实时荧光定量PCR技术的原理及应用注意事项适合菜鸟入门.pptx

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1、实时荧光定量实时荧光定量PCR技术的原理及应用注技术的原理及应用注意事项适合菜鸟入门意事项适合菜鸟入门目录目录实时荧光定量实时荧光定量实时荧光定量实时荧光定量PCRPCRPCRPCR基本原理基本原理基本原理基本原理实时荧光定量实时荧光定量实时荧光定量实时荧光定量PCRPCRPCRPCR的实验设计的实验设计的实验设计的实验设计实时荧光定量实时荧光定量实时荧光定量实时荧光定量PCRPCRPCRPCR两种相对定量方法比较两种相对定量方法比较两种相对定量方法比较两种相对定量方法比较实时实时实时实时荧光定量荧光定量荧光定量荧光定量PCRPCRPCRPCR误差分析误差分析误差分析误差分析及操作规范及操作规

2、范及操作规范及操作规范实验中污染的防实验中污染的防实验中污染的防实验中污染的防控控控控荧光定量荧光定量荧光定量荧光定量PCRPCRPCRPCR报告模板报告模板报告模板报告模板第1页/共51页实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR基本原理基本原理第2页/共51页常规常规常规常规PCRPCR：借助电泳对扩增反应的：借助电泳对扩增反应的：借助电泳对扩增反应的：借助电泳对扩增反应的终产物终产物终产物终产物进行半进行半进行半进行半定量定量定量定量及及及及定性定性定性定性分析。分析。分析。分析。定量定量定量定量PCRPCR技术：利用技术：利用技术：利用技术：利用荧光信号的变化实时检测荧光信号的变化实时检测荧

3、光信号的变化实时检测荧光信号的变化实时检测PCRPCRPCRPCR扩扩扩扩增反应中增反应中增反应中增反应中每一个循环扩增产物量的变化每一个循环扩增产物量的变化每一个循环扩增产物量的变化每一个循环扩增产物量的变化，最终精确的，最终精确的，最终精确的，最终精确的对对对对起始起始起始起始模板进行模板进行模板进行模板进行定量分析。定量分析。定量分析。定量分析。常规常规vs vs实时实时第3页/共51页优缺点优缺点优缺点优缺点比较比较比较比较第4页/共51页定量定量定量定量PCRPCRPCRPCR三个基本概念三个基本概念三个基本概念三个基本概念(1)扩增曲线PCRPCR过程中，以循环数为横坐标，以反应过

4、程中荧光强度为纵坐标所做的曲线。过程中，以循环数为横坐标，以反应过程中荧光强度为纵坐标所做的曲线。第5页/共51页定量定量定量定量PCRPCRPCRPCR三个基本概念三个基本概念三个基本概念三个基本概念(2)阈值的概念在荧光定量在荧光定量PCRPCR扩增的扩增的指数期指数期，画一条线，画一条线，在此直在此直线线上上，所有，所有样品的样品的荧光强度与其本底荧光强度荧光强度与其本底荧光强度的的差值全部差值全部相同相同。第6页/共51页定量定量定量定量PCRPCRPCRPCR三个基本概念三个基本概念三个基本概念三个基本概念(3)CT CT值值PCRPCR过程中，各样品扩增产物的过程中，各样品扩增产物

5、的荧光信号荧光信号达到设定的达到设定的阈值时阈值时，所经过，所经过的的扩增扩增循环数循环数。第7页/共51页C(t)C(t)C(t)C(t)与初始模板含量与初始模板含量与初始模板含量与初始模板含量初始模板量越多，初始模板量越多，C(t)C(t)值越值越小小l lC(t)C(t)与初始模板浓度的对数值成线性关系与初始模板浓度的对数值成线性关系荧光强度荧光强度-循环数曲线循环数曲线初始模板量对数初始模板量对数-C(T)循环数标准曲线循环数标准曲线10410310610510210第8页/共51页荧光定量荧光定量荧光定量荧光定量PCRPCRPCRPCR的定量的定量的定量的定量原理原理原理原理浓度的对

6、数值浓度的对数值浓度的对数值浓度的对数值与与与与循环循环循环循环数数数数呈线性关系，根据呈线性关系，根据呈线性关系，根据呈线性关系，根据样品扩增达到域值的样品扩增达到域值的样品扩增达到域值的样品扩增达到域值的循环数（循环数（循环数（循环数（CtCt值）就可值）就可值）就可值）就可分析样品中起始模板分析样品中起始模板分析样品中起始模板分析样品中起始模板量。量。量。量。第9页/共51页荧光定量荧光定量PCRPCR的化学原理的化学原理 化学化学化学化学方法分类方法分类方法分类方法分类l l非特异性非特异性非特异性非特异性SYBR Green ISYBR Green I法法法法l l特异性特异性特异性

7、特异性TaqManTaqMan探针法探针法探针法探针法第10页/共51页SYBR Green ISYBR Green ISYBR Green ISYBR Green I法法法法原理：原理：原理：原理：结合结合结合结合双链双链双链双链DNADNADNADNA分子小沟分子小沟分子小沟分子小沟l l延伸结束，形成双链延伸结束，形成双链延伸结束，形成双链延伸结束，形成双链DNADNADNADNA，SYBR SYBR SYBR SYBR GreenGreenGreenGreen结合到双螺旋小沟中，当受结合到双螺旋小沟中，当受结合到双螺旋小沟中，当受结合到双螺旋小沟中，当受到适合光源激发，发射出荧光，反到

8、适合光源激发，发射出荧光，反到适合光源激发，发射出荧光，反到适合光源激发，发射出荧光，反映产物浓度映产物浓度映产物浓度映产物浓度优点优点优点优点l l使用方便，无需复杂的设计使用方便，无需复杂的设计使用方便，无需复杂的设计使用方便，无需复杂的设计l l成本较低成本较低成本较低成本较低缺点缺点缺点缺点l l与非特异性产物结合，无模板特与非特异性产物结合，无模板特与非特异性产物结合，无模板特与非特异性产物结合，无模板特异性异性异性异性l l试验方法较难优化试验方法较难优化试验方法较难优化试验方法较难优化l l灵敏度低灵敏度低灵敏度低灵敏度低GTTTGGCCCCCCCAAAGGGACTTGATAGC

9、ATCGTAA第11页/共51页第12页/共51页SYBR Green ISYBR Green ISYBR Green ISYBR Green I法法法法溶解曲线分析溶解曲线分析第13页/共51页荧光染料的特点及荧光染料的特点及应用应用(1)(1)、能够与所有的核酸双链结合，受激后产生荧光，其荧光能够与所有的核酸双链结合，受激后产生荧光，其荧光的强度与双的强度与双链核酸的含量及长度成正比，因此本底较高；链核酸的含量及长度成正比，因此本底较高；(2)(2)、可做双链核酸的熔解曲线分析；可做双链核酸的熔解曲线分析；(3)(3)、SYBR GreenSYBR Green染料本身价格便宜，但是做荧光定

10、量染料本身价格便宜，但是做荧光定量PCRPCR时对引物时对引物设设计计的要求很高；对的要求很高；对TaqTaq酶要求较高，最好是酶要求较高，最好是HotStar TaqHotStar Taq酶，或者酶，或者操操作作时需要严格的冷启动，冰上操作，否则引物二聚体及非特异性时需要严格的冷启动，冰上操作，否则引物二聚体及非特异性扩扩增增会严重干扰结果的准确性，尤其是模板含量较低时；会严重干扰结果的准确性，尤其是模板含量较低时；(4)(4)、适合于基因含量及基因表达变化的粗略分析或初筛；适合于基因含量及基因表达变化的粗略分析或初筛；(5)(5)、在分析的基因种类很多，但是样品量很少时，尤其适用。在分析的

11、基因种类很多，但是样品量很少时，尤其适用。(6)(6)、对对PCRPCR反应的毒性，能抑制反应的毒性，能抑制PCRPCR反应，降低反应，降低PCRPCR反应的效率。反应的效率。第14页/共51页TaqManTaqMan探针法探针法 水解型水解型水解型水解型 报告基团，淬灭基团报告基团，淬灭基团报告基团，淬灭基团报告基团，淬灭基团 FRETFRETFRETFRET（荧光谐振能量传递）（荧光谐振能量传递）（荧光谐振能量传递）（荧光谐振能量传递）识别特异性产物识别特异性产物识别特异性产物识别特异性产物 优点优点优点优点 特异性高，可准确定量特异性高，可准确定量特异性高，可准确定量特异性高，可准确定量

12、 灵敏度高灵敏度高灵敏度高灵敏度高 设计不同标记的探针，可设计不同标记的探针，可设计不同标记的探针，可设计不同标记的探针，可进行多重检测进行多重检测进行多重检测进行多重检测 缺点缺点缺点缺点 一个探针只适用于一个目一个探针只适用于一个目一个探针只适用于一个目一个探针只适用于一个目标标标标 价格较高价格较高价格较高价格较高 探针设计较繁琐探针设计较繁琐探针设计较繁琐探针设计较繁琐第15页/共51页第16页/共51页TaqManTaqManTaqManTaqMan作用机理作用机理第17页/共51页两种化学的比较两种化学的比较第18页/共51页实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR的实验设计的实验设计

13、第19页/共51页绝对定量与相对定量绝对定量与相对定量绝对定量：精确的计算初始反应的模板浓度（绝对定量：精确的计算初始反应的模板浓度（绝对定量：精确的计算初始反应的模板浓度（绝对定量：精确的计算初始反应的模板浓度（DNADNADNADNA，RNARNARNARNA）相对定量：计算初始反应模板的相对含量相对定量：计算初始反应模板的相对含量相对定量：计算初始反应模板的相对含量相对定量：计算初始反应模板的相对含量第20页/共51页定量定量PCR-PCR-绝对定量绝对定量标准品，标准曲线标准品，标准曲线标准品，标准曲线标准品，标准曲线l l已知浓度的相应已知浓度的相应已知浓度的相应已知浓度的相应DNA

14、DNADNADNA模板，按不模板，按不模板，按不模板，按不同浓度稀释同浓度稀释同浓度稀释同浓度稀释l l根据实时根据实时根据实时根据实时PCRPCRPCRPCR反应得到相应的反应得到相应的反应得到相应的反应得到相应的C(t)C(t)C(t)C(t)，构建标准曲线，构建标准曲线，构建标准曲线，构建标准曲线样品样品样品样品l l与标准品同时进行与标准品同时进行与标准品同时进行与标准品同时进行PCRPCRPCRPCR反应得到反应得到反应得到反应得到未知浓度样品的未知浓度样品的未知浓度样品的未知浓度样品的C(t)C(t)C(t)C(t)值值值值第21页/共51页定量定量PCR-PCR-相对定量相对定量

15、相对定量的目的相对定量的目的相对定量的目的相对定量的目的l l比较基因在不同情况下的表达差比较基因在不同情况下的表达差比较基因在不同情况下的表达差比较基因在不同情况下的表达差异（倍数关系）异（倍数关系）异（倍数关系）异（倍数关系）相对定量的问题相对定量的问题相对定量的问题相对定量的问题l l样品材料不均一造成的差别样品材料不均一造成的差别样品材料不均一造成的差别样品材料不均一造成的差别内标基因内标基因内标基因内标基因l l内标通常是内标通常是内标通常是内标通常是b-actinb-actin、GAPDHGAPDH、18SrRNA18SrRNA等看家基因（内标基因等看家基因（内标基因等看家基因（内

16、标基因等看家基因（内标基因的表达要相对恒定，表达不受处的表达要相对恒定，表达不受处的表达要相对恒定，表达不受处的表达要相对恒定，表达不受处理因素影响）理因素影响）理因素影响）理因素影响）l l对目的基因进行均一化：去除样对目的基因进行均一化：去除样对目的基因进行均一化：去除样对目的基因进行均一化：去除样本间加样量不同带来的误差本间加样量不同带来的误差本间加样量不同带来的误差本间加样量不同带来的误差第22页/共51页实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR两种相对两种相对定定量量方法比较方法比较相对标准曲线相对标准曲线法和法和2-c(t)法法第23页/共51页相对标准曲线法相对标准曲线法用目标基因和

17、内标基因的标准品分别获得用目标基因和内标基因的标准品分别获得用目标基因和内标基因的标准品分别获得用目标基因和内标基因的标准品分别获得标准曲线标准曲线标准曲线标准曲线处理与未处理样品同时扩增目标基因和内标基因，获得处理与未处理样品同时扩增目标基因和内标基因，获得处理与未处理样品同时扩增目标基因和内标基因，获得处理与未处理样品同时扩增目标基因和内标基因，获得C(t)C(t)C(t)C(t)值值值值用内标基因对目标基因用内标基因对目标基因用内标基因对目标基因用内标基因对目标基因均一化均一化均一化均一化处理样本与未处理样本目标基因处理样本与未处理样本目标基因处理样本与未处理样本目标基因处理样本与未处理

18、样本目标基因C(t)C(t)C(t)C(t)值经内参基因均一化后相除，值经内参基因均一化后相除，值经内参基因均一化后相除，值经内参基因均一化后相除，即可得出处理样本与未处理样本的表达差异即可得出处理样本与未处理样本的表达差异即可得出处理样本与未处理样本的表达差异即可得出处理样本与未处理样本的表达差异第24页/共51页适用范围适用范围目标基因与内标基因扩增效率差异较大目标基因与内标基因扩增效率差异较大目标基因与内标基因扩增效率差异较大目标基因与内标基因扩增效率差异较大扩增效率较低扩增效率较低扩增效率较低扩增效率较低第25页/共51页2 2-c(t)-c(t)法法前提：目标序列和内参序列的扩增效率

19、接近前提：目标序列和内参序列的扩增效率接近100100且偏差且偏差在在 5 5以以内内 1 1、用内参基因的、用内参基因的CTCT值归一目标基因的值归一目标基因的CTCT值：值：CTCT（test)=CT test)=CT（target,test)-CT target,test)-CT（ref,test)ref,test)CT CT（calibrator)=CT calibrator)=CT（target,calibrator)-CT target,calibrator)-CT（ref,calibrator)ref,calibrator)2 2、用校准样本的、用校准样本的CTCT值归一试验样本

20、的值归一试验样本的CTCT值：值：CT=CTCT=CT（test)-CTtest)-CT（calibrator)calibrator)3 3、计算表达水平比率：、计算表达水平比率：2 CT=2 CT=表达量的比值表达量的比值当有多个样品时（如时间点），各样品均一化后都与同一时间点当有多个样品时（如时间点），各样品均一化后都与同一时间点相比相比第26页/共51页一般步骤一般步骤选定目标基因和内标基因选定目标基因和内标基因选定目标基因和内标基因选定目标基因和内标基因设计一步法或两步法设计一步法或两步法设计一步法或两步法设计一步法或两步法RT-PCRRT-PCRRT-PCRRT-PCR反应反应反应反

21、应数据获得及处理数据获得及处理数据获得及处理数据获得及处理l l目标基因目标基因目标基因目标基因C(t)C(t)值值值值l l内标基因内标基因内标基因内标基因C(t)C(t)值值值值l l计算计算计算计算2 2-c(t)-c(t)l l作图作图作图作图第27页/共51页适用范围适用范围当扩增效率较高，且目标基因和内标基因扩增效率比较当扩增效率较高，且目标基因和内标基因扩增效率比较当扩增效率较高，且目标基因和内标基因扩增效率比较当扩增效率较高，且目标基因和内标基因扩增效率比较一致一致一致一致不做标准曲线，高通量检测不做标准曲线，高通量检测不做标准曲线，高通量检测不做标准曲线，高通量检测第28页/

22、共51页实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR误差分析误差分析及及操作规范操作规范第29页/共51页1、误差分析（1 1）、实验方案本身的误差）、实验方案本身的误差 荧光染料法由于染料本身的特性，不可避免的会引起误差；荧光染料法由于染料本身的特性，不可避免的会引起误差；2-CT2-CT法由于也是一种近似的算法，所以不可避免的法由于也是一种近似的算法，所以不可避免的也会也会引起误差；引起误差；Taqman Taqman探针法误差相对较小；探针法误差相对较小；双标准曲线法误差相对较小。双标准曲线法误差相对较小。（2 2）、仪器设备引起的误差）、仪器设备引起的误差 测量标准品核酸浓度时，分光光度计的误

23、差，从光密度值到测量标准品核酸浓度时，分光光度计的误差，从光密度值到质量质量再到再到摩尔量，误差本身就摩尔量，误差本身就很大；很大；定量定量PCRPCR仪的仪的误差，耗材误差，耗材引起的误差，引起的误差，9696空板封口膜透光性的空板封口膜透光性的差异等差异等第30页/共51页（3 3）、相对定量时内参基因表达不稳定引起的）、相对定量时内参基因表达不稳定引起的误差误差（4 4）、操作引起的误差）、操作引起的误差 样品处理、选取、核酸提取、反转录、样品处理、选取、核酸提取、反转录、加样，操作过程中引起的加样，操作过程中引起的误差误差。第31页/共51页2、操作规范 荧光荧光定量定量PCRPCR是

24、一项对操作要求很高的实验，同是一项对操作要求很高的实验，同时又是花费很高的一时又是花费很高的一项实验项实验，这就要求必须最大，这就要求必须最大程度的减少误差或避免错误。要想达到这个程度的减少误差或避免错误。要想达到这个目标目标，我们必须从样品的选取开始到上样检测，每一步我们必须从样品的选取开始到上样检测，每一步都要规范操作都要规范操作。第32页/共51页（1 1）、）、样品的处理及选取样品的处理及选取 处理处理样品时，必须确保样品都得到了充分的处理。样品时，必须确保样品都得到了充分的处理。如测定一种如测定一种药物到药物到小白鼠免疫系统的影响，必须小白鼠免疫系统的影响，必须做到每次饲喂时此药品完

25、全被做到每次饲喂时此药品完全被小白鼠小白鼠摄食；选取摄食；选取试验样品时，要保证选取的组织尽可能的纯，不试验样品时，要保证选取的组织尽可能的纯，不要要污染污染其他组织，如选取脾脏组织时，尽可能的其他组织，如选取脾脏组织时，尽可能的选取脾脏，不能混有选取脾脏，不能混有结缔组织结缔组织等，样品选取好后，等，样品选取好后，即可放入液氮或超低温冰箱保存。即可放入液氮或超低温冰箱保存。第33页/共51页（2 2）、）、核酸提取核酸提取 加入加入液氮研磨要彻底，蛋白、多糖、多酚类物液氮研磨要彻底，蛋白、多糖、多酚类物质要去除干净，质要去除干净，确保得到确保得到高质量的核酸，分高质量的核酸，分光光度计检测核

26、算质量，光光度计检测核算质量，RNA OD260/280RNA OD260/2802.02.0左右，左右，DNA OD260/280DNA OD260/2801.81.8左右，最好再左右，最好再做电泳检测；同一做电泳检测；同一样品样品要提取要提取2 2到到3 3个个RNARNA，所，所剩余的样品不要丢弃，继续低温保存。剩余的样品不要丢弃，继续低温保存。（3 3）、）、得到的得到的RNARNA立即反转录为立即反转录为cDNAcDNA，RNARNA样品样品最好不要存放，反转录最好不要存放，反转录所得所得cDNAcDNA要用看家基要用看家基因检测。因检测。第34页/共51页（4 4）、对于精度要求较

27、高的定量）、对于精度要求较高的定量PCRPCR，最好先在样品的，最好先在样品的所有组织类型内做内参基因的稳定性分析，找出表达所有组织类型内做内参基因的稳定性分析，找出表达恒定基因作为内参。恒定基因作为内参。（5 5）、做定量）、做定量PCRPCR时，先把除模板外的所有试剂预混，时，先把除模板外的所有试剂预混，然后分装到然后分装到PCRPCR管中，管中，分装时尽量采用排枪，加样时分装时尽量采用排枪，加样时尽量最好采用排枪尽量最好采用排枪。（6 6）、体系中最好掺入）、体系中最好掺入ROXROX参比荧光，消除光程差和加参比荧光，消除光程差和加样的偏差。样的偏差。第35页/共51页（7 7）、）、重

28、复操作重复操作 让让重复操作最大的修正重复操作最大的修正偏差。最偏差。最有意义的重复是在提有意义的重复是在提取样品取样品RNARNA时就时就重复，同一个样品，分别提取重复，同一个样品，分别提取3 3份份RNARNA，3 3份份RNARNA都做反转录，都做反转录，所得所得的的3 3份份cDNAcDNA都做定量都做定量PCRPCR检测，这检测，这样的重复之所以最有意义是样的重复之所以最有意义是因为因为我们是把我们是把RNARNA提取、反转提取、反转录、上机检测三步做了重复，这样录、上机检测三步做了重复，这样得出的得出的平均值要比只平均值要比只在上机检测时对同一在上机检测时对同一cDNAcDNA样品

29、做三个重复要有样品做三个重复要有意义的意义的多。多。同一个同一个cDNAcDNA样品做三个重复定量检测求平均值主要是样品做三个重复定量检测求平均值主要是消除加样时消除加样时的误差的误差，排枪加样时，误差很小，加样时的，排枪加样时，误差很小，加样时的误差可以通过设几个误差可以通过设几个重复检测出来重复检测出来。第36页/共51页同一cDNA样品的三个重复第37页/共51页模板浓度越低，染料法的误差越大。如图一系列梯度稀释的模板，理论上它们在扩增曲线上的CT值之差，应该相等，但是后边几个浓度低的样品CT值明显提前了，由熔解曲线可知对于浓度低的样品，引物二聚体引起的误差非常严重。第38页/共51页实

30、验中污染的防控第39页/共51页1 1、荧光定量、荧光定量PCRPCR实验中污染源的实验中污染源的分析分析（1 1）、）、PCRPCR产物引起的污染产物引起的污染 在在检测过程中，荧光定量检测过程中，荧光定量PCRPCR产物都是封闭在产物都是封闭在PCRPCR管中的，不存在管中的，不存在开开管管检测，所以有污染的话，最有可能是因为电泳检测荧光定量检测，所以有污染的话，最有可能是因为电泳检测荧光定量PCRPCR产物产物时引起的污染，只要将电泳室与时引起的污染，只要将电泳室与PCRPCR加样室隔离开，就能加样室隔离开，就能有效有效的的避免避免PCRPCR产物的污染。产物的污染。第40页/共51页（

31、2 2）、标准品引起的污染）、标准品引起的污染 常用常用的标准品有含有目的基因的质粒、纯化后的标准品有含有目的基因的质粒、纯化后的的PCRPCR产物等，产物等，由于标准品由于标准品的浓度是一系列从的浓度是一系列从高到低梯度稀释的，所以在稀释过程中高到低梯度稀释的，所以在稀释过程中，有，有可能引起污染。可能引起污染。第41页/共51页（3 3）、高浓度的样品引起的污染）、高浓度的样品引起的污染 高浓度高浓度的阳性样品在加样过程中可能会形成的阳性样品在加样过程中可能会形成气气溶胶溶胶，造成污染。，造成污染。第42页/共51页2、荧光定量PCR实验中污染的防控（1 1）、对于）、对于PCRPCR产物

32、引起的污染产物引起的污染 最最简单有效地办法就是将电泳室与加样室彻底隔离开，做到每个简单有效地办法就是将电泳室与加样室彻底隔离开，做到每个房房间间都有专属的移液器，做到移液器专用；或者采用都有专属的移液器，做到移液器专用；或者采用dUdU代替代替dTdT配合配合UNGUNG酶酶，是解决是解决PCRPCR产物污染的有效办法，但是成本较高。产物污染的有效办法，但是成本较高。第43页/共51页（2 2）、对于标准品引起的污染）、对于标准品引起的污染 目前目前只能是以预防，加标准品时最好采用专用只能是以预防，加标准品时最好采用专用移液器，不要和加移液器，不要和加样的样的移液器交叉使用，加移液器交叉使用

33、，加标准品时最好在通风厨中进行，和加样的标准品时最好在通风厨中进行，和加样的操操作台作台隔离开。隔离开。第44页/共51页（3 3）、对于样品间的检查污染）、对于样品间的检查污染 样品样品间的交叉污染往往是因为高浓度的样品在间的交叉污染往往是因为高浓度的样品在加样室形成了加样室形成了气溶胶气溶胶，因为样品的，因为样品的cDNAcDNA链较链较长，经常开紫外灯，把长链长，经常开紫外灯，把长链cDNAcDNA打断，打断，能有能有效效避免此类污染的发生，另外保持加样室空避免此类污染的发生，另外保持加样室空气流通也有助于气流通也有助于防止此防止此类污染。类污染。第45页/共51页（4 4）、对于未知污

34、染源的顽固的污染的防控）、对于未知污染源的顽固的污染的防控 这这类污染也经常出现，找不到明确的污染源，而且类污染也经常出现，找不到明确的污染源，而且此类污染又此类污染又非常顽固非常顽固，对于这种情况，最好的办，对于这种情况，最好的办法就是不去管它，在采用绝对法就是不去管它，在采用绝对定量和定量和双标准曲线双标准曲线法时，污染的初始模板量可由阴性对照检测出来，法时，污染的初始模板量可由阴性对照检测出来，知道知道了污染的初始模板量后，我们可以把测得样了污染的初始模板量后，我们可以把测得样品的初始模板量品的初始模板量减去污染减去污染的初始模板量，在分析的初始模板量，在分析时就避免了污染造成的误差。时就避免了污染造成的误差。第46页/共51页图中最后一个样品为阴性对照，本来应该是一直线，但是仪器也检测到了荧光信号第47页/共51页电泳结果显示，该阴性对照确实有PCR产物出现第48页/共51页通过定量PCR检测，测得该阴性样品中含有227个初始模板。假如这个污染属于是顽固的未知污染，可以用正常样品测得的初始模板量减去227，来避免污染引起的误差第49页/共51页荧光定量荧光定量PCRPCR报告模板报告模板第50页/共51页感谢您的观看。感谢您的观看。第51页/共51页