《代谢考题答案》word版.doc

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1、1. 微生物代谢工程定义、研究内容和研究手段定义：代谢工程是利用分子生物学原理系统分析细胞代谢网络, 并通过 DNA 重组技术和应用分析生物学相关的遗传学手段对细胞进行有精确目标的基因操作, 改变微生物原有的代谢或调节系统, 实现目的产物代谢活性的提高；研究内容：生物合成相关代谢调控和代谢网络理论； 代谢流的定量分析； 代谢网络的重新设计；中心代谢作用机理及相关代谢分析；基因操作。研究手段：(1)检测技术：常规的化学和生物化学检测手段都可用于代谢工程的研究。这包括：体内确定代谢流的物料平衡和同位素标记示踪方法；表征酶促反应进程和性质的酶促反应动力学分析方法;测定同位素富集和关键代谢物相对分子质

2、量分布的光谱学方法(核磁共振、质谱、液相色谱分析和气相色谱分析等)；生物传感器技术。根据些检测信息可以判断和描述代谢流的基本状态，并为细胞的代谢流及其控制分析提供翔实可靠的原始数据。(2) 分析技术：在获得大量生化反应基本数据的基础上，采用化学计量学、分子反应动力学和化学程学的研究方法并结合先进的计算机技术，可以进一步阐明细胞代谢网络的动态特征与控制机理，以确定代谢改造的思路。这些分析手段包括能准确测定细胞内代谢网络流的稳态法、展示代谢流控制过程的扰动法、简化复杂代等提出的的组合法以及代谢网络优化技术等。 (3) 基因操作技术：在代谢工程中，代谢网络的操作实质上可以归结为基因水平上的操作。这个

3、过程涉及几乎所有的分子生物学和分子遗传学实验技术，如基因和基因簇的克隆表达、调控，DNA 的杂交检测与序列分析，外源DNA的转化，基因的体内同源重组与敲除，整合型重组DNA 在细胞内的稳定维持等。代谢工程技术得以广泛应用的一个重要前提就是外源基因在所有生物物种（包括人体）中转化和表达的可行性，而这种可行性又在很大程度上依赖于各种载体和基因表达调控元件的开发。2代谢改造思路和代谢设计原理代谢改造思路代谢工程研究的重点在于改造代谢网络，以便生产特定目的代谢产物或具有过量生产能力的工程菌应用于工业生产。根据微生物的不同代谢特性，常采用改变代谢流、扩展代谢途径和构建新的代谢途径三种方法。(1)改变代谢

4、途径方法 加速限速反应：增加限速酶的表达量，来提高产物产率。然而限速酶反应的改变可能会给整个代谢网络带来负面影响。 改变分支代谢途径流向：提高代谢分支点某一分支代谢途径酶活力，使其在与其它的分支代谢途径的竞争中占据优势，从而提高目的代谢产物的产量。 (2)扩展代谢途径 在宿主菌中克隆和表达特定外源基因，从而延伸代谢途径，以生产新的代谢产物和提高产率。扩展代谢途径还可使宿主菌能够利用自身的酶或酶系消耗原来不消耗的底物。 (3)转移或构建新的代谢途 通过转移代谢途径、构建新的代谢途径等方法来实现。 代谢设计原理现存代谢途径中改变增加目的产物代谢流 (1)增加限速酶编码基因的拷贝数：没有改变代谢流，

5、只是增加了酶的量，提高了中间物的浓度，从而提高限速反应的反应速率；(2)强化以启动子为主的关键基因的表达系统可以提高产物的转化率；(3)提高目标途径激活因子的合成速率 ；(4)灭活目标途径抑制因子的编码基因 ；(5)阻断与目标途径相竟争的代谢途径；(6)改变分支代谢途径流向：提高某一分支途径中的酶活力，从而使该分支途径在竟争中处于有利的地位。 (7) 构建代谢旁路：大肠杆菌糖代谢未端产物乙酸能抑制菌体的生长，应用代谢工程的方法将枯草芽孢杆菌的乙酰乳酸合成酶基因克隆到大肠杆菌中，构建新的代谢旁路，结果能明显的降低细胞中的乙酸浓度，使乙酸始终处于较低的水平。 (8)改变能量代谢途径：如将血红蛋白基

6、因导入大肠杆菌或链霉菌中，不仅在限氧条件下可以提高宿主细胞的生长速率，而且也可以促进蛋白和抗生素的合成。血红蛋白的作用在于在限氧条件下提高了ATP的产生效率。 在现存途径中改变物流的性质：指使手原有途径更换初始底物或中间产物，以达到获得新产物的目的。可以通过以下两种方法： (1) 利用酶对前体库分子结构的宽容性：如利用酶的相对专一性，投入非理想型初始底物参与代谢转化反应，就可以进而合成细胞原不存在的化合物。 (2) 通过修饰酶分子以拓展底物识别范围：修饰酶分子的结构域功能域，以扩大酶分子对底物的识别范围和催化范围。 在现存途径基础了扩展代谢途径：在宿主菌中克隆、表达特定外源基因可以延伸代谢途径

7、，从而生产新的代谢产物、提高产率。3微生物的基因操作技术有哪些？（举两例说明）技术：核酸的凝胶电泳：在生理条件下，核酸分子中的磷酸基团是离子化的，所以，DNA和RNA实际上呈多聚阴离子状态。将DNA、RNA放到电场中，它就会由负极正极移动，其迁移速度与电场强度成正比，与该分子所携带的净电荷数成正比，而与分子的磨擦系数成反比（分子大小、极性、介质的粘度系数等）。在凝胶电泳中，一般加入溴化乙锭染色，此时，核酸分子在紫外光下发出荧光，肉眼能看到约50ng DNA所形成的条带。核酸的分子杂交技术：在大多数核酸杂交反应中，经过凝胶电泳分离的DNA或RNA分子，都是在杂交之前，通过毛细管作用或电导作用按其

8、在凝胶中的位置原封不动地“吸印” 转移到滤膜上的。细菌的转化：指一种细菌菌株由于捕获了来自另一种细菌菌株的DNA，而导致性状特征发生遗传改变的生命过程。DNA序列分析：Sanger的双脱氧链终止法；DNA序列分析自动化基因的定点诱变：使已克隆基因或DNA片段中的任何一个特定碱基发生取代、插入或缺失变化的过程。利用DNA与蛋白质的相互作用进行核酸研究：DNase I 印迹试验；凝胶滞缓实验PCR技术例子：1） 基因定点突变，目前主要采用两种PCR方法：重叠延伸技术和大引物诱变法，在基因序列中进行定点突变。2）体外蛋白质相互作用技术 1、Far Western印迹技术 2、GST融合蛋白沉降技术

9、3、蛋白质芯片技术 4、等离子表面共振技术 5、免疫共沉淀技术4什么是酶的反馈抑制，以缬氨酸代谢途径来举例说明酶的反馈抑制是指生物合成途径的终产物反过来对该途径中第一个酶(调节酶)活力的抑制作用。例如，当细胞内氨基酸或核苷酸等终产物过量而积累的时候，积累的终产物反过来直接抑制该途径中第一个酶的活力，使整个合成过程减慢或停止，从而避免了不必要能量和养料浪费。反馈抑制是酶活力调节的一种主要方式，它具有调节精细、快速以及需要这些终产物时可以消除抑制再重新合成等优点。L-缬氨酸代谢途径如下图所示：见文献和下图5. 微生物酶的自动调节方式 （举两例说明）微生物并不是在所有空间、时间内合成它所能合成的全部

10、酶，在一定生理条件下，微生物只合成它当时所需要的酶；存在于细胞内的酶活力是受到控制的，酶的催化过程必须与细胞对能量和细胞组分的需求相协调。微生物酶的自动调节主要分为以下几个不同水平的调节1.1转录水平上的调节 酶的诱导的机制 酶的诱导对于微生物是十分有意义的。从营养的角度看，微生物可以根据环境所提供的生长底物，诱导合成相应的酶(蛋白质)，以分解生长底物，吸收营养，进行代谢活动，从而加强微生物对环境的适应能力。从细胞经济的角度看，仅仅根据需要诱导合成必要的酶(蛋白质)，可以避免核苷酸、氨基酸和代谢能的浪费。 营养阻遏的机制 在用混合碳源培养大肠杆菌的研究中发现，细胞只生成能降解培养基中能最迅速被

11、同化的碳源的酶系，而用来降解其他碳源的酶系的合成在该碳源用完前一直受到阻遏。过去曾假设，是能被迅速同化的碳源(如葡萄糖)降解过程中的某代谢产物阻遏了其余降解酶系的合成，因此把这种现象叫做“降解物阻遏”。 终端产物对其自身合成途径的酶的合成的反馈阻遏和弱化的机制许多氨基酸生物合成途径不但受该氨基酸本身的调节而且受其对应的氨基酰tRNA的调节，前者指的是反馈阻遏，也就是氨基酸合成途径的终端产物(与氨基酸合成途径相对应的氨基酸)作为辅阻遏物阻碍转录的发动；后者指的是叫做弱化的另一种类型的控制，这种控制涉及到与合成途径的终端产物氨基酸相对应的氨基酰tRNA和转录的终止，即当细胞中存在过量的对应氨基酰t

12、RNA时，已发动的转录会在(操纵子的)第一个结构基因被转录前终止。简而言之，阻遏控制转录的开始，弱化控制转录的终止。1.2 翻译水平上的调节 包括两层意思，其一是对翻译速度的调节；其二是对已译成的、会成为细胞的包袱的蛋白质分子的破坏性降解。 1.3 蛋白质水平上的调节 变构蛋白和变构酶的调节；共价调节酶的调节：可由共价修饰引起酶活性或（和）调节特性改变的酶叫共价调节酶。共价调节酶可以在另外一个酶（修饰酶）的催化下被共价地修饰，即在它分子上共价地结合上或者释放一个低分子量基团，从而使酶的活性 ( 有时还涉及调节性能 ) 发生变化。中心代谢途径的酶活性的调节；合成代谢途径的酶活性的调节。1.4 整

13、个细胞水平上的调节(全局性调节) 整个细胞水平的调节又称全局性调节(global control)，主要包括SOS响应系统(可诱导的复修系统)、热刺激响应、需氧-厌氧激励子控制、紧缩控制(stringent control)，此外还有氮同化和氮固定的调节、受磷酸盐饥饿控制的激励子的调节，以及 Lon 蛋白酶（即蛋白质分解的控制）的调节等。举例：酶的诱导调节机制：乳糖操纵子包括调节基因、启动基因、操纵基因和结构基因。大肠杆菌的lac操纵子受到两方面的调控：一是对RNA聚合酶结合到启动子上去的调控（阳性）；二是对操纵基因的调控（阴性）。 在含葡萄糖的培养基中大肠杆菌不能利用乳糖，只有改用乳糖时才能

14、利用乳糖。操纵子的调控机理是：当在培养基中只有乳糖时由于乳糖是lac操纵子的诱导物，它可以结合在阻遏蛋白的变构位点上，使构象发生改变，破坏了阻遏蛋白与操纵基因的亲和力，不能与操纵基因结合，于是RNA聚合酶结合于启动子，并顺利地通过操纵基因，进行结构基因的转录，产生大量分解乳糖的酶，这就是当大肠杆菌的培养基中只有乳糖时利用乳糖的原因。在含乳糖的培养基中加入葡萄糖时，不能利用乳糖的原因，即在lac操纵子的调控中，有降解物基因活化蛋白（CAP），当它特异地结合在启动子上时，能促进RNA聚合酶与启动子结合，促进转录（由于CAP的结合能促进转录，称为阳性调控方式）。但游离的CAP不能与启动子结合，必须在

15、细胞内有足够的cAMP时，CAP首先与cAMP形成复合物，此复合物才能与启动子相结合。葡萄糖的降解产物能降低细胞内cAMP的含量，当向乳糖培养基中加入葡萄糖时，造成cAMP浓度降低，CAP便不能结合在启动子上。此时即使有乳糖存在，RNA聚合酶不能与启动子结合，虽已解除了对操纵基因的阻遏，也不能进行转录，所以仍不能利用乳糖。酶的阻遏调节机制：色氨酸操纵子的调节：当培养基中色氨酸含量较高时，色氨酸与游离的辅阻遏蛋白相结合，并使其与操纵区DNA紧密结合；当培养基中色氨酸供应不足时，辅阻遏物失去色氨酸并从操纵区上解离，trp操纵子失去阻遏。6. 如何采用代谢工程进行缬氨酸育种？目前，世界利用发酵生产缬

16、氨 酸的出发菌株有北京棒杆菌（Corynebacterium pekineise）,谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutacium）,乳糖发酵短杆 (Brevibacterium lactofermentum),大肠杆菌属（Escherichia coli）, 黄色短杆菌（Brevibacterium flavum）, 粘质赛氏杆菌（Serratia marcescens）等，这些菌株均可以作为出发菌株选育出L-缬氨酸生产菌。工业发酵若想获得较高产量的目的产物，必须突破（或解除）微生物细胞自我调节控制机制，最常用且最有效的方法就是从遗传的角度选育解除微生物正常代谢调节机制的突

17、变 株。L-缬氨酸发酵生产的代谢调控育种的基本途径有：切断或改变平行代谢途径（选育营养缺陷型突变株），解除菌体自身的反馈抑制（选育抗反馈调节突变株），选育营养缺陷型恢复突变株，增加前体物质的合成，切断进一步代谢途径和利用基因工程技术构建缬氨酸工程菌。 (1)切断或改变平行代谢途径由图，缬氨酸和异亮氨酸的生物合成途径是平行进行的，缬氨酸、亮氨酸与异亮氨酸的生物合成 途径中公用了三种酶：即乙酰乳酸合成酶、乙酰乳酸异构还原酶和二羟基脱水酶。选育亮氨酸、异亮氨酸营养缺陷型突变株可以使用于合成三种氨基酸的公用酶系完全用于缬氨酸的生物合成，进而提高缬氨酸的产量。同时-乙酰异戊酸是合成缬氨酸和亮氨酸的共同前

18、体物。切断亮氨酸的合成途径不仅可以节省碳源而且解除了菌体生成缬氨酸酶系的反馈抑制和多价阻遏，使-异丙基苹果酸合成酶脱敏显著提高缬氨酸的产量。通过抑制醌氧化还原酶（PQO）和丙酮酸羧化酶（PCx）的活性来切断与缬氨酸合成无关的代谢流分支对碳源的消耗。使碳架物质相对集中地流向缬氨酸。2)解除菌体自身的反馈抑制缬氨酸合成中的第一个限速酶乙酰乳酸合成酶受缬氨酸的反馈抑制，同时缬氨酸和异亮氨酸的合成酶系受三个末端：即缬氨酸、异亮氨酸和亮氨酸的多价阻遏。因此，如果解除乙酰乳酸合成酶的反馈抑制和缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸生物酶系的阻遏，必将大大提高缬氨酸的积累。为此可选育缬氨酸结构类似物抗性突变株来解除缬氨酸

19、的反馈调节。常用的缬氨酸结构类似物有2-噻唑丙氨酸（2-TA）、-氨基丁酸（-AB）、氟亮氨酸、缬氨酸等。(3)增加前体物质的合成由图可以看出生物合成的前体物质是丙酮酸，为了积累更多的缬氨酸，必须提高丙酮酸的产量。通过筛选丙酮酸脱氢酶（PDHC）缺陷菌株或者抑制醌氧化还原酶（PQO）和丙酮酸羧化酶（PCx）的活性都可以来增加丙酮酸的积累。根据上述选育突变株的几条途径可选育组合型突变株，如营养缺陷型突变株和抗性结构类似物双重突变株，以提高目的产物的产量。7简述工业发酵的五字策略（结合研究实例说明）在代谢网络假说、微生物细胞机器的工作模式和微生物代谢的五段式的基础上，提出了工业发酵菌种选育和工艺控

20、制的五字策略，简称工业发酵的五字策略。 工业发酵的五字策略的示意图： 这五个字的含义分别是： 进：促进细胞对碳源等营养物质的吸收； 通：使来自上游和各个注入分支的碳架物质能畅通地流向目的产物； 节：阻塞与目的产物的形成无关或关系不大的代谢支流，使碳架物质相对集中 地流向目的产物； 堵：消除或削弱目的产物进一步代谢的途径； 出：促进目的产物向胞外空间分泌。如上图所示缬氨酸的代谢路径。1缬氨酸、亮氨酸与异亮氨酸的生物合成途径中公用了三种酶，即乙酰乳酸合成酶、乙酰乳酸异构还原酶和二羟基脱水酶。选育亮氨酸、异亮氨酸营养缺陷型突变株可以使用于合成三种氨基酸的公用酶系完全用于缬氨酸的生物合成，进而提高缬氨

21、酸的产量。这样就使来自上游碳架物质能畅通地流向目的产物，相当于五字策略中的通。2通过删除pfkA基因来抑制磷酸葡萄糖异构酶从而阻断糖酵解的合成，改变碳流方向朝着EMP途径，从而提高NADPH的合成，其有利于氨基酸的合成。3通过超表达与缬氨酸合成直接相关的酶基因ilvBN,ilvC,ilvD,ilvE基因来使碳源物质丙酮酸更通畅的流向目的产物缬氨酸。这样可以促进对碳源等营养物质的吸收相当于五字策略中的节。3通过筛选丙酮酸脱氢酶（PDHC）缺陷菌株来增加缬氨酸前提物质丙酮酸的积累。通过敲出编码苏氨酸脱氢酶的ilvA基因，可以阻断亮氨酸和泛酸的合成，他们与缬氨酸竞争前体物质酮异戊酸。通过抑制醌氧化还原酶（PQO）和丙酮酸羧化酶（PCx）的活性来阻断与缬氨酸合成无关的碳硫分支对碳源的消耗。阻塞与缬氨酸形成无关或关系不大的代谢支流，使碳架物质相对集中地流向缬氨酸，这些相当于五字策略中的节。4通过抑制livJ基因的表达，从而抑制缬氨酸向胞内运输载体蛋白的表达，促进目的产物向胞外空间分泌。这相当于五字策略中的出。