基因工程常用技术.pptx

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1、质粒DNA的提取是基因工程操作中最基本的技术，最常用的是碱裂解法。一、质粒DNA的提取第1页/共121页在强碱性溶液中，DNA双链的氢键断裂变性；当溶液恢复中性时，DNA双链复性。（一）碱裂解法提取质粒DNA1、原理第2页/共121页3在变性后双链不分离、复性快。共价闭合环状的质粒DNA：第3页/共121页4强碱性变性后双链分离、难以复性而形成缠绕结构，与蛋白质-SDS复合物结合在一起，离心时沉淀。线性染色体DNA：第4页/共121页2、碱裂解法质粒DNA提取的步骤 1）溶菌使用“溶液I”溶解细菌细胞壁。溶液I：50mM葡萄糖25mMTris-HCl(pH8.0)10mMEDTA4-5mg/m

2、l溶菌酶第5页/共121页6葡萄糖：增加溶液粘度，维持渗透压，防止DNA受机械力的作用而降解（震荡）。EDTA：Mg2+、Ca2+螯合剂，抑制DNase活性，防止DNA被降解。第6页/共121页7溶菌酶：为糖苷水解酶，能水解菌体细胞壁的主要化学成分-肽聚糖中的-1,4糖苷键，具有溶菌作用。第7页/共121页2）变性加入“溶液II”，使细菌细胞膜破坏、使蛋白质和DNA变性。溶液II：0.2NNaOH（10N贮存液现用现稀释）1%SDS第8页/共121页9NaOH：是强碱，提供pH12的碱性条件，使DNA双链变性。是离子型表面活性剂，溶解细胞膜和细胞内蛋白，并结合成“蛋白质-SDS”复合物，使蛋白

3、质（包括DNase）变性沉淀。SDS：第9页/共121页103）中和加入“溶液III”使DNA复性、蛋白质-SDS复合物和染色体DNA、RNA沉淀。溶液III：5NKAc60ml冰HAc11.5ml水8.5ml第10页/共121页11KAc：用冰HAc把KAc溶液的pH调到4.8，以中和NaOH变性液，使DNA复性。高浓度KAc有利于变性的大分子染色体DNA、RNA、蛋白质-SDS复合物沉淀。冰HAc：第11页/共121页12上清液中含有质粒DNA。4）离心去除沉淀第12页/共121页5）纯化DNA酚-氯仿-异戊醇（25:24:1）抽提或柱层析。第13页/共121页14酚：比重大，能加速有机相

4、与水相分层，减少残留在水相中的酚。蛋白变性剂，进一步抽提DNA溶液中的蛋白质，使蛋白质沉淀。防止抽提时振荡起泡。氯仿：异戊醇：第14页/共121页152倍体积的无水乙醇沉淀DNA。6）沉淀DNADNA分子以水合状态“溶于”水里，乙醇能夺去DNA分子的水环境。第15页/共121页1670%乙醇洗涤DNA，干燥。7）洗涤8）贮存用含RNaseA(20g/ml)的TE溶解DNA，贮存于-20。第16页/共121页17TE：由Tris-HCl缓冲液和EDTA配制。EDTA抑制DNase，防止DNA被酶降解。Tris-HCl不含金属离子（不同于磷酸或硼酸缓冲液），利于后续操作。RNaseA：降解残留的R

5、NA。第17页/共121页许多公司研制出商品化质粒提取试剂盒，原理大多依照碱裂解法，但在纯化步骤上采用柱层析。第18页/共121页193、影响质粒DNA产量的因素质粒的产量受提取过程中各因素的影响，但最重要的是菌株的遗传背景和质粒自身的拷贝数。第19页/共121页一般使用endA基因突变的E.coli菌株，如DH5、JM109等。1）受体菌株endA基因编码核酸内切酶I，在Mg2+存在下，可将双链DNA消化为7bp的寡核苷酸片断。第20页/共121页21是直接决定DNA产量的重要因素之一。2）质粒拷贝数3）质粒大小分子量大的质粒拷贝数低。第21页/共121页常用质粒的理论产量pUC pGEMp

6、BR322ColE1pSC1012.7 kb2.7 kb4.4 kb4.5 kb9.0 kb500-700300-700 25 1562.9-4.11.8-4.10.320.150.12质粒分子大小拷贝数质粒产量（kb）（g/ml）第22页/共121页（二）DNA的定量和纯度测定1、紫外光谱法原理：基于DNA在260nm波长处有特异的紫外吸收峰（蛋白质在280nm处有吸收峰），用微量比色杯在紫外分光光度计直接测定。第23页/共121页在波长260nm紫外光下，1OD值的吸光度相当于双链DNA浓度为50g/ml。第24页/共121页25纯DNA样品：OD260/OD280=1.8 OD260/O

7、D230 2.0OD260/OD2302.0：有残存的盐和小分子杂质，如核苷酸、氨基酸、酚等。OD260/OD2801.9：有RNA污染；第25页/共121页26原理：利用溴化乙锭(EB)能插入DNA分子中，在紫外光照射下能发红色荧光，将其荧光强度与已知浓度的DNA(如DNAmarker)电泳条带对比，可估算出DNA含量。2、琼脂糖凝胶电泳估计第26页/共121页（三）DNA分子量的估计通过琼脂糖凝胶电泳，与已知分子量的DNAmarker对比得知。第27页/共121页二、核酸凝胶电泳技术（一）电泳的基本原理生物大分子在一定pH条件下，通常带电荷，将其置于电场中，会以一定的速度向与其电荷性质相反

8、的电极迁移，迁移速度称电泳速率。第28页/共121页29摩擦系数与分子的大小、构型及介质的粘度有关。电泳速率与电场强度、分子所带的净电荷数成正比，与分子与介质的摩擦系数成反比。第29页/共121页在生理条件下，DNA分子糖-磷酸骨架中的磷酸基团呈离子化状态，故DNA实际上呈多聚阴离子状态，在电场中向方向迁移。糖-磷酸骨架在结构上重复，故等量的双链DNA几乎带等量的净电荷。正极第30页/共121页31如电场强度一定、电泳介质相同，电泳速率就取决于核酸分子的大小和构型。构型相似的分子：分子量越大、迁移越慢。分子量相同的分子(如质粒)：cccDNA迁 移 最 快、L-DNA次 之、ocDNA最慢。第

9、31页/共121页32第32页/共121页第33页/共121页固体支持介质：琼脂糖(agarose)聚丙烯酰胺(polyarylamide)固体支持介质可形成复杂的网孔结构，DNA穿过这些网孔才能到达正极。分子量小、结构致密的DNA分子更易穿过网孔，泳动速度也越快。第34页/共121页（二）琼脂糖凝胶电泳 是一种线性多糖聚合物，从红色海藻产物琼脂中提取而来。琼脂糖：第35页/共121页36琼脂糖凝胶：琼脂糖在电泳液中加热到沸点后溶解，冷却后凝固成均匀的胶体“胨”，成为很好的电泳介质。第36页/共121页37琼脂糖浓度(%)分离DNA的范围(kb)0.35-600.61-200.70.8-100

10、.90.5-71.20.4-61.50.2-42.00.1-3琼脂糖浓度的高低决定凝胶孔隙的大小，浓度越高、孔隙越小、分辨率越高。第37页/共121页（三）聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺：由丙烯酰胺和N,N-甲叉双丙烯酰胺聚合而成。第38页/共121页39在过硫酸铵和TEMED存在时，丙烯酰胺单体形成长链，由N,N-甲叉双丙烯酰胺的双功能基团和链末端的自由基团反应而发生交联，形成聚丙烯酰胺。第39页/共121页为中枢神经毒物，尽量避免接触和吸入!过硫酸铵：催化过硫酸铵产生自由基，加速聚合。丙烯酰胺和N,N-甲叉双丙烯酰胺：碱性条件下产生自由基。TEMED(N,N,N,N-四甲基乙二铵)：第40页

11、/共121页41聚丙烯酰胺浓度(%)分离DNA的范围(bp)3.51000-20005.085-5008.060-40012.040-20015.025-15020.06-100聚丙烯酰胺浓度的高低决定凝胶孔隙的大小，浓度越高、孔隙越小、分辨率越高。第41页/共121页42聚丙烯酰胺凝胶的优点：比琼脂糖凝胶的分辨率高得多。0.3-2%琼脂糖凝胶电泳分辨率：60,000-100bp；3.5-20%聚丙烯酰胺凝胶电泳分辨率：2,000-6bp。第42页/共121页43（四）电泳缓冲液Tris-乙酸（TAE）Tris-硼酸（TBE）Tris-磷酸（TPE）TAE价格便宜，但缓冲容量低；TBE与TPE

12、缓冲容量高，分离效果好，但TPE在DNA片段回收时含磷酸盐浓度高，易使DNA沉淀。推荐使用第43页/共121页44EDTA可螯合二价阳离子，抑制DNase活性，防止DNA被降解。临用时用水稀至0.5TBE（20倍稀释）10TBE缓冲液的配制：Tris碱108g硼酸Boricacid55gEDTA9.3g加H2O至1L（调PH为8.0-8.2）第44页/共121页45（五）核酸电泳的指示剂与染色剂1、指示剂：常用溴酚兰，在碱性液体中呈紫兰色，在0.6%、1%、1.4%和2%琼脂糖凝胶电泳中，迁移率分别与1kb、0.6kb、0.2kb和0.15kb的双链线性DNA片段大致相同。第45页/共121页

13、46使样品呈色，便于加样操作；指示剂与蔗糖、甘油组成加样缓冲液。增加样品比重，确保DNA均匀沉入加样孔；在电泳中形成肉眼可见的指示带，可预测DNA电泳的速度和位置。加样缓冲液的作用：第46页/共121页47第47页/共121页482、染色剂：核酸电泳后，需经染色才能显出带型。溴化乙锭染色法银染色法第48页/共121页49溴化乙锭(ethidiumbromide,EB)能插入到DNA分子的相邻碱基之间，并在300nm波长的紫外光照射下发出红色荧光。1）溴化乙锭染色法：第49页/共121页50可将EB直接加到凝胶介质中（终浓度0.5g/ml）；也可在电泳后，将凝胶浸入该浓度的溶液中染色10-15m

14、in。EB与DNA分子结合，而不与凝胶结合，DNA分子吸收EB并发出荧光。第50页/共121页51琼脂糖凝胶EB染色后，在紫外光下观察，可检测出50ng的DNA。在适当染色条件下，荧光强度与DNA片段的数量成正比。第51页/共121页522、银染色法：Ag+可与核酸形成稳定的复合物，用还原剂(如甲醛)使Ag+还原成银颗粒，可将电泳条带染成黑褐色，用于聚丙烯酰胺凝胶染色。优点：灵敏度比EB高200倍。缺点：银染色后，DNA不宜回收。第52页/共121页聚丙烯酰胺凝胶电泳的银染结果银染10min银染15min第53页/共121页三、核酸分子杂交技术1968年，华盛顿卡内基学院的RoyBritten

15、及其同事发明。目的：用特异探针鉴定复杂靶DNA中的同源片段。第54页/共121页DNA与DNA杂交：A=T、GCDNA与RNA杂交：A=U、GC依据：碱基互补、变性和复性随温度逐渐降低，变性的两条单链重新形成互补双链。在高温下，核酸双链解为两条单链；碱基互补变性：复性：第55页/共121页利用核酸双链的碱基互补、变性和复性的原理，用已知碱基序列的单链核酸片段作为探针(probe)，与待测样本中的单链核酸互补配对，以判断有无互补同源核酸序列的存在。第56页/共121页（一）核酸探针指一段带有检测标记、与目的DNA片段特异互补、已知序列的核酸片段。探针长度一般以50-300bp为宜。第57页/共1

16、21页核酸探针的种类：放射性探针非放射性探针根据核酸性质不同，分为：RNA探针寡核苷酸探针DNA探针cDNA探针根据标记方法不同，分为：第58页/共121页寡核苷酸探针(oligonucleotideprobe)简并探针组成的寡核苷酸探针库6个氨基酸连续序列倒推基因序列人工合成单一已知序列的寡核苷酸探针已知序列人工合成第59页/共121页根据生物体对简并密码子的偏爱性，合成系列探针；简并探针的设计依据：参考生物体EST(expressedsequencetag)数据库，进行倾向性简并序列设计。EST：对一个随机选择的cDNA克隆，进行5端和3端单一次测序，获得的cDNA部分序列，代表一个完整基

17、因的一小部分，平均长度360120bp。第60页/共121页寡核酸探针的优点：序列短，杂交速度快、特异性强；可在短时间内大量制备；可在合成中进行标记；可合成单链探针，避免双链探针在杂交中自我复性，提高杂交效率；可检测靶序列内1个碱基的变化。第61页/共121页寡核苷酸探针的设计原则：长度18-50bp；分子内部不含互补区；GACCTAAAGCGGATCGTAGGTCGACCTACTGGATAAGCTGGGC AG+C含量40-60%；避免同一碱基连续出现（不能多于4个）；与非靶序列70%以上同源性、或连续8个以上碱基序列相同，最好不用。第62页/共121页631、标记物的种类：前者更敏感，但后

18、者保存时间较长，无同位素污染。非放射性：生物素、地高辛、荧光素等。放射性：32P、35S、125I等；（二）核酸探针的标记第63页/共121页缺刻平移法随机引物延伸法反转录标记法末端标记法2、探针标记方法：1）放射性同位素标记：第64页/共121页5G-C-T-GA-A-T-T-C-G-A-G33C-G-A-C-T-T-A-AG-C-T-C51）Klenow酶介导的3末端标记法：KlenowdNTPs（-32P-dATP）5G-C-T-G-A-A-T-TA-A-T-T-C-G-A-G33C-G-A-C-T-T-A-AT-T-A-A-G-C-T-C5末端标记法第65页/共121页665335AA

19、-32P-ddATPTdT552）TdT介导的3末端标记法：第66页/共121页3）T4-PNP介导的5末端标记法：5P3HOOH3P55HO3HOOH3OH5CIPT4-PNP-32P-ATP5P3HOOH3P5第67页/共121页682）非放射性同位素标记：酶促反应标记法化学修饰标记法第68页/共121页将标记物预先标记在核苷酸分子上，再利用酶促反应，将标记的核苷酸掺入探针中。酶促反应标记法1）标记物-dUTP的生成；（如Bio-11-dUTP、Dig-11-dUTP）2）将标记物-dUTP作为DNApolI的底物，掺入DNA分子中。第69页/共121页70Bio-11-dUTP：生物素(

20、Biotin)Biotin与dUTP之间连接臂的碳链长度。11：Bio：广泛存在于各种组织中，若样品本身含内源性生物素，会对结果产生干扰。第70页/共121页71Dig-11-dUTP：地高辛(digoxigenin)；Dig：洋地黄植物的花和叶是Dig在自然界中的唯一来源，抗Dig抗体不会与其他生物物质结合，可满足特异性标记的需要。从洋地黄植物中提取的类固醇物质。第71页/共121页地高辛系统标记：DIG-11-dUTPDIG抗体-显色酶交联复合物第72页/共121页化学修饰标记法利用标记物分子上的活性基团与探针分子上的基团发生的化学反应，将标记物直接结合到探针分子上。第73页/共121页A

21、BC荧光标记：荧光胺Avidin链亲和素GCTTGAGCAGTAACCTGBiotin生物素烷烃连接臂ABC：AvidinBiotinComplex第74页/共121页ABC显色酶标记：GCTTGAGCAGTAACCTGBiotin生物素烷烃连接臂显色酶生色底物颜色产物Avidin链亲和素ABC：AvidinBiotinComplex第75页/共121页（三）核酸分子杂交的分类待测核酸样本先结合到固相支持物（硝硝酸纤维素膜、尼龙膜等）上，再与溶液中的特异性探针进行杂交反应。待测核酸样本与特异性探针同时溶于杂交液中进行杂交反应。液相杂交：固相杂交：第76页/共121页液相核酸分子杂交第77页/共

22、121页固相核酸分子杂交制备待测核酸样品制备核酸探针分离、变性、转印、固定与杂交液预杂交标记漂洗去除未参与杂交的标记探针检测杂交信号杂交加入标记核酸探针预杂交：消除膜对探针的非特异性结合，降低杂交背景。第78页/共121页Southern印迹杂交Northern印迹杂交斑点杂交/狭缝杂交菌落杂交夹心杂交原位杂交常用固相核酸杂交方法第79页/共121页1、Southern印迹杂交 是将DNA分子从电泳凝胶转印到硝酸纤维素膜上，进行核酸杂交的一种实验方法。1975年，由 英 国 爱 丁 堡 大 学 的Edwen Southern创建，故称Southernblot。第80页/共121页提取DNA样本

23、限制酶酶切琼脂糖凝胶电泳分离NaOH变性DNA转印至膜上预杂交标记探针与之杂交放射自显影或显色反应检测杂交信号结果分析。Southernblot的基本过程：用DNA（或RNA）探针检测DNA样品。第81页/共121页82第82页/共121页水稻叶绿体DNA分别用BglII(A-C)、BamHI(D-F)、EcoRI(G-I)、HindIII(J-L)消化，琼脂糖凝胶电泳分离，然后与32P标记的玉米psbA探针Southern杂交，X光底片中显现阳性条带，表明含玉米psbA基因序列。第83页/共121页2、Northern印迹杂交1979年，等人发展而来，是将RNA分子从电泳凝胶转移到硝酸纤维素

24、膜上，进行核酸杂交的一种实验方法。方 法 与 Southern blot类 似，故 称Northern印迹杂交（Northernblot）。第84页/共121页提取RNA样本RNA变性琼脂糖凝胶电泳分离转印至膜上预杂交标记探针与之杂交放射自显影或显色反应检测杂交信号结果分析。Northernblotting的基本过程：用DNA（或RNA）探针检测RNA样品。第85页/共121页86第86页/共121页3、斑点杂交/狭缝杂交（spot/slotblothybridization）基本过程：将变性的DNA或RNA直接点到膜上，或通过一个长形狭缝转印至膜上膜变性预杂交标记探针与之杂交放射自显影或显色

25、反应检测杂交信号结果分析。第87页/共121页DNA样品使用特殊设计的加样装置，可使众多待测样品一次同步转印至杂交膜上，并有规律地排列成点阵或线阵。点样Probe-32P检测AB1234第88页/共121页89简便、快速、灵敏、样本用量少。特异性不高，有一定比例的假阳性。优点：缺点：第89页/共121页AB固相支持物固相吸附探针标记检测探针需两个靠近且不重叠的探针，一个作固相吸附探针，另一个作标记检测探针。4、夹心杂交(sanwich hybridization)第90页/共121页优点：样品不需固定，对粗制样品即能做出可靠的检测。特异性强，只有两个探针都杂交时，才能产生可检测的信号；第91页

26、/共121页92注意：为避免产生高本底信号，两探针必须分别克隆入两个非同源载体内，如一个克隆入PUC19，另一克隆入pBR322。第92页/共121页5、菌落杂交(colony hybridization)基本过程：将菌落从平板转移到硝酸纤维素膜上裂解菌落、释放DNA将DNA烘干固定于膜上标记的探针与之杂交放射自显影检测杂交信号与平板上的菌落对位。第93页/共121页用于从大量菌落中筛选含特异DNA序列的目的重组子。第94页/共121页6、原位杂交(insituhybridization,ISH)是一种可在细胞涂片、组织切片以及分裂中期染色体带中检测DNA或RNA的技术，可对组织细胞原位的待测

27、核酸分子进行定性、定量及定位分析。第95页/共121页96优点：不需提取核酸，可完整保持组织或细胞的形态，更准确地反映组织细胞的功能状态。FISH检测HER-2基因在乳腺癌组织中的表达FISH检测慢性粒细胞白血病的费城染色体(22和9号染色体异位)第96页/共121页是利用耐热DNA聚合酶的反复作用，通过变性-退火-延伸的循环操作，在体外迅速将DNA模板扩增数百万倍的一种操作技术。四、聚合酶链反应技术（polymerasechainreaction,PCR）第97页/共121页1、模板:（一）PCR反应系统的组成无论哪种DNA，都要有较高的纯度。质粒-DNA染色体DNA大小较小较大非常大目的基

28、因单拷贝变性易较难难用量lng300-500ng可以是DNA或RNA。第98页/共121页mRNAcDNAPCR，称为RT-PCR。逆转录RNA作为模板时，需要：RT-PCR：ReverseTranscriptionPCR第99页/共121页是根据模板DNA待扩增区两端的序列而设计的一对寡核苷酸小片断，长度一般为15-30bp，最多不超过50bp。3、引物2、TaqDNA聚合酶第100页/共121页引物设计的原则：长度适宜，一般15-30bp；G+C含量40-60；4种碱基应随机分布；内部不应存在互补序列；两条引物之间不应有多于4个碱基的互补；3端不应有任何修饰；5端可修饰，如32P、生物素、

29、荧光素。第101页/共121页上游引物5端：起始密码子ATG；注意：下游引物5端：终止密码子TAA、TAG或TGA；上、下游引物5端：限制酶识别序列及其保护碱基。第102页/共121页1035GGAATTCCCTATGACCCAG3不同限制酶需保护碱基的数量不同，如：EcoRI1HindIII3 BamHI2-3 PstI4保护碱基数量不合适，会影响限制酶酶切。保护碱基第103页/共121页4、dNTPs 终浓度：50mol/L，4种dNTPs浓度应相等。注意：不稳定，保存时间长会失效.第104页/共121页1）不同的酶需不同Mg2+：5、Mg2+：Taq酶：0.5-1.5mM；pfu酶：2-

30、3mM；dNTP、引物用量约增加1倍。第105页/共121页106EDTA鳌合Mg2+；选择低浓度TE(10mMTris,1mMEDTA)；如扩增效率不理想，注意调整Mg2+浓度！2）外界影响：DNA模板、引物、dNTPs的磷酸基团均可结合Mg2+。第106页/共121页模板DNA0.1-2g引物各10-100pmolTaq酶2.5U4种dNTP混合物各200mol/LMg2+1.5mmol/LddH2O标准的PCR反应体系：100L第107页/共121页1、变性温度：（二）PCR参数94-95，一般30-45sec。模板DNA完全变性对RCR能否成功至关重要。可95加热3-5min预变性。第

31、108页/共121页1092、退火温度：Tm：50的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度，为退火温度的参考依据。Tm=4(G+C)+2(A+T)退火温度介于55-72之间，一般选择Tm-5；选择较高的退火温度，可减少引物与模板非特异性结合，提高PCR的特异性。第109页/共121页1103、延伸温度：72，一 般 40-60sec。72时，Taq酶处于最高的活力状态，反应速率约35-100nt/s。延伸时间视扩增片段的长短而定，如扩增1-2kb的PCR产物，延伸1min已足够。第110页/共121页1114、循环次数取决于模板浓度，一般选择30次。分析性PCR一般25-30次，制备性PC

32、R一般30-35次，不超过40次。循环次数太多会使非特异性产物增加。第111页/共121页112常采用的PCR条件：95变性30sec55退火30sec72延伸1min30-35cycles72保温10min95预变性5min4终止forever第112页/共121页五、DNA序列分析技术目前用于测序的主要技术：双脱氧链末端终止法化学降解法第113页/共121页双脱氧链末端终止法1977年，英国剑桥大学FrederickSanger发明。1）在单链模板、引物、4种dNTPs存在时，Klenow酶能不断地将dNTP加到引物3-OH末端，合成出与单链模板互补的新链。基本原理：第114页/共121页

33、2）Klenow酶还能以ddNTP作为底物，使之掺入正在延伸的DNA链中，但因ddNTP缺少3-OH，无法和下一个核苷酸之间形成磷酸二酯键，故在ddNTP掺入位置，链延长终止。脱氧核苷三磷酸（dNTP）双脱氧核苷三磷酸（ddNTP）第115页/共121页116双脱氧末端终止测序法的基本操作：ACGTssDNAssDNAssDNAssDNAPrimerPrimerPrimerPrimerKlenowKlenowKlenowKlenowdNTPsdNTPsdNTPsdNTPsddATPddCTPddGTPddTTPDNA聚合反应-32P-dATP-32P-dATP-32P-dATP-32P-dATP第116页/共121页117OH35PKlenowTdNTPs+-32P-dATP+ddATPTTTTTOH35PDNA聚合反应AG TC聚丙烯酰胺凝胶电泳5GGCATTGCGTTACTAGTCCAGTACA3第117页/共121页第118页/共121页第119页/共121页3730全自动测序仪第120页/共121页121感谢您的观看。第121页/共121页