血红蛋白的提取与分离(上课).ppt

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1、(一）回忆蛋白质一）回忆蛋白质占细胞干重的占细胞干重的5050以上，细胞中含量最多的以上，细胞中含量最多的有机物有机物2 2、组成元素、组成元素C C、HH、OO、N N，有的含有，有的含有P P、S S还有的含还有的含FeFe、MnMn、ZnZn、I I等等1 1、含量、含量3 3、相对分子质量、相对分子质量:高分子化合物高分子化合物一、基础知识一、基础知识 4 4、基本组成单位、基本组成单位:氨基酸氨基酸脱水缩合脱水缩合5 5、氨基酸通式、氨基酸通式R RHHC CCOOHCOOHNHNH2 26 6、氨基酸连接方式、氨基酸连接方式 7 7、肽键、肽键COCONHNH8 8、蛋白质形成过程

2、、蛋白质形成过程氨基酸氨基酸肽链肽链蛋白质蛋白质脱水缩合脱水缩合盘曲折叠盘曲折叠（一条或者多条）一条或者多条）氨基酸的种类不同；数目成百上千；排列顺氨基酸的种类不同；数目成百上千；排列顺序变化多端；多肽链的空间结构千差万别序变化多端；多肽链的空间结构千差万别9 9、蛋白质结构的多样性原因：、蛋白质结构的多样性原因：构成细胞和生物体结构的重要物质构成细胞和生物体结构的重要物质催化催化运输运输调节调节免疫免疫1010、颜色反应：、颜色反应：蛋白质蛋白质+双缩脲试剂双缩脲试剂 紫色紫色10、蛋白、蛋白质的功能的功能血红蛋白含有四条肽链血红蛋白含有四条肽链,每条肽链环绕一个每条肽链环绕一个亚铁亚铁血红

3、素基团，血红素基团，此基团可携带此基团可携带一分子氧或一分子二氧一分子氧或一分子二氧化碳，化碳，血红蛋白因含有血红蛋白因含有血红素血红素而呈而呈红色。红色。分离蛋白质的依据：分离蛋白质的依据：根据蛋白质各种特性的差异，如根据蛋白质各种特性的差异，如分分子的形状和大小、所带电荷的性质子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度和吸附的性质和对和多少、溶解度和吸附的性质和对其他分子的亲和力其他分子的亲和力等等，可以用来等等，可以用来分离不同蛋白质分离不同蛋白质一一 凝胶色谱法凝胶色谱法实例：实例：葡聚糖、琼脂糖葡聚糖、琼脂糖3 3、凝胶、凝胶1 1、别名：、别名：分配色谱法分配色谱法特点：一些特点

4、：一些微小微小多孔的球体，内含许多多孔的球体，内含许多贯穿贯穿的通道的通道2 2、分离蛋白质的依据：、分离蛋白质的依据：蛋白质相对分子质量的大小蛋白质相对分子质量的大小4 4、凝胶色谱法的原理、凝胶色谱法的原理原理：原理：当不同的蛋白质通过凝胶时当不同的蛋白质通过凝胶时相对分子质量较小相对分子质量较小相对分子质量较大相对分子质量较大凝胶内部的通道凝胶内部的通道容易进入容易进入无法进入凝胶无法进入凝胶内部的通道内部的通道只能在只能在凝胶外部凝胶外部移动移动路程路程较长较长移动速度移动速度较慢较慢路程路程较短较短移动速度移动速度较快较快相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。相对分子质量不同的蛋白质

5、因此得以分离。二、缓冲溶液二、缓冲溶液 1 1、概念、概念具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液能够抵制外界的酸或碱对溶液的能够抵制外界的酸或碱对溶液的PHPH值值的影响，维持的影响，维持PHPH基本不变基本不变 2 2、作用、作用3 3、缓冲溶液的配制、缓冲溶液的配制通常由通常由1 12 2种缓冲剂种缓冲剂溶解于水中配制而成。调溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的节缓冲剂的使用比例使用比例就可以制得在不同就可以制得在不同PHPH范围范围内使用的缓冲液内使用的缓冲液4 4、常见的缓冲溶液成分、常见的缓冲溶液成分 H H2 2COCO3 3 NaHCO NaHCO3 3 NaH

6、NaH2 2POPO4 4 Na Na2 2HPOHPO4 4思考：在血红蛋白整个实验室中用的缓冲液是思考：在血红蛋白整个实验室中用的缓冲液是什么？它的目的是什么？什么？它的目的是什么？使用的是磷酸缓冲液，目的是利用缓冲液模使用的是磷酸缓冲液，目的是利用缓冲液模拟细胞内的拟细胞内的PHPH环境，保证血红蛋白的正常结构环境，保证血红蛋白的正常结构和功能和功能三、实验操作三、实验操作样品处理样品处理粗分离粗分离纯化纯化纯度鉴定纯度鉴定1 1、样品处理、样品处理（一）蛋白质提取和分离步骤（一）蛋白质提取和分离步骤(1)(1)血液组成血液组成（二）操作过程（二）操作过程红细胞（最多）红细胞（最多）血红

7、蛋白血红蛋白（9090）(2)、样品处理n1、红细胞的洗涤：、红细胞的洗涤：n目的是去除杂蛋白。要加入柠檬酸钠防止血液目的是去除杂蛋白。要加入柠檬酸钠防止血液凝固；离心将血液分层，用胶头吸管吸出黄色凝固；离心将血液分层，用胶头吸管吸出黄色血浆；用生理盐水洗涤。血浆；用生理盐水洗涤。n2、血红蛋白的释放血红蛋白的释放：n在蒸馏水和甲苯作用下，红细胞破裂释放在蒸馏水和甲苯作用下，红细胞破裂释放n3、分离血红蛋白溶液分离血红蛋白溶液：n离心分层；滤纸过滤去除脂溶性沉淀层；分液离心分层；滤纸过滤去除脂溶性沉淀层；分液漏斗分出红色透明液体。漏斗分出红色透明液体。n4、透析：透析：n装入透析袋并置于磷酸缓冲液中（装入透析袋并置于磷酸缓冲液中（PH为为7.0）透析。透析。分离血红蛋白溶液有机溶剂有机溶剂 （无色透明的甲苯层）（无色透明的甲苯层）脂类物质脂类物质 （白色白色脂溶性物质沉淀层）脂溶性物质沉淀层）血红蛋白溶液血红蛋白溶液 （红色透明液体）（红色透明液体）红细胞破碎物沉（暗红色沉淀物）红细胞破碎物沉（暗红色沉淀物）