蒋卵巢上皮癌组织中.pdf

《蒋卵巢上皮癌组织中.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《蒋卵巢上皮癌组织中.pdf（27页珍藏版）》请在淘文阁 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、 蒋卵巢上皮癌组织中 Document serial number【KK89K-LLS98YT-SS8CB-SSUT-SST108】卵巢上皮癌组织中 ERCC1 基因 mRNA 表达水平与患者化疗反应性和生存期的关系 前言 卵巢癌、宫颈癌和子宫内膜癌是妇产科最常见的三大恶性肿瘤，随着宫颈癌和子宫内膜癌的早期诊断和治疗已经取得了巨大的进步，卵巢癌已经成为严重威胁女性生命的恶性肿瘤，发现之时多已处于晚期，五年生存率一直在25%30%徘徊1-3。以铂类药物为基础的化学治疗是卵巢癌除手术之外的主要辅助治疗手段，既可用于预防术后的复发，也可用于手术未能全部切除者，部分患者可获暂时缓解，甚至长期存活。然而

2、有20%到 30%的患者对一线化疗药物始终无反应，初治有反应的患者仍有部分会发生继发耐药。研究表明，铂类药物的耐药和核酸切除修复系统（nucleotide excision repair,NER）密切相关，NER 系统可以修复铂类化疗药所造成的 DNA损伤，从而降低患者对化疗的敏感性4-9。切除修复交叉互补基因 1(excision repair cross-complementation group 1，ERCC1)是 NER 系统中的一个关键基因，其表达量与肺癌、胃癌、前列腺癌患者的预后相关。ERCC1 基因共 10 个外显子，可分别转录为两个剪接体，含 10 个外显子的全长剪接体 mRN

3、A(full length,FL),和缺失第 VIII 外显子（长 72bp）的变异剪接体mRNA(alternative splicing,AS)。本研究使用 TaqMan 实时荧光定量 RT-PCR 法检测卵巢癌组织中 ERCC1 的变异剪接体的表达量，以期对此变异剪接的临床意义进行探讨。试验流程 1 材料与方法 纳入标准：我院自 2000年 1 月至 2006年 12月所收治的原发性卵巢上皮癌患者，术前未接受化疗，术后经病理确诊。全部标本均经病理科医师切片确诊，病理科医生并不知道病人 纳入与排除的情况，充分使用了盲法。术后至少接受 3 个疗程的以铂类为基础的化疗。术前均签署知情同意书，允

4、许所切除卵巢组织保存于我院并被用于科学研究。排除标准：接受术前化疗者；卵巢非上皮性癌者；病例资料不完整者；切除卵巢组织未行保存或者保存不善以致无法提取 RNA者；拒绝将切除组织用于科研者。符合以上纳入与排除标准者共计 63例卵巢上皮癌患者纳入研究。诊断标准：全部标本均经病理科医师切片确诊。组织学分级标准主要依据世界卫生组织（World Health Organization，WHO）1973年制定的卵巢组织学分类法进行组织学的分类和分级，并参照细胞分化程度分 3 级：分化 1 级，为高度分化；分化 2级，为中度分化；分化 3级，为低度分化。卵巢恶性肿瘤的病理分级、分期根据国际妇产科联盟（Fdr

5、ation Internationale de Gyncologie et dObsttrique,FIGO）2000年修订的临床分期标准来判断临床期别：卵巢恶性肿瘤的手术-病理分期 FIGO TNM 0 原发肿瘤无法评价 TX 无原发肿瘤证据 T0 肿瘤局限于卵巢 T1 a 肿瘤局限于一侧卵巢，包膜完整，表面无肿瘤，T1a 腹水或腹腔冲洗液中未查见恶性细胞。b 肿瘤局限于两侧卵巢，包膜完整，表面无肿瘤，T1b 腹水或腹腔冲洗液中未查见恶性细胞。c 肿瘤局限于单侧或双侧卵巢，伴有以下任何一项者：T1c 包膜破裂、卵巢表面有肿瘤、腹水或冲洗液中有恶性细胞。肿瘤累及一侧或双侧卵巢，伴盆腔内转移。T

6、2 a 肿瘤蔓延和/或转移到子宫和/或输卵管，T2a 腹水或冲洗液中无恶性细胞。b 肿瘤蔓延到盆腔其它组织，腹水或冲洗液中无恶性细胞。T2b c a 或b 病变，但腹水或冲洗液中查见恶性细胞。T2b 肿瘤侵犯一侧或双侧卵巢，镜检证实盆腔外有腹膜转移 T3 和/或 N1 和/或区域淋巴结转移。a 镜检证实盆腔外腹膜转移超出盆腔外。T3a b 盆腔外腹膜大块转移灶最大径线2cm T3b c 盆腔外腹膜转移灶最大径线2cm，T3c 和/或 N1 和/或区域淋巴结转移 远处转移（腹膜转移除外）M1 注：肝包膜转移为 T3/期，肝实质转移为 M1/期。胸膜渗出液必须有阳性细胞才能分为 M1/期。N0-无

7、区域淋巴结转移，N1-区域淋巴结转移。M0-无远处转移，M1-远处转移（腹膜转移除外）。化疗效果判断标准：判断标准参照曾益新主编的肿瘤学第 2 版第 410 页，以临床检查，CA-125 和影像学检查结果来判断，肿瘤完全消失超过一个月为完全缓解（complete remission,CR）；肿瘤体积缩小超过 50%且持续一个月以上为部分缓解（partial remission,PR）；肿瘤体积增大超过 50%或有新病灶的出现为进展（progressive,P）；肿瘤体积变化不超过 25%为稳定（Stable,S）。对化疗敏感的定义：完全缓解与部分缓解均为敏感，对化疗有反应。对化疗耐药的定义：进

8、展与稳定均为耐药，对化疗无反应。随访：生存时间的计算方法为从接受治疗之初到随访结束或者死亡之时。经门诊随访或者电话和信件随访。主要仪器 超速低温离心机-德国西门子公司 TGL-16C台式高速离心机 -上海安亭科学仪器厂 Gel doc 2000 凝胶成像分析系统 -美国 Bio-Rad 公司 紫外可见分光光度计 -北京普析通用仪器有限责任公司 普通PCR扩增仪-美国热电公司Thermo electron corporation 电动玻璃匀浆机-宁波玻璃仪器厂 OLYMPUS光学显微镜-日本OLYMPUS公司 恒温水浴箱-国产 冰浴加样盒-国产 桥式水平电泳仪槽-北京崇文东方仪器厂 DYY-型稳

9、压稳流电泳仪-北京六一仪器厂 Eppendorf管-国产 各式微量移液器-美国 Gilson公司 超低温冰箱-中国海尔公司 Chromo4 Real-Time PCR Detector实时荧光定量 PCR 仪-购自美国 Bio-rad 公司；荧光定量 PCR 管薄壁美国 Cepheid 公司 Smartcycler 主要试剂及配制(1)TRizol 试剂 购自 Invitrogen 公司(2)First Strand cDNA Synthesis Kit 逆转录试剂盒 购自 MBI Fermentas 公司，内含：M-Mulv 反转录酶 Oligo(dT)18 g/l)高浓度 dNTP 10m

10、M dNTP RNA酶抑制剂 Rnasin inhibitor 5reaction buffer(3)Taq PCR Master Mix 购自 TIANGEN生物有限公司 (4)异丙醇、无水乙醇 国药集团化学试剂有限公司(5)焦碳酸二乙酯(DEPC)上海生物工程公司(6)三氯甲烷（氯仿）东风化工厂(7)溴化乙锭 EtBr 上海生物工程公司(8)琼脂糖 上海捷瑞生物技术公司(9)50TAE BIOWEST AGAROSE 公司(10)50bp Ladder DNA Marker 购自 大连宝生物公司 1.6.1 主要试剂的配制(1)%DEPC 水配制 焦碳酸二乙酯（DEPC）是 RNA酶的强烈

11、抑制剂，所有接触 RNA的器具均需经过含%的 DEPC 的水浸泡过夜以便去器具上面沾染的 RNA酶，浸泡后高温高压消毒。1000ml双蒸水中加入 1ml DEPC，充分震荡混匀，配制成含%DEPC 的水备用。含%DEPC 的水放置过夜，大概 16 小时后，吸取 100ml，经高温高压 30min 后，即可除去 DEPC，成为不含 RNA酶的水。可用于 RNA的提取和逆转录。(2)RNA酶的去除 RNA酶可以降解 RNA,破坏 RNA的完整性,影响试验结果，所以在提取 RNA的整个过程都要严防 RNA酶的存在。为减少 RNA酶的污染，所用的 Tip头、Eppendorf离心管等塑料制品均先用%二

12、乙基焦碳酸酯(DEPC 水)浸泡过夜，后高压消毒除去残存的DEPC，进口塑料管已经过射线消毒，可直接使用；其它玻璃、陶瓷器皿均需先水洗晾 干后，再经重铬酸钾-硫酸洗液浸泡过夜，洗净后 200干烤 4-6小时，方能使用。所以物品均现配现用。(3)EtBr溶液的配制 溴化乙锭 EtBr是有毒物质，皮肤不可以直接接触，整个配置过程都要戴橡胶手套，在通风厨中进行。配置的溴化乙锭贮存浓度为 10mg/ml，工作液的浓度为 200g/ml。首先将溴化乙锭 0.5g溶解于 50ml三蒸水中，充分搅拌溶解后放置于棕色瓶中4避光保存。使用时取 10mg/ml 的贮存液 200l 稀释于 10ml 三蒸水中。（4

13、）50TAE电泳缓冲液的配制 Tris 12.1g L EDTA(PH=冰醋酸 首先称取 Tris12.1g 加入 40ml三蒸水中，依次加入L EDTA(PH=，冰醋酸，充分搅拌溶解后用三蒸水补足至 50ml，高压灭菌后室温保存，作为贮存液。使用时，取 20ml加蒸馏水至 1000ml，即得 1TAE的工作液。（5）不同浓度琼脂糖凝胶配制 琼脂糖凝胶 50ml 琼脂糖 0.5g 1TAE 50ml 琼脂糖凝胶 50ml 琼脂糖 0.75g 1TAE 50ml 称取所需剂量的琼脂糖粉末，加入所需体积的 TAE缓冲液中，置于微波炉中间断加热，使琼脂糖完全溶解，其间不断缓慢摇动锥形瓶，使贴于壁上的

14、琼脂充分溶解。冷却至 50左右，加入 200g/ml 溴化乙锭(EB 液)125l 混匀(使终浓度为g/ml)。2 方法 试验前 RNA 酶的去除：采用 Trizol 试剂一步法提取卵巢组织 RNA：为减少 RNA酶的污染，该方法中所用的 Tip头、Eppendorf离心管等塑料制品均先用%二乙基焦碳酸酯(DEPC 水)浸泡过夜，高压消毒除去残存的 DEPC。进口离心管已经过射线消毒，可直接使用；其它玻璃、陶瓷器皿均需先水洗晾干后，再经重铬酸钾-硫酸洗液浸泡过夜，洗净后 200干烤46小时，方能使用。一般去除 RNA酶的用具立即使用。人的皮肤是 RNA酶污染的重要来源，用具处理过程中和试验过程

15、中均主意戴手套和帽子。空气中含有 RNA酶，去除 RNA酶的用具需要用布包裹，容器需要盖上盖子，且不宜放置过久。2.1.2 总 RNA 提取 RNA是极易受到 RNA酶的降解，在提取 RNA过程中最关键的是抑制 RNA酶活性,所以的用具均需经过含%DEPC 的水浸泡过夜后高温高压消毒。RNA提取基本原理是通过变性剂破碎细胞或者组织，然后经过氯仿等有机溶剂抽提 RNA，再经过沉淀，洗涤，晾干，最后溶解。已经有商品化的 RNA提取试剂盒出售，如美国 Invitrogen 公司的TRIZol 和日本 Takara 公司的 RNAiso。本试验采用美国 Invitrogen 公司的 TRIZol 试剂

16、提取 RNA。TRIZol 为高浓度强变性裂解液，可迅速破坏细胞结构，使 RNA从细胞中释放出来，同时 Trizol 试剂还含有 Rnase 抑制剂使细胞内 RNA酶失活，RNA不被降解，同时氯仿能将细胞碎片、DNA、蛋白质与 RNA 分离开来，得到纯化的总 RNA，焦碳酸二乙酯(DEPC)是一种强烈的 RNA酶抑制剂，用它来浸泡实验所用器具，及配制 70%乙 醇，保证实验过程不产生 RNA酶污染，并且使所得 RNA有较高的纯度，几乎不含有基因组 DNA。实验步骤：本次研究采用美国 Invitrogen 公司生产的 Trizol 试剂一步法提取卵巢组织总 RNA，以便得到高质量的 RNA，对卵

17、巢癌组织中的目的 mRNA进行定量分析。具体步骤如下：(1)从液氮罐内取出保存的卵巢癌组织，并逐一核对住院号和姓名，剪取约 200mg卵巢癌组织迅速置于液氮中，在液氮中使用研钵将卵巢癌组织研磨成粉末后加入 Trizol 试剂 1mL，充分混匀。(2)Trizol充分溶解后的卵巢癌组织浆转入离心管中，加氯仿，充分振荡混匀，冰浴 15min。(3)在 4低温 13000rpm，离心 15min。(4)小心吸取上层水相至另一离心管中，RNA存在于上层水相，在吸取时注意不要吸到蛋白层或有机相，以免蛋白等杂质的污染。加等体积异丙醇，摇匀，室温放置10min，在 4低温 13000rpm，离心 15min

18、，沉淀 RNA。(5)加 70%乙醇漂洗沉淀，在 4低温 5000rpm，离心 10min，小心弃去乙醇，空气中干燥 10min。(6)加入 40l 经 DEPC 处理过的，不含 RNA酶的双蒸水完全溶解总 RNA。2.1.3 总 RNA 的定量及纯度测定：为了检测所提取 RNA的纯度和质量，使用紫外分光光度计测量 RNA溶液的吸光值，并使用琼脂糖凝胶电泳检测条带。(1)总 RNA 定量分析：用 ddH2O稀释 3LRNA 样品至 150L，充分混匀；用紫外分光光度仪测总 RNA的 OD260、OD280的吸光值，计算 OD260/OD280比值，比值大 于，表明纯度符合要求，如低于此值，表明

19、存在蛋白质污染，需重新用酚/氯仿抽提。通过 OD260值计算 RNA总浓度：总 RNA浓度(ug/L)=(A260 40稀释倍数)/1000(2)琼脂糖凝胶电泳检测 RNA 的完整性：选用专用电泳槽、制胶板、梳子，先用无水乙醇擦洗，晾干后用DEPC 处理过的 ddH2O彻底冲洗，再用无水乙醇洗一次，待乙醇挥发后即可使用。制备 1琼脂糖凝胶，其中含有g/ml 的溴化乙锭以便使 PCR 产物在紫外灯下显色。取 2L总 RNA溶液加 1L上样缓冲液点样，以 5V/cm 稳压电泳，紫外灯下可见 28s、18s、5s 三条 rRNA的清晰条带，但是有时 5s 条带并不能总是理想的显示，本次研究所纳入的卵

20、巢癌组织有些在液氮中保存时间很久，有些不能清晰的显示5s 的 rRNA条带。结果见图。Bio-rad 凝胶成像仪成像，使用 quality-one软件分析知其 28S 条带亮度是 18S 亮度的 2倍。表明 RNA提取的质量很好，可以用于本次研究。逆转录 cDNA 2.2.1 逆转录引物的选择：以提取到的总 RNA作为模板，使用引物和逆转录酶逆转录成 cDNA.通常可以选用的引物有三种：1.胸腺嘌呤寡聚体 Oligo（dT）18 2.随机六聚体引物 random hexamer primer 3.序列特异的引物 sequence-specific primer 细胞内的 mRNA在 3端为 p

21、olyA，Oligo（dT）18作为引物与 polyA 互补，使用Oligo（dT）18作为引物能够将所提取的总RNA中含有 polyA 的 mRNA逆转录为cDNA，所得到的 cDNA 利于后续的 PCR 扩增基因全长，利于构建基因全长的载体，而且对于引物与总 RNA的比例要求不严体，不需要对引物与总 RNA的比例进行优化。随机六聚体引物为四种脱氧核糖核酸(A,T,G,C)的随机组合，使用此引物逆转录的cDNA长短不一，随机六聚体引物与总 RNA的物质的量的比例对所得到的 cDNA长度有关键性的影响，提高引物与总 RNA的比例能够得到较短的 cDNA 产物，通常小于500bp;如果降低引物与

22、总 RNA的比例则使长的 cDNA产物增长。因此实验前对随机六聚体引物与总 RNA的比例进行优化是必要的。序列特异的引物则适用于单管 RT-PCR(one tube),逆转录的引物是针对目的基因而设计的。Oligo（dT）18与随机六聚体引物适用于两管RT-PCR。(tow tube).本研究采用两管 RT-PCR 法，使用随机六聚体引物 random hexamer primer 作为逆转录引物以便得到较多的 cDNA 产物。2.2.2 逆转录酶的选择 目前广为使用的逆转录酶是四种，具体如下：1 Money 鼠白血病病毒（MMLV）反转录酶：有强的聚合酶活性，RNA酶 H活性相对较弱。最适作

23、用温度为 37。2 禽成髓细胞瘤病毒（AMV）反转录酶：有强的聚合酶活性和 RNA酶 H活性。最适作用温度为 42。3Thermus thermophilus、Thermus flavus 等嗜热微生物的热稳定性反转录酶：在Mn2+存在下，允许高温反转录 RNA，以消除 RNA模板的二级结构。4MMLV反转录酶的 RNase H-突变体：商品名为 SuperScript 和 SuperScript。此种酶较其它酶能多将更大部分的 RNA转换成 cDNA，这一特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的 mRNA模板合成较长 cDNA。本次研究采用 Fermentas公司的 Moloney Mur

24、ine Leukemia Virus reverse transcriptase，(M-MuLV RT),此酶具有低的 RNase H 活性,以便从较长的模板（最长可达13kb）中得到全长 cDNA 序列。2.2.3 具体步骤详细叙述如下：所有操作均在冰上进行。在 Eppendorf管内加入以下反应体系：总 RNA g 随机六聚体引物 random hexamer primer 1l RNase free水 至总体积 12l 稍离心混匀后，70反应 5 分钟，立即置于冰上冰浴 5 分钟 依次加入以下各成分：5Reaction Buffer 4l 10mMdNTP Mix 2l RNA酶抑制剂(

25、RiboLock Ribonuclease inhibitor)(20u/l)1l 稍离心混匀各成分，由于使用了随机六聚体引物random hexamer primer，故此步骤在 25下反应 5分钟。加逆转录酶M-MuLV(200u/l)1l 由于使用了随机六聚体引物random hexamer primer，故此步骤首先在25反应 10分钟，然后在42反应 60分钟。7210分钟灭活逆转录酶 迅速置于冰浴中5 分钟，以防 cDNA结合成双链-20保存。质量检测：制作含有g/ml 溴化乙锭的%琼脂糖凝胶，然后加入逆转录产物 4l 及上样缓冲液 2ul，电泳使溴酚蓝前移 2cm 左右，凝胶成像

26、分析仪可见较宽的电泳区带呈片状。TaqMan 实时荧光定量 PCR 实验原理：定义：实时荧光定量 PCR 技术，是指在 PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个 PCR 进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。实时荧光定量 PCR 技术是 DNA 定量技术的一次飞跃。运用该项技术，可以对 DNA、RNA 样品进行定量和定性分析。定量分析包括绝对定量分析和相对定量分析。前者可以得到某个样本中基因的拷贝数和浓度；后者可以对不同方式处理的两个样本中的基因表达水平进行比较。除此之外还可以对 PCR 产物或样品进行定性分析：例如利用熔解曲线分析识别扩增产物和引物二聚体，以区

27、分非特异扩增；利用特异性探针进行基因型分析及 SNP 检测等。目前实时荧光 PCR 技术已经被广泛应用于基础科学研究、临床诊断、疾病研究及药物研发等领域。原理：聚合酶链式反应(PCR)可对特定核苷酸片断进行指数级的扩增。在扩增反应结束之后，可以通过凝胶电泳的方法对扩增产物进行定性的分析，也可以通过放射性核素掺入标记后的光密度扫描来进行定量的分析。无论定性还是定量分析，分析的都是 PCR 终产物。而实时荧光定量 PCR 则是通过对 PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。在实时荧光定量 PCR 反应中，引入了一种荧光化学物质，随着 PCR 反应的进行

28、，PCR 反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图：Fig Threshold value curve and CT value 曲线阈值与 Ct 值 荧光扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段，荧光信号指数扩增阶段和平台期。在荧光背景信号阶段，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，无法判断产物量的变化。而在平台期，扩增产物已不再呈指数级的增加，所以 PCR 的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，根据最终的 PCR 产物量不能计算出起始 DNA 拷贝数。只 有在荧光信号指数扩增阶

29、段，PCR 产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，可以选择在这个阶段进行定量分析。为了定量和比较的方便，在实时荧光定量 PCR 技术中引入了两个非常重要的概念：荧光阈值和 CT 值。荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数被称为 CT 值（threshold value）。CT 值与起始模板的关系研究表明，每个模板的 CT 值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，CT 值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表 CT 值。

30、因此，只要获得未知样品的 CT 值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。Fig Standardard curve 实时荧光定量 PCR 的标准曲线 实时荧光定量 PCR 的化学原理包括探针类和非探针类两种，探针类是利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增加，非探针类则是利用荧光染料或者特殊设计的引物来指示扩增的增加。前者由于增加了探针的识别步骤，特异性更高，但后者则简便易行。SYBR Green I 是一种结合于小沟中的双链 DNA 结合染料。与双链 DNA 结合后，其荧光大大增强。这一性质使其用于扩增产物的检测非常理想。SYBR Green I的最大吸收波长约为 497nm，发射

31、波长最大约为 520nm。在 PCR 反应体系中，加入过量 SYBR 荧光染料，SYBR 荧光染料特异性地掺入 DNA 双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的 SYBR 染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与 PCR 产物的增加完全同步。SYBR Green I在核酸的实时检测方面有很多优点，由于它与所有的双链 DNA 相结合，不必因为模板不同而特别定制，因此设计的程序通用性且价格相对较低。利用荧光染料可以指示双链 DNA 熔点的性质，通过熔点曲线分析可以识别扩增产物和引物二聚体，因而可以、区分非特异扩增，进一步地还可以实现单色多重测 定。此外，由于一个 PCR 产物可以与多分子

32、的染料结合，因此 SYBR Green I的灵敏度很高。由解链曲线来分析产物的均一性有助于分析由 SYBR Green I得到定量结果。一般而言，探针法比染料法（如 SYBR Green I）最广泛使用的 TaqMan 探针就是运用了这个原理。PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团，此时5端荧光基团吸收能量后将能量转移给临近的 3端荧光淬灭基团（发生荧光共振能量转移，FRET），因此探针完整时，检测不到该探针 5端荧光基团发出的荧光。但在 PCR 扩增中，溶液中的模板变性后低温退火时，引物与探针同时与模板结合

33、。在引物的介导下，沿模板向前延伸至探针结合处，发生链的置换，Taq 酶的 5-3外切酶活性（此活性是双链特异性的，游离的单链探针不受影响）将探针 5端连接的荧光基团从探针上切割下来，游离于反应体系中，从而脱离 3端荧光淬灭基团的屏蔽，接受光刺激发出荧光信号，即每扩增一条 DNA 链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR 产物形成完全同步。2.3.1 引物设计和内参基因的选择 为了去除不同标本在 RNA的产量、质量以及逆转录效率上可能存在的差别而获得目标基因特异性表达的真正差异,通常选择一定的内参基因进行校正和标准化。内参基因扩增中的变化可以反映 RNA产量、质量和/或 cDNA合

34、成效率的变化。选择适当的内参基因以减少检测标本间的差异是必须的。内参基因应具备的条件理想的内参基因应该满足以下条件:不存在假基因(pseudogene),以避免基因组 DNA的扩增;高度或中度表达,排除太高或低表达;稳定表达于不同类型的细胞和组织(如正常细胞和癌细胞),而且其表达量是近似的,无显着性差别;表达水平与细胞周期以及细胞是否活化无关;其稳定的表达水平与目标基因相似;不受任何内源性或外源性因素的影响,如不受任何实验处理措施的影响。排除内参基因的条件则为:在正常和异常的细胞/组织中的表达存在差异;呈现细胞周期依赖的表达;定位于 X染色体。本次研究选择人 beta-actin 作为内参基因

35、，可以满足以上条件。采用第二章已经建立起来到 TaqMan实时荧光定量 RT-PCR 平台，设计的 TaqMan探针和引物如下：引物名称 序列(53)引物特征 产物长度 bp TERCC1 ATACCCCTCGACGAGGATGAG 第 II 外显子末端 77 ACAGTGGGAAGGCTCTGTGTAGA 第 III 外显子始端 FAM-CGGAATAAGGGCTTGGCCACTCCA-TAMRA 第 II 与 III 外显子连接处 ASERCC1 CCAGCGGACCTCCTGATG 第 VII 外显子末端 151 和 79*CTCTTGATGCGGCGATGAG 第 IX 外显子始端 F

36、AM-AGGACTTCGTCTCCCGGTCTCTGGAAC-TAMRA 第 VII 与 IX 外显子连接处 TaqMan beta-actin GGCACCCAGCACAATGAA 18 98 GGAAGGTGGACAGCGAGG 18 FAM-CAAGATCATTGCTCCTCCTGAGCGC-TAMRA 25 2.3.2 引物和探针的溶解稀释 由于合成后的引物 Olig Primer 和 Probe呈膜状附在管壁上，在使用前先瞬时离心，再轻轻打开管盖。加入灭菌的去离子水，稀释成 100 mol/ml 的贮存液，在使用前调整终浓度至所需的浓度，置于-20保存。在稀释成工作液时，使 Prim

37、er 的浓度为 50 mol/l，Probe的浓度为 10mol/l。2.3.3 标准品的构建与标准曲线的扩增 将构建成果的质粒转化入大肠杆菌后提取质粒，按10倍浓度梯度依次稀释做为标准品，以此为模板制作标准曲线。每个标本均在三个反应体系中同时用三套引物进行扩增，每个标本重复三次。每次均同时设置3 个标准曲线。每个组织标本的 ERCC1 的拷 贝数除以其内参 beta-actin 的拷贝数，其商值作为统计分析的数值。标准品的构建详见第二章。2.3.4 TaqMan 实时荧光定量 PCR 检测 mRNA 表达水平 首先将整个反应条件进行优化，优化后的分析效率在95%105%，且相关系数在之间，每

38、个 10倍的浓度梯度之间的 Ct 值相差在左右，标准曲线的斜率在左右。在冰上溶解所需试剂，使用 cool start技术避免非特异性扩增。TaqMan探针注意避光，配制过程中将 PCR 反应管用锡箔纸包裹避光。在冰上配制如下试剂：试剂 体积（l）Taq 酶(5Ul-1)10PCR Buffer（Mg2+Free）5 MgCl2(25mmoll-1)3 dNTP Mixture(各 mmoll-1)4 模板质粒 5 Primer Forward（50 moll-1)1 Primer Reverse（50moll-1)1 TaqMan Probe(10mol/l)无菌水 加水至 50l TaqMa

39、n荧光定量 PCR 反应温度和时间控制：95预变性 3min；94变性 1min,60退火和延伸 1min,荧光探测；45个循环；于 10保存。TaqMan 实时荧光定量 PCR程序设置 Program for TaqMan Real-time quantitative PCR(Draw by Jiang Sheng)每个标本均在三个反应体系中同时用三套引物进行扩增，每个标本重复三次。每次均同时设置 3个标准曲线。统计分析 根据临床资料，按照患者对化疗的反应性，将患者区分为化疗敏感组和化疗耐药组，使用成组 t 检验比较 ERCC1 在化疗敏感和耐药组间的表达差异，取双侧，以=为检验水准。以 E

40、RCC1 mRNA表达量的中位值为界分为 ERCC1 高表达组和低表达组，对随访资料的生存分析采用 Kaplan-Meier 法。使用 log-rank test 对数秩检验对生存期进行统计检验。将可能影响卵巢癌患者化疗反应的因素进行 Logistic多因素统计回归，将有关影响卵巢恶性肿瘤患者生存期的因素进行 Cox 比例风险回归模型分析。数据录入使用软件Microsoft Excel 2003,统计数据处理使用软件 for windows 进行。3.结果 病人一般资料 所纳入的 63例卵巢癌患者中位年龄 49岁（27岁67岁）。根据国际妇产科联盟（Fdration International

41、e de Gyncologie et dObsttrique,FIGO）2000 年修订的临床分期标准来判断临床期别，结果：I期 4 例（%），II期 6例（%），III 期 45 例（%），IV期 8例（%）。纳入卵巢癌患者的临床期别 Clinical stage of the included ovarian cancer patients 期别 例数 构成比%I期 4%II期 6%III期 45%IV 期 8%总计 63 100%另，按世界卫生组织（World Health Organization，WHO）1973年制定的卵巢组织学分类法进行组织学的分类，结果如下：浆液性囊腺癌16例（

42、%），粘液性囊腺癌 23 例（%），透明细胞癌 7 例（%），子宫内膜样癌 9 例（%），其它上皮性卵巢癌 8例（%）。纳入卵巢癌患者的组织学类型 Histology type of the included ovarian cancer patients 组织学分类 例数 构成比%浆液性囊腺癌 16%粘液性囊腺癌 23%透明细胞癌 7%子宫内膜样癌 9%其它上皮性卵巢癌 8%总计 63 100%另，按世界卫生组织（World Health Organization，WHO）1973年制定的卵巢组织学分类法进行组织学的分级，G1高度分化例（%），G2 中度分化 20 例（%），G3低度分化 3

43、2 例（%）。纳入卵巢癌患者的组织学分级 Cell differentiation of the included ovarian cancer patients 组织学的分级 例数 构成比%高度分化 11%中度分化 20%低度分化 32%总计 63 100%TaqMan 实时荧光定量 RT-PCR 检测 mRNA 使用构建好的 TaqMan 实时荧光定量 RT-PCR平台检测卵巢癌组织中的 ERCC1 基因总量 mRNA，缺失第 8 外显子的 ERCC1变异剪接体的表达量，分析效率在 95%105%，且相关系数在之间，每个 10倍的浓度梯度之间的 Ct 值相差在左右，标准曲线的斜率在左右。加

44、图 卵巢癌组织 ERCC1 表达与化疗敏感性的关系 63例患者中有 34 例（%）对化疗敏感，其中 11人的 ERCC1 mRNA表达高于中位值，23人低于中位置；29 例（%）对化疗耐药，其中 20人的 ERCC1 mRNA表达高于中位值，9人低于中位置。耐药组的 ERCC1表达水平明显高于敏感组。缺失第 VIII外显子 ERCC1 变异剪接体的表达个体差异甚大，最高值是最低值的 70倍，占 ERCC1 mRNA总量比例变化亦甚大，从%到%。统计分析表明，缺失第 VIII外显子变异剪接体的表达量与卵巢癌化疗反应性无关。在总量中去除变异剪接体的量后，ERCC1 全长mRNA的表达水平与化疗敏感

45、性具有更低的 P 值。ERCC1 mRNA 相对表达量与化疗敏感性的关系 The association of Chemotherapy response and ERCC1 mRNA expression mRNA 表达量（均数SD）敏感 24 例 耐药 21 例 总 ERCC1 P=缺失第 VIII 外显子变异剪接体 P=全长 ERCC1 P=使用 Logistic回归模型（Logistic regression model）对影响化疗反应的因素进行多因素统计分析，结果显示临床分期，病理学分级和组织学类型以及缺失第 VIII外显子变异剪接体不是影响患者化疗反应的因素，ERCC1 mRNA表

46、达水平（总量）是影响患者化疗反应的因素。卵巢癌患者化疗反应与临床病理的 Logistic 回归结果 Logistic results of chemotherapy response and clinical pathology 变量 回 归系数 标 准误 自 由度 P 值 OR 95%可信区间下限 95%可信区间上限 临床分期 1 病理学分级 1 组织学类型 1 变异剪接体 1 ERCC1 表达水平 1 卵巢癌组织 ERCC1 表达与患者生存期的关系 随访时间为 285月，平均随访 37月，生存时间的计算方法为从接受治疗之初到随访结束或者死亡之时。截尾 17例（%），死亡 46例（%）。Lo

47、g-rank test 分析表明，ERCC1 mRNA 表达量与患者的生存期相关(P=，缺失第 VIII外显子变异剪接体的表达量与患者的生存期不存在相关性（P=），在总量中去除变异剪接体的量后，ERCC1 全长mRNA的表达水平与生存期具有更低的 P 值。患者 ERCC1 mRNA 表达量高低组生存曲线比较 Log-rank test 表明，ERCC1 mRNA 表达的总量 TT 与全长 FL 与患者的生存期相关，缺失第 VIII 外显子的变异剪接体 AS 与患者的生存期无关。Survival curve of ovarian cancer patients 使用 Cox 比例风险模型（Cox

48、s proportional hazard model）对影响患者预后的因素进行多因素分析，结果显示临床分期，病理学分级和 ERCC1 mRNA（总量）是影响患者预后的因素，而组织学类型和 ERCC1 缺失第 VIII 外显子变异剪接体不是影响患者预后的因素。临床病理与患者预后关系的 Cox 比例风险回归模型 Cox regression results of survival time and clinical pathology 变量名 偏回归系数 标准误 P值 RR值 下限 上限 临床分期 病理学分级 组织学类型 变异剪接体 ERCC1 表达水平 4 讨论 真核生物中的变异剪接 从 19

49、77年 Walter Gilbert提出可变剪接概念，1980年 Baltimore在小鼠 IgM 基因发现第一个可变剪接产生膜型、分泌型 IgM，至 2001 年，用经典分子生物学实验的方法 研究，一共仅发现了数百种有可变剪接的基因。并推测在高级真核细胞生物约 5的基因有可变剪接。在卵巢癌的发生发展中也伴随着一些基因的变异剪接10。据预测，人类基因组可能有约 35,000 个基因，果蝇约 14,000 个，而简单的模式生物线虫约 19,000 个基因。生物的复杂性与其基因组基因数量似乎存在明显差异。其原因在于蛋白质组、基因重排，RNA编辑，和变异剪接等机制可以从一个基因产生多种蛋白，从而使蛋

50、白质组中蛋白质的数量超过基因组中基因的数量。其中，从影响的基因数量和生物种类范围来看，可变剪接是扩大蛋白质多样性的最重要的机制 真核细胞基因表达所转录出的前提 mRNA的剪接过程中，参加拼接的外显子可以不按其在基因组的线性分布次序拼接，内含子也可以不被切除而保留，即一个外显子或内含子是否出现在成熟的 mRNA中是可以选择的，这种剪接方式称为选择剪接/变异剪接（alternative splicing）。现已发现的选择剪接方式主要有以下几种：1.外显子选择方式可保留或部分保留外显子：外显子选择(optional exon)也称外显子跳跃(exon skipping),是指在不同的剪接方式中，某一