实验大肠杆菌的培养与分离课件.pptx

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1、生物工程发展史生物工程发展史1、传统生物技术、传统生物技术如酿酒、制作酸奶、污水处理、垃圾处理如酿酒、制作酸奶、污水处理、垃圾处理第1页/共48页2、现代生物技术、现代生物技术利用大肠杆菌生产胰岛素、生长激素、促红细胞生成素等药品。利用大肠杆菌生产胰岛素、生长激素、促红细胞生成素等药品。第2页/共48页现代生物工程包括现代生物工程包括:细胞工程、发酵工程、酶工程、蛋白质工程、基因工程第3页/共48页基因工程：剔除或改变有害基因，引入正确基因或有利基因。基因工程：剔除或改变有害基因，引入正确基因或有利基因。第4页/共48页第一部分:微生物的应用第5页/共48页特点：结构都相当简单,个体多数十分微

2、小.通常要用光学显微镜或电子显微镜才能看到，有的甚至没有细胞结构.微生物病毒细菌放线菌真菌原生动物 原核生物 原生生物真菌一、基础知识：一、基础知识：(一一)微生物微生物：是一切肉眼看不见或看不清楚的微小生物的总称第6页/共48页(二)细菌的常识1、结构2、分裂3、生殖4、在基因工程中的应用第7页/共48页大肠杆菌第8页/共48页细菌的外形与大小细菌的外形与大小大肠杆菌属于杆状菌图1-1常见的三种细菌典型形态A.球菌B.杆菌C.螺旋菌第9页/共48页根据细菌所利用的根据细菌所利用的能源和碳源能源和碳源的不同将细菌分为两大营养类型。的不同将细菌分为两大营养类型。自养菌自养菌:异养菌异养菌:细菌的

3、营养类型细菌的营养类型 光能自养型:光合细菌化能自养型:硝化细菌,铁细菌,硫细菌大肠杆菌属于异养兼性厌氧菌第10页/共48页单个或少数细菌在单个或少数细菌在固体培养基固体培养基上大量繁殖时，就会形成一个肉眼可见的，具有一上大量繁殖时，就会形成一个肉眼可见的，具有一定形态结构的定形态结构的子细胞群体子细胞群体，叫做菌落，叫做菌落。菌落的形态是菌落的形态是鉴定菌种鉴定菌种的重要依据。的重要依据。菌落第11页/共48页细菌的革兰氏染色革兰氏染色法是一种用于细菌的染色法。此法将细菌分为两类，即革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。所谓革兰氏阳性菌就是用革兰氏染液染色后，再用脱色液处理，细菌仍保留染色液的颜色；革

4、兰氏阴性菌则相反。这两种菌的差别在于细胞壁的成分不同。大肠杆菌属于革兰氏阴性菌第12页/共48页培养基培养基（培养液）是由人工方法配制而成的，专供微生物生长繁殖使用的混合营养液。1.培养基的类型(三)细菌的培养成分区别：有无琼脂液体培养基：扩增细菌（培养），工业生产固体培养基：纯化（分离），鉴定、保藏菌种第13页/共48页2.不同的微生物往往需要采用不同的培养基配方 3.不管哪种培养基，基本成分都是相同的。一般都含有水、碳源、和氮源、无机盐、生长因子等营养物质，另外还需要满足微生物生长对pH、氧气、渗透压的要求细菌喜荤，霉菌喜素大肠杆菌培养基LB培养基配方：酵母提取物0.25g蛋白胨0.5gN

5、acl0.5g琼脂1g水:50ml第14页/共48页无菌技术1.无菌技术的概念无菌操作泛指在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法。是成功地培养微生物的关键。第15页/共48页（）消毒定义：2.消毒与灭菌的概念及两者的区别（2）灭菌的定义：是指杀灭病原微生物的方法。如乙醇消毒是指杀灭或清除环境中一切微生物（包括芽胞、孢子）的方法。第16页/共48页灭菌的方法：3.常用的消毒与灭菌的方法1、灼烧灭菌第17页/共48页2、干热灭菌：160-170 下加热1-2h。3、高压蒸气灭菌：100kPa、121 下维持15-30min.高压蒸汽灭菌锅第18页/共48页1.无菌技术除了用来防止实验室的培养

6、物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？2.请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的方法。（1）培养细菌用的培养基与培养皿（2）玻棒、试管、烧瓶和吸管（3）实验操作者的双手答：无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。答：（1）、（2）需要灭菌；（3）需要消毒。第19页/共48页试验一试验一 大肠杆菌的培养和分离大肠杆菌的培养和分离1.进行大肠杆菌的扩增，利用液体培养基进行细菌培养的操作2.进行大肠杆菌的分离，用固体平板培养基进行细菌的划线培养3.说明大肠杆菌培养的条件和操作要求的原理实验目的设备及用品：见课本21页第20页/共48页二、大肠杆菌的培养和分离实验操作（

7、一）培养基的配置与灭菌取2个250ml的三角瓶中分别装入50mlLB液体培养基和50mlLB固体培养基（刚配好，尚未凝固），加上封口膜，牛皮纸包装后高压锅灭菌15min。LB液体培养基细菌的扩大培养LB固体培养基细菌的分离和保藏封口膜：既通气又不使菌进入第21页/共48页（二）倒平板灭菌后的培养基在无菌操作台上倒入4个培养皿中，倒后立即置于水平位置上，轻轻晃动，使培养基铺满平皿底部，待凝，使之形成平面。第22页/共48页注意事项：1、培养基灭菌后，需要冷却到60左右时，才能用来倒平板。2、灭菌及消毒：无菌操作台用超净紫外灯和过滤风灭菌；桌面及人手用酒精棉球消毒。3、操作时右手无名指和小指夹住封

8、口膜,另外三指持三角瓶,左手拿培养皿并打开上盖的一边,在酒精灯火焰旁操作.4、需要使锥形瓶的瓶口通过火焰，灼烧灭菌。5、平板冷凝后，要将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。第23页/共48页（三）大肠杆菌的扩大培养将斜面上培养的大肠杆菌菌种接种到灭菌后的液体培养基中,使其在37摇床培养12小时。注意事项:1、火焰旁从斜面上用接种环取菌;2、取菌前接种环要用酒精灯灼烧灭菌，冷却后方能取菌;3、取菌后封口膜和棉塞复原.第24页/共48页（四）大肠杆菌的划线分离分离方法:划线分离法和涂布分离法第25页/共48页平板划线的操作1、划线分离法：无菌操

9、作台上用接种环取菌后在固体培养基的平板上连续划线.第26页/共48页不能使用脱脂棉，否则容易吸水，造成污染。第27页/共48页一旦划破，会造成划线不均匀，难以达到分离单菌落的目的；二是存留在划破处的单个细胞无法形成规矩的菌落，菌落会沿着划破处生长，会形成一个条状的菌落。第28页/共48页第29页/共48页分离后,一个菌体便会形成一个菌落,这是消除污染杂菌的通用方法,也是用于筛选高表达量菌株的最简便方法之一。第30页/共48页第31页/共48页（四）大肠杆菌的划线分离注意事项:1、接种环只蘸一次菌液，但要在培养基不同位置连续划线多次。2、划线首尾不能相接。3、划线后，培养皿倒置培养1224h。1

10、、划线分离法第32页/共48页 1.为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？答：操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。第33页/共48页 2、在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？答：以免接种环温度太高，杀死菌种。3、在作第二

11、次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？答：划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。第34页/共48页2、涂布分离法:是指将培养的菌液稀释一定的倍数,然后取一定量稀释液加在固体培养基上,用玻璃刮刀涂布在培养基平面上.第35页/共48页划线分离法和涂布分离法哪个更好呢？划线分离：方法简单，但单菌落较难分开。涂布分离：单菌落更易分开，但操作复杂。第36页/共48页（五）大肠杆菌分离后保存1、临时保藏：接种到固体斜面培养基，菌落长成后置于4冰箱保存。2、长期保存：甘油

12、冷冻管藏法。第37页/共48页1、如何操作才可以尽量避免被杂菌污染?(1)胆大心细，操作快捷。（2）注意灭菌操作原则，灭菌彻底，降低环境污染概率。（3）注意微生物生长条件，如PH、渗透压、温度等。细菌喜碱，喜蛋白质，喜37C；霉菌喜酸，喜糖，喜25-30C。课后习题：第38页/共48页2、在培养后如何判断是否有杂菌污染?（1）菌落的形态看，是否湿润，透明，粘稠，颜色等。是区别细菌、酵母、放线菌和霉菌关键指标。（2）显微镜观察其形态、大小。看是否有菌丝、孢子、芽孢。是区别细菌、酵母、放线菌和霉菌关键指标。（3）上述方法较难区别同类的不同物种，需借助化学和进一步的形态观察，如用革兰氏染色法等。第3

13、9页/共48页3、进行恒温培养时为什么要将培养皿倒置?恒温培养时，培养基中的水分会以水蒸气的形式蒸发，倒放培养皿则会使水蒸气凝结成水滴留在盖上；如果正放，则水分形成的水滴会落入培养基表面并扩散开。如果培养皿中已形成菌落，则会导致菌随水扩散，很难再分成单菌落，达不到分离目的。第40页/共48页4、实验完成后，接种过细菌的器皿应如何处理?所有接触过菌的器皿都要先高压灭菌后再洗涤（特别是培养基）；使用后的废弃物也要高压灭菌后再抛弃。5、如果分离的是转基因的大肠杆菌，如何保证不被普通的大肠杆菌所污染?转基因用的质粒不是细菌中原有的，而是经过改造的，通常加入了抗性基因的DNA序列，所以可用含有相应抗生素

14、的培养基对菌体进行培养。第41页/共48页【课堂练习】例1关微生物营养物质的叙述中，正确的是（）A.是碳源的物质不可能同时是氮源 B.凡碳源都提供能量 C.除水以外的无机物只提供无机盐 D.无机氮源也能提供能量D第42页/共48页例2下面对发酵工程中灭菌的理解不正确不正确的是（）A.防止杂菌污染 B.接种前菌种要进行灭菌C.培养基和发酵设备都必须灭菌 D.灭菌必须在接种前B第43页/共48页编号编号成分成分含量含量粉状硫粉状硫10g10g（NHNH4 4）2 2SOSO4 40.4g0.4gK K2 2HPOHPO4 44.0g4.0gMgSOMgSO4 49.25g9.25gFeSOFeSO

15、4 40.5g0.5gCaClCaCl2 20.5g0.5gHH2 2OO100ml100ml例3右表是某微生物培养基成分，请据此回答：（1）右表培养基可培养的微生物类型是 。自养型微生物（2）若除去成分，加入（CH2O），该培养基可用于培养。（3）表中营养成分共有类。固氮微生物3第44页/共48页（4）不论何种培养基，在各种成分都溶化后分装前，要进行的是 。（5）右表中各成分重量确定的原则是 。（6）若右表培养基用于菌种鉴定，应该增加的成分 。调整pH依微生物的生长需要确定琼脂（或凝固剂）第45页/共48页超净工作台超净工作台第46页/共48页第47页/共48页感谢您的观看！第48页/共48页