5碱性磷酸酶米氏常数的测定全解优秀PPT.ppt

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1、试验九试验九碱性磷酸酶米氏常数碱性磷酸酶米氏常数的测定的测定一、目的要求一、目的要求1.学习和驾驭米氏常数（Km）及最大反应速度（Vm）的测定原理和方法，测出碱性磷酸酶在以对硝基苯酚磷酸为底物时的Km和Vm值。二、原理二、原理酶促反应v-S曲线vS推导出米氏方程为：其中S为底物浓度；v为初速度；Vm为最大反应速度；Km为米氏常数米氏常数Km是酶的一个基本特征常数，它包含着酶与底物结合和解离的性质。特殊是同一种酶能够作用于几种不同底物时，米氏常数Km往往可以反映出酶与各种底物的亲和力的强弱。测定Km和Vm，可通过作图法求得。最常用的Lineweaver-Burk双倒数作图法。这个方法是将米氏方程

2、转化为倒数形式，即：以1/v对1/S作图，可得一条直线1/v1/Vm-1/Km1/S本试验测定碱性磷酸酶催化对硝基苯磷酸钠盐(pNPP)水解的Km和Vm.反应式：pNPP+H2OpNP+HPO42-无色黄色可通过分光光度法测定产物pNP的含量，求出反应速度v。三、试剂与器材三、试剂与器材试剂：0.5mol/mLpNP、10mmol/LpNPP、20mmol/LMgCl2、0.1mol/L碳酸钠碳酸氢钠pH10.1缓冲液、0.1mol/LNaOH、6 g/mL碱性磷酸酶酶液器材：恒温水浴锅、722分光光度计四、操作方法四、操作方法（一）对硝基苯酚标准曲线的制作（不做）取5支试管编号,0号一支,1

3、7号各二支,按下表操作：管号0123456pNP含量(mol)00.050.100.150.200.250.300.5mol/mLpNP(mL)00.10.20.30.40.50.6H2O(mL)0.80.70.60.50.40.30.2Na2CO3-NaHCO3(mL)各管加入1.0mL20mmol/LMgCl2(mL)各管加入0.2mL0.1mol/LNaOH(mL)各管加入2.0mLOD405nm以对硝基苯酚的确定量(mol数)为横坐标，OD405nm值为纵坐标，绘制标准曲线。求出pNP的克分子消光系数()值。(二）测定15支试管，1-5做两组平行测定管，01-05作为空白比照。No.1

4、2345底物终浓度S(mM)0.50.751.01.5310mmol/LpNPP（mL）0.10.150.20.30.6蒸馏水（mL）0.50.450.40.30碳酸盐缓冲液（mL）各加1.0mL20mmol/LMgCl2（mL）各加0.2mL预热混匀，37，5分钟酶液（mL）测定管各加0.2mL酶液反应时间37，精确反应10分钟0.1mol/LNaOH（mL）各加2mL酶液（mL）空白管各补加0.2mL酶液OD405（三）数据处理各管在722分光光度计测定波长405nm的OD值(OD405nm)。从对硝基苯酚标准曲线上查出OD405nm相当于产物对硝基苯酚的含量(mol数),计算出各种底物浓

5、度下的初速度vo（单位以molL-1min-1表示），取倒数1/v填入表内。以1/v对1/S作图，求出酶催化pNPP水解的米氏常数Km和最大反应速度Vm。五、五、留意事项留意事项取液量确定要精确。取液量确定要精确。反应时间确定要精确。反应时间确定要精确。加酶前后确定要将试剂混匀。加酶前后确定要将试剂混匀。空白比照确定要先加空白比照确定要先加NaOH，后加酶。，后加酶。测定测定OD405时要以各自的空白调零点。时要以各自的空白调零点。移液管或取液器的运用移液管或取液器的运用比色杯的运用比色杯的运用六、思索题六、思索题(1)试试说说明明米米氏氏常常数数Km的的物物理理意意义义和和生生物物学意义。学意义。(2)为为什什么么说说米米氏氏常常数数Km是是酶酶的的一一个个特特征征常常数而数而Vm则不是？则不是？