实验一凝胶过滤层析分离蛋白质课件.pptx

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1、实验课要求 试剂用后及时归位 及时记录实验结果 按时完成实验报告 离开时做好清洁工作第1页/共30页实验报告的书写实验报告的书写标题日期一、实验目的二、实验原理三、操作步骤四、实验结果五、分析讨论第2页/共30页实验基本操作实验基本操作一、玻璃仪器的洗涤二、吸量管及微量取样器的使用三、溶液的混匀四、离心机的使用第3页/共30页实验一实验一 凝胶过滤层析法分离蛋白凝胶过滤层析法分离蛋白质质1.掌握凝胶过滤层析法的基本原理；2.掌握凝胶过滤层析法分离蛋白质的过程。一、实验目的第4页/共30页二、实验原理1.常用生化实验技术 分光光度技术电泳技术离心技术层析技术第5页/共30页2.层析技术（色谱技术

2、）是利用混合物中各组分的理化性质差异（吸附力、溶解度、分子形状和大小、分子极性、分子亲和力等）建立起来的技术。第6页/共30页（1）层析系统的基本组成）层析系统的基本组成 固定相+流动相固体物质/固定于固体物质的成分可以流动的物质：如水和各种溶媒第7页/共30页待分离混合物（A、B）随流动相通过固定相 由于理化性质差异，与两相发生相互作用（吸附、溶解、结合等）的能力不同，在两相中的分配（含量对比）不同与固定相相互作用力越弱的组分，随流动相移动时 受到的阻滞作用小，移动速度快分步收集流出液，可得到样品中所含的各单一组分，从而达到将各组分分离的目的第8页/共30页（2 2）层析法的分类）层析法的分

3、类 按两相所处状态分类 流动相流动相液体液体气体气体固定相固定相液体液体液液液层析法液层析法气气液层析法液层析法固体固体液液 固层析法固层析法气气 固层析法固层析法第9页/共30页 按层析原理分类 名称名称原理原理吸附层析法吸附层析法 固定相为固体吸附剂，利用各组分在吸附固定相为固体吸附剂，利用各组分在吸附剂表面吸附能力不同而分离剂表面吸附能力不同而分离分配层析法分配层析法 各组分在流动相和固相中的分配系数不同各组分在流动相和固相中的分配系数不同离子交换层离子交换层析法析法固定相是离子交换剂，各组分与离子交换固定相是离子交换剂，各组分与离子交换剂亲和力不同而分离剂亲和力不同而分离亲和层析法亲和

4、层析法 固定相只能与一种待分离组分专一结合，固定相只能与一种待分离组分专一结合，以此和无亲和力的其它组分分离以此和无亲和力的其它组分分离凝胶层析法凝胶层析法 固定相是多孔凝胶，各组分的分子大小不固定相是多孔凝胶，各组分的分子大小不同，因而在凝胶上受阻滞的程度不同同，因而在凝胶上受阻滞的程度不同第10页/共30页 按操作形式不同分类 名称名称操作形式操作形式柱层析法柱层析法固定相装于层析柱内，使样品沿着一个方固定相装于层析柱内，使样品沿着一个方向前移而达分离的层析法，包括一般柱层向前移而达分离的层析法，包括一般柱层析法、毛细管层析法和微粒填充柱层析法析法、毛细管层析法和微粒填充柱层析法平面层析法

5、平面层析法层析过程在固定相构成的平面层内进行的层析过程在固定相构成的平面层内进行的层析法，包括纸层析法、薄层层析法和薄层析法，包括纸层析法、薄层层析法和薄膜层析法膜层析法第11页/共30页（3 3）层析技术的优点）层析技术的优点 分离效率高 分析速度快 具有极高的灵敏度 应用范围广适用：杂质多、含量少的复杂样品分析，尤其适用于生物样品的分离分析第12页/共30页3.凝胶过滤层析法（gel filtration chromatography）（1）原理：根据分子大小的差别进行分离。每个凝胶颗粒好象一个筛子，小分子物质可以进入颗粒内部，大分子物质被排阻在外。又名分子筛过滤，排阻层析第13页/共30

6、页第14页/共30页（2 2）凝胶的特点）凝胶的特点 属于惰性载体，不带电荷，吸附力弱，操作条件较温和，可在相当广的温度范围内进行，不需要有机溶剂，对于高分子物质有很好的分离效果。交联葡聚糖凝胶 聚丙烯酰胺凝胶 琼脂糖凝胶第15页/共30页（3 3）凝胶的选择）凝胶的选择A.葡聚糖凝胶(商品名:Sephadex，Dextran)型号:G-10 G-200多孔网孔结构数字愈小,交联度越大,被筛分物质的分子量也愈小吸水能力，每g干胶吸水量的10倍第16页/共30页Sephadex G-50：对多肽及蛋白质的筛分范围(分子量)为:1500 30000Sephadex G-200：对多肽及蛋白质的筛分

7、范围(分子量)为:5000 80000例：第17页/共30页B.琼脂糖凝胶 (商品名:Sepharose,Bio-gel A)对实验条件要求高(温度,pH)40 4.5-9.0 工作的下限是葡聚糖凝胶工作的上限,用于大分子物质的分离第18页/共30页C.聚丙烯酰胺凝胶 商品名:Bio gel P（生物胶P）第19页/共30页三、实验操作1.柱的选择 直径：15 cm 一般长度：直径=10：1 20：1 本实验玻柱：直径0.8 1.5cm 长度 17 20cm第20页/共30页2.凝胶选择、制备 血红蛋白 溶菌酶 分离 （64500）（11400）选择 Sephadex G-50Sephadex

8、 G-50：对多肽及蛋白质的筛分范围(分子量)为:1500 30000第21页/共30页制备：将干胶颗粒悬浮于5 10倍的蒸馏水或洗脱液中充分溶胀，溶胀之后将极细的小颗粒倾泻出去第22页/共30页3.凝胶装柱柱固定于架子上，垂直放置，关住出口自顶部缓缓加入葡聚糖悬液，使G-50 开始下沉，至1 2cm时，打开出口凝胶逐层上升，至顶部 2-3cm时，关闭出口第23页/共30页注意点：垂直放置 防止气泡产生 防止柱的分层第24页/共30页4.平衡放置一段时间，约40分钟（使凝胶更好的压实）注意：防止床面干涸，可适当补充蒸馏水第25页/共30页5.加样 加样前打开出口，使床面的蒸馏水流出，正好露 出

9、床面时，立即关闭出口（将干未干）用滴管将混合样品(0.6ml，即血红蛋白和溶菌酶 各0.3ml)缓缓沿柱内壁小心加于床表面 打开出口，使样品进入床内，直到床面重新露出,立即加入12倍于样品体积的蒸馏水第26页/共30页6.洗脱当此少量蒸馏水接近流干时，反复多次加入蒸 馏水，进行洗脱，直到两带分开检查Hb在层析床中色带位置，待Hb洗脱完后，用试管分步收集洗脱液 10d/管，每管加NaOH 2d，CuSO4 2d 检查溶菌酶洗脱情况，若为紫色，则为（+）第27页/共30页缩二脲反应（双缩脲反应）肽键第28页/共30页四、实验结果绘制洗脱结果示意图，并分析所得结果下次实验：碱性磷酸酶的提取及其比活性的测定 时间：4月18日上午9：00开始五、讨论第29页/共30页感谢您的观看。第30页/共30页