定 切割位点难预测，切割位点难预测，在识别位点附近在识别位点附近1.1.限制酶的分类限制酶的分类第9页/共110页第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。用罗马数字表示发现的先后次序。2.2.限制酶的命

6、名Hin d 属属 系系 株株 序序Haemophilus influenzae Rd株株流感嗜血杆菌流感嗜血杆菌d株的第三种酶株的第三种酶第10页/共110页类酶识别序列特点类酶识别序列特点 回文结构回文结构(palindrome)切口切口 ：平端切口平端切口、粘端切口粘端切口GGGGA AT TCCCCCCCCT TA AGGGG3.3.限制酶的识别和切割位点第11页/共110页第12页/共110页第13页/共110页4.4.同功异源酶同功异源酶GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC G+Bam HGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC G+Bst 来源不同的限制酶，但能识

7、别和切割同一位点，这些酶称同功异源酶。第14页/共110页有有些些限限制制性性内内切切酶酶虽虽然然识识别别序序列列不不完完全全相相同同，但但切切割割DNADNA后后，产产生生相相同同的的粘粘性性末末端端，称称为为同同尾尾酶酶。这两个相同的粘性末端称为这两个相同的粘性末端称为配伍未端。配伍未端。Bam Bam HHBg Bg ll GGATCC CCTAGG AGATCT TCTAGAGCCTAG GATCC G+ATCTAG GATCT A5.5.同尾酶第15页/共110页限制酶 识别序列及切口 限制酶 识别序列及切口 Alu AG/CT Hind A/AGCTTAlu AG/CT Hind

8、A/AGCTT TC/GA TTCGA/A TC/GA TTCGA/A BamH G/GATCC Sal G/TCGAC BamH G/GATCC Sal G/TCGAC CCGAG/G CAGCT/G CCGAG/G CAGCT/G Bgl A/GATCT Sma CCC/GGG Bgl A/GATCT Sma CCC/GGG TCTAG/A GGG/CCC TCTAG/A GGG/CCC EcoR G/AATTC EcoR G/AATTC CTTAA/G CTTAA/G常用限制性核酸内切酶酶切序列常用限制性核酸内切酶酶切序列第16页/共110页单酶切单酶切 用一种限制酶 酶切目的基因 和载

9、体 易发生自身连 接双酶切双酶切 用二种限制酶 酶切目的基因 和载体 不易发生自身 连接限制性核酸内切酶酶切方法限制性核酸内切酶酶切方法第17页/共110页二、修饰酶 DNA DNA DNA DNA聚合酶聚合酶 逆转录酶逆转录酶 T4DNAT4DNAT4DNAT4DNA连接酶连接酶 碱性磷酸酶碱性磷酸酶 末端脱氧核苷酸转移酶末端脱氧核苷酸转移酶第18页/共110页DNADNA聚合酶聚合酶 是从E.coliE.coli中第一个发现的DNADNA聚合酶 催化活性 5353聚合酶活性；5353和 3 53 5外切酶活性 应用 在用切口平移法标记DNADNA探针时，常用此酶。第19页/共110页Kle

10、now Klenow 片段片段定义：用枯草杆菌蛋白酶可将DNADNA聚合酶裂解为大小两个片段，大片段称为KlenowKlenow片段。催化活性：5353聚合酶活性；3 53 5外切酶活性应用：补齐双链DNADNA的33末端；通过补齐33末端而对其进行标记；在cDNAcDNA克隆中，催化第二条链的合成；DNADNA序列的分析。第20页/共110页逆转录酶逆转录酶常用两种类型 禽类成骨细胞性白血病病毒(AMV)逆转录酶 Moloney小鼠白血病病毒(MMLV)逆转录酶催化活性 催化以RNA为模板合成cDNA，合成方向53应用 以mRNA为模板合成cDNA，构建cDNA文库第21页/共110页T4

11、DNAT4 DNAT4 DNAT4 DNA连接酶连接酶 催化双链DNADNA中相邻的55磷酸基和33羟基末端之间形成磷酸二酯键，使DNADNA切口封合或使两个DNADNA分子或片段连接。碱性磷酸酶碱性磷酸酶切除DNADNA或RNA5RNA5末端磷酸基，从而防止载体自连。第22页/共110页末端脱氧核苷酸转移酶末端脱氧核苷酸转移酶催化活性 将脱氧核苷酸加到DNADNA的33羟基末端。应用 主要用于探针标记；在载体或待克隆片段上进行同质多聚物加尾第23页/共110页第二节载 体第24页/共110页定义定义为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的

12、一些有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。分子。以大肠杆菌为宿主细胞的载体以大肠杆菌为宿主细胞的载体质粒质粒噬菌体噬菌体粘粒粘粒M13噬菌体噬菌体第25页/共110页载体的条件可自主复制可自主复制有多克隆位点，常具有多个单一酶切位点，称多有多克隆位点，常具有多个单一酶切位点，称多克隆位点；克隆位点；带一个以上的筛选的标志，便于重组体的筛选和带一个以上的筛选的标志，便于重组体的筛选和鉴定；鉴定；分子小（分子小（10 Kb10 Kb10 Kb10 Kb）以容纳较大的外源）以容纳较大的外源DNADNADNADNA片段；片段；有足够的有足够的copycopycopycopy数数第26页/共110页克隆

13、载体表达载体 原核表达载体 真核表达载体报告载体 载体的分类第27页/共110页n n外源基因不表达外源基因不表达n n早期使用的克隆载体的典型代表早期使用的克隆载体的典型代表n npBR322pBR322pBR322pBR322，目前已较少使用，多被用作构建新克，目前已较少使用，多被用作构建新克隆载体的起始材料隆载体的起始材料n npUC pUC pUC pUC 由由pBR322pBR322pBR322pBR322的氨苄青霉素抗性基因和复制子的氨苄青霉素抗性基因和复制子与大肠杆菌与大肠杆菌 -半乳糖苷酶半乳糖苷酶 （lacZlacZlacZlacZ ）基因融基因融合而成合而成1.1.克隆载体

14、第28页/共110页2.2.表达载体n n含有强启动子的载体含有强启动子的载体n n外源基因可在启动子的控制下转录成外源基因可在启动子的控制下转录成mRNAmRNAmRNAmRNA，并最，并最终以蛋白质的形式在宿主细胞中表达。终以蛋白质的形式在宿主细胞中表达。1.1.1.1.原核表达载体原核表达载体2.2.2.2.真核表达载体真核表达载体第29页/共110页 3.3.报告载体 以一种易于用生化方法检测的基因作为报告基因，以一种易于用生化方法检测的基因作为报告基因，通过其表达强度的高低来研究外源调控因子（如启通过其表达强度的高低来研究外源调控因子（如启动子、增强子等）的功能。动子、增强子等）的功

15、能。常用的报告基因常用的报告基因pGL2 pGL2：萤火虫荧光素酶pCAT pCAT：氯霉素乙酰转移酶pSEAPpSEAP：分泌型人胎盘碱性磷酸酶第30页/共110页（一）质粒（一）质粒存在于细菌染色体外的小型环状存在于细菌染色体外的小型环状DNADNADNADNA分子。分子。分子量小，能在细菌中稳定存在，有较高的拷贝数。带有抗性基因及表型识别等带有抗性基因及表型识别等遗传性标记物遗传性标记物。具有多个限制酶的单一切点，称为具有多个限制酶的单一切点，称为多克隆位点。多克隆位点。只能容纳只能容纳小于小于10kb10kb10kb10kb的外源的外源DNADNADNADNA片段片段一、常用的克隆载体

16、第31页/共110页第32页/共110页第33页/共110页第34页/共110页（二）噬菌体 是一类细菌病毒的总称，即感染细菌的病毒。是一类细菌病毒的总称，即感染细菌的病毒。是一类细菌病毒的总称，即感染细菌的病毒。是一类细菌病毒的总称，即感染细菌的病毒。按其生活周期可分为：溶菌性和溶原性噬菌体两按其生活周期可分为：溶菌性和溶原性噬菌体两按其生活周期可分为：溶菌性和溶原性噬菌体两按其生活周期可分为：溶菌性和溶原性噬菌体两种类型。种类型。种类型。种类型。常用作基因工程载体的噬菌体：常用作基因工程载体的噬菌体：常用作基因工程载体的噬菌体：常用作基因工程载体的噬菌体：噬菌体和噬菌体和噬菌体和噬菌体和M

17、13M13M13M13噬噬噬噬菌体。菌体。菌体。菌体。第35页/共110页第36页/共110页 噬菌体载体50kb+LARALARAEcoR EcoR lacZcI第37页/共110页第38页/共110页（三）粘性质粒（柯斯质粒）是一类人工构建的由质粒复制子和是一类人工构建的由质粒复制子和噬菌体的噬菌体的coscoscoscos粘性粘性末端构建的特殊类型的质粒载体。末端构建的特殊类型的质粒载体。特点 含有质粒的抗药性标记和自主复制成份 含有噬菌体的粘性末端 具有一个或多个限制酶的酶切位点 本身分子量小，可容纳40kb40kb左右的DNADNA片段 非重组体粘性质粒很小，不能在体外包装第39页/

18、共110页第40页/共110页（四）M13噬菌体是一种大肠杆菌噬菌体感染细菌后，经复制转变为双链的复制型DNA（RF DNA），RF DNA可作克隆载体。噬菌体颗粒中所含的DNA为单链DNA应用 作为模板用于DNA序列分析 制备成DNA探针用于杂交分析、检测DNA或RNA第41页/共110页质粒质粒质粒质粒噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体粘性质粒粘性质粒粘性质粒粘性质粒M13M13M13M13噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体克隆容量克隆容量克隆容量克隆容量10kb10kb10kb10kb22kb22kb22kb22kb40-50kb40-50kb40-50kb40-50kb1kb1kb1kb1kbgDNAgD

19、NAgDNAgDNA文库文库文库文库-+-cDNAcDNAcDNAcDNA文库文库文库文库+-亚克隆亚克隆亚克隆亚克隆+-+序列分析序列分析序列分析序列分析+-+E.ColiE.ColiE.ColiE.Coli表达表达表达表达+-几种常用克隆载体的比较第42页/共110页酵母人工染色体酵母人工染色体(yeast artificial chromosome,YAC)细菌人工染色体细菌人工染色体(bacterial artificial chromosome,BAC)动物病毒动物病毒DNA改造的载体改造的载体（如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）（如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）第43页/

20、共110页二、表达载体 表达载体是用来在受体细胞中表达外源基因的载体。这类载体除具备克隆载体的性质外，还带有表达构件转录和翻译所必需的DNA序列。第44页/共110页（一）大肠杆菌表达载体 启动子：tac启动子、噬菌体PL启动子和T7噬菌体启动子。核糖体结合位点（RBS）转录终止序列第45页/共110页（二）哺乳动物表达载体启动子/增强子终止信号加尾信号第46页/共110页第三节重组DNADNA技术的基本过程第47页/共110页基因工程的基本技术路线基因工程的基本技术路线分（离目的基因及载体）分（离目的基因及载体）分（离目的基因及载体）分（离目的基因及载体）切（割目的基因和载体）切（割目的基因

21、和载体）切（割目的基因和载体）切（割目的基因和载体）接（连目的基因和载体）接（连目的基因和载体）接（连目的基因和载体）接（连目的基因和载体）转（化宿主细胞）转（化宿主细胞）转（化宿主细胞）转（化宿主细胞）筛（选阳性克隆）筛（选阳性克隆）筛（选阳性克隆）筛（选阳性克隆）表（达目的基因）表（达目的基因）表（达目的基因）表（达目的基因）第48页/共110页 目的基因目的基因基因载体基因载体重组体重组体切接转筛总总体体技技术术路路线线分第49页/共110页第50页/共110页（一）目的基因及载体的分离分1 1 目的基因的获取目的基因的获取需要克隆的DNA片段 cDNA文库基因组DNA文库聚合酶链式反应

22、化学合成法第51页/共110页1 1）化学合成法）化学合成法较短的基因（较短的基因（60-80bp60-80bp）用途：用途：PCRPCR引物引物 测序引物测序引物 定点突变定点突变 核酸杂交探针核酸杂交探针第52页/共110页*化学合成法获取目的基因化学合成法获取目的基因由已知氨基酸序列推测可能的由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列序列第53页/共110页2 2）基因文库）基因文库限制性限制性内切酶内切酶克隆、转化、培养、鉴定克隆、转化、培养、鉴定基因组基因组DNADNA基因文库基因文库第54页/共110页基因组DNA文库限制性内切酶限制性内切酶基因组DNA基因重组基因重组转化细菌转化细菌体

23、外包装体外包装第55页/共110页组织或细胞染色体组织或细胞染色体DNA基因片断基因片断克隆载体克隆载体重组重组DNA分子分子含重组分子的转化菌含重组分子的转化菌限制性内切酶限制性内切酶受体菌受体菌基因组基因组DNA文库文库存在于转化细胞内存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所由克隆载体所携带的所有基因组有基因组DNA的集合的集合*从基因组从基因组DNA文文库获取目的基因库获取目的基因第56页/共110页cDNA文库的组建：基因重组基因重组反转录酶mRNAcDNA第57页/共110页限制酶切位点限制酶切位点限制酶消化限制酶消化 除去中间片段除去中间片段cos LR coscos L左臂左臂R c

24、os右臂右臂真核生物染真核生物染色体色体DNA限制酶部分消化限制酶部分消化 外源外源DNA与载体与载体DNA混合混合 连接反应连接反应 体外包装体外包装 用重组噬菌体用重组噬菌体感染大肠杆菌感染大肠杆菌 20 Kb DNA 片段片段 cos LR cos20 Kb 外源外源 DNA 片段片段 基因文库基因文库第58页/共110页mRNA cDNA 双链双链cDNA 重组重组DNA分子分子 cDNA文库 反转录酶反转录酶 载体载体 受体菌受体菌 复制复制*从从cDNA文库获取目的基因文库获取目的基因 逆转录酶逆转录酶A A A A T T T T AAAASISI核酸酶核酸酶 DNA聚合酶聚合酶

25、碱水解碱水解 T T T T第59页/共110页引物引物35553 3）PCRPCR技术技术基因组第60页/共110页2 2 载体DNADNA的选择功能：为目的基因提供进入受体细胞的转移能力。为目的基因提供在受体细胞中的复制能力或整合能力。为目的基因提供在受体细胞中的扩增和表达能力。第61页/共110页目的基因目的基因整合在宿主细胞整合在宿主细胞染色体染色体DNADNA中中独立于宿主细胞独立于宿主细胞染色体染色体DNADNA外外（独立的复制子功能独立的复制子功能）基因载体第62页/共110页（二）限制性内切（二）限制性内切酶酶切酶酶切切酶切第63页/共110页接（三）目的基因与载体的连接（三）

26、目的基因与载体的连接磷酸二酯键的形成DNADNA连接酶连接酶DNADNA连接酶连接酶DNADNA连接酶连接酶第64页/共110页连接方式：粘性末端连接平头末端连接同聚物加尾连接人工接头连接 第65页/共110页1.1.粘性末端连接粘性末端连接方式方式同一限制酶切位点连接同一限制酶切位点连接不同限制酶切位点连接不同限制酶切位点连接第66页/共110页Bam H切割反应切割反应 GGATCC CCTAGGT4 DNA连接酶连接酶15CGATCC GGCCTAG+目的基因用目的基因用 Bam H切割切割载体载体DNA用用Bam H切割切割重组体重组体载体自连载体自连目的基因自连目的基因自连同同一一限

27、限制制酶酶切切位位点点连连接接第67页/共110页不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接Eco R切割位点切割位点Bg l切割位点切割位点+EcoR+Bg l双酶切双酶切Eco R+Bg l双酶切双酶切T4 DNA连接酶连接酶15C重组体重组体配伍末端的配伍末端的连接情况和同一连接情况和同一限制酶切位点连限制酶切位点连接相似。接相似。第68页/共110页2.2.平头末端连接平头末端连接适用于适用于限制性核酸内切酶切割产生的平端限制性核酸内切酶切割产生的平端粘端补齐或切平产生的平端粘端补齐或切平产生的平端第69页/共110页目的基因目的基因载体载体限制性内切酶限

28、制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶T4 DNA连接酶连接酶15C重组体重组体载体自连载体自连目的基因目的基因 自连自连第70页/共110页3.同聚物加尾连接同聚物加尾连接在末端转移酶在末端转移酶(terminal transferase)的作用的作用下，在下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。粘性末端，再进行粘端连接。第71页/共110页5335载体载体DNA5335目的基因目的基因限制酶或机械剪切限制酶或机械剪切限制酶限制酶 53 35 5 3 T(T)nT T(T)nT 35 5 3 35 5 3 A(A)nA A(A)nA 35

29、-核酸外切酶-核酸外切酶末端转移酶末端转移酶+dATP末端转移酶末端转移酶+dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nA T(T)nTT4 DNA连接酶连接酶15C重组体重组体第72页/共110页4.4.人工接头人工接头(linker)连接连接由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接除产生粘性末端，而进行粘端连接。第73页/共110页人人工工接接头头及及其其应应用用CCGAATTCG GGCTTAAGC5-3-Eco REco REco REco R第74页/共110页转（四）重组体导入受体细胞（四）重组体导入受体细胞受体细胞第75

30、页/共110页受体菌条件受体菌条件安全宿主菌安全宿主菌 限制酶和重组酶缺陷限制酶和重组酶缺陷处于感受态处于感受态(competent)导入方式导入方式转化转化(transformation)转染转染(transfection)感染感染(infection)第76页/共110页1.1.原核细胞的转化（细菌转化）原核细胞的转化（细菌转化）1)1)受体细胞的选择限制缺陷型限制缺陷型:避免修饰和降解避免修饰和降解重组缺陷型：避免重组整合重组缺陷型：避免重组整合转化亲和型：较高的可转化性转化亲和型：较高的可转化性遗传互补型：利于筛选遗传互补型：利于筛选感染缺陷型：防止感染感染缺陷型：防止感染第77页/共

31、110页2 2）转化方法）转化方法CaCl2诱导转化电穿孔特殊处理受体细胞细胞膜特性改变第78页/共110页CaClCaCl2 2处理处理受体细菌受体细菌50-100mmol/LCaCl2 感受态感受态细菌细菌重组体转重组体转入细菌入细菌0-5第79页/共110页2.2.感染感染 以噬菌体、粘性质粒和真核细胞病毒为载体的重组DNA分子，在体外经过包装成具有感染能力的病毒或噬菌体颗粒，才能感染适当的细胞，并在细胞中扩增。第80页/共110页第81页/共110页基因重组感染感染体外包装噬菌体噬菌体体外包装噬菌体体外包装第82页/共110页2.2.转染转染 转染是由转化和感染两个词构成的新词。指针和

32、细胞主动摄取或被动导入外源DNADNA片段而获得新的表型的过程。进入的细胞的DNADNA可以被整合至宿主细胞的基因组中，也可以在染色体外存在和表达。第83页/共110页筛(五）重组体克隆的筛选与鉴定 1.1.遗传学方法遗传学方法(1)(1)抗药性标记选择抗药性标记选择(2)(2)插入灭活法插入灭活法(3)(3)标志补救标志补救第84页/共110页(插插入入失失活活法法)抗抗药药性性标标记记选选择择第85页/共110页组氨酸缺陷组氨酸缺陷型大肠杆菌型大肠杆菌无组氨酸无组氨酸的培养基的培养基酵母咪唑甘油磷酵母咪唑甘油磷酸脱水酶基因酸脱水酶基因促进组氨酸合成促进组氨酸合成 DNADNA重组体重组体标

33、标志志补补救救第86页/共110页标志补救（标志补救（-互补）互补）lacZAmN2H 片段COOHCOOH 片段第87页/共110页X-gal-半乳糖苷酶半乳糖苷酶蓝色化合物X-gal在诱导剂IPTG存在下第88页/共110页（LacZLacZ基因基因 N N端序列）端序列）插入片段插入片段（LacZLacZ基因失活）基因失活）LacZLacZ酶酶第89页/共110页 2.2.免疫学方法免疫学方法 前提条件前提条件:克隆基因的产物是已知的，并且在克隆基因的产物是已知的，并且在受体菌中表达。受体菌中表达。(1)(1)放射免疫放射免疫(2)(2)化学发光法化学发光法(3)(3)显色反应显色反应第

34、90页/共110页鸡的鸡的肌球蛋白的克隆和检出肌球蛋白的克隆和检出第91页/共110页 3.3.核酸杂交法核酸杂交法 对噬菌或菌落进行原位杂交是从基因组对噬菌或菌落进行原位杂交是从基因组文库、文库、cDNAcDNA文库或重组质粒中筛选目的基因文库或重组质粒中筛选目的基因的最有效的方法之一。的最有效的方法之一。第92页/共110页第93页/共110页 4.PCR4.PCR技术技术 PCRPCR技术具有高度的灵敏度和特异性，能技术具有高度的灵敏度和特异性，能在短时间内将目的基因扩增至数百万倍，通在短时间内将目的基因扩增至数百万倍，通过琼脂糖凝胶电泳，可以直接观察到产物的过琼脂糖凝胶电泳，可以直接观

35、察到产物的存在。存在。第94页/共110页电泳检测法电泳检测法加样孔DNA MarkerDNA Marker空质粒空质粒重组质粒重组质粒 重组质粒酶切重组质粒酶切重组质粒的重组质粒的PCRPCR扩增片段扩增片段第95页/共110页 5.5.酶切鉴定酶切鉴定 提取质粒提取质粒DNADNA，用一个或两个限制酶消化，用一个或两个限制酶消化质粒质粒DNADNA，通过琼脂糖凝胶电泳，观察有无插，通过琼脂糖凝胶电泳，观察有无插入片段，以及插入片段大小，插入方向。限入片段，以及插入片段大小，插入方向。限制酶的选用应根据载体和插入片段上的酶切制酶的选用应根据载体和插入片段上的酶切位点来定。位点来定。第96页/

36、共110页第97页/共110页（六）外源基因在宿主细胞中的表达重组子目的基因的mRNA表达蛋白质大肠杆菌（E.coliE.coli）受体细胞表第98页/共110页1 1 克隆基因在大肠杆菌中的表达优势：一种成熟的基因克隆表达的受体细胞 繁殖迅速，培养代谢易于控制 易于进行遗传操作和高效表达第99页/共110页不足之处：1）缺乏适当的转录后和翻译后加工机制。2）缺乏表达蛋白质复性系统，表达蛋白无特异性空间结构。3）表达产物不稳定，易被细菌蛋白酶降解。第100页/共110页基本要素1.1.目的基因目的基因目的基因如果来自真核细胞必须是目的基因如果来自真核细胞必须是cDNAcDNAcDNA cDNA

37、 起始密码子上游部分必须除去起始密码子上游部分必须除去对于分泌蛋白，应除去信号肽部分对于分泌蛋白，应除去信号肽部分 第101页/共110页2.2.载体的选择载体的选择必须是大肠杆菌表达载体，含有大肠杆菌必须是大肠杆菌表达载体，含有大肠杆菌RNARNA聚合酶所能识别的启动子和聚合酶所能识别的启动子和SDSD序列序列启动子应具备的条件：一是转录效应强；启动子应具备的条件：一是转录效应强；二是可以被有效地控制。二是可以被有效地控制。第102页/共110页3.3.目的基因和载体的连接目的基因和载体的连接将目的基因的将目的基因的55端连接在端连接在SDSD序列的序列的33端下游端下游两种连接方式两种连接

38、方式 (1)(1)以限制酶以限制酶NdeNde或或NcoNco位点引入位点引入ATG，构，构建一个建一个NdeNde(CAT(CATATGATG)或或NcoNco(CC(CCATGATGG)G)位点位点 (2)(2)融合蛋白融合蛋白第103页/共110页4.4.受体菌株和诱导条件受体菌株和诱导条件选择表达效率最高的受体菌株选择表达效率最高的受体菌株诱导条件根据启动子类型和特定的蛋白质诱导条件根据启动子类型和特定的蛋白质而定而定第104页/共110页2 2 克隆基因在哺乳动物细胞中的表达基本要素必须将目的基因重组到适当的真核表达载体中可以使基因组DNADNA，也可以是cDNAcDNA针对特定的靶

39、细胞选择合适的启动子第105页/共110页3 3目的基因表达产物的检测1 1）蛋白质的PAGEPAGE对照 样品 MarkerMarker第106页/共110页2 2）表达蛋白生物学功能检测淀粉酶基因表达第107页/共110页4 4目的蛋白的分离纯化分子筛亲和柱离子交换抗原抗体目的蛋白第108页/共110页基因载体基因载体目的基因目的基因 质粒质粒质粒质粒 噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体 病毒病毒病毒病毒 PCR cDNA PCR cDNA PCR cDNA PCR cDNA 人工合成人工合成人工合成人工合成 基因文库基因文库基因文库基因文库限制性内切酶限制性内切酶有切口的载体有切口的载体有切口的目的基因有切口的目的基因DNADNA连接酶连接酶 重组体重组体 转化转化转化转化 转染转染转染转染 感染感染感染感染带重组体的宿主细胞带重组体的宿主细胞 遗传学方法遗传学方法遗传学方法遗传学方法 免疫学方法免疫学方法免疫学方法免疫学方法 核酸杂交核酸杂交核酸杂交核酸杂交 PCRPCRPCRPCR技术技术技术技术 酶切鉴定酶切鉴定酶切鉴定酶切鉴定 目的基因的表达第109页/共110页感谢您的观看。第110页/共110页