基因工程和基因组学.ppt

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1、第九章 基因工程和基因组学第一节第一节 基因工程基因工程一、基因工程概述一、基因工程概述基因工程的概念：基因工程的概念：按照既定的目的和方案，把目的基因片段按照既定的目的和方案，把目的基因片段与载体与载体DNADNA连接形成重组连接形成重组DNADNA分子，然后将分子，然后将其导入宿主细胞，并对含有目的基因的细其导入宿主细胞，并对含有目的基因的细胞进行克隆，最后利用克隆的基因表达、胞进行克隆，最后利用克隆的基因表达、制备蛋白质或多肽，或定向改造细胞乃至制备蛋白质或多肽，或定向改造细胞乃至生物个体。这种技术方法称为基因工程。生物个体。这种技术方法称为基因工程。基因工程的基本过程：基因工程的基本过

2、程：目的基因的制备目的基因的制备载体的制备载体的制备目的基因与载体的连接目的基因与载体的连接重组重组DNADNA分子导入宿主细胞分子导入宿主细胞含目的基因细胞的筛选和鉴定含目的基因细胞的筛选和鉴定基因工程基因工程（gene engineeringgene engineering）也称为遗传工程也称为遗传工程（genetic engineeringgenetic engineering）、）、基因操作（基因操作（gene gene manipulationmanipulation）、）、重组技术重组技术（recombination DNA techniquesrecombination DNA

3、techniques）。）。有时人们有时人们还称它为基因克隆（还称它为基因克隆（gene cloninggene cloning）或分子克隆或分子克隆（molecular cloningmolecular cloning）。）。DNADNA重组：重组：不同来源的不同来源的DNADNA分子通过磷酸二酯键连接而形成分子通过磷酸二酯键连接而形成重新组合的重新组合的DNADNA分子的过程，称为分子的过程，称为DNADNA重组（重组（DNA DNA recombinationrecombination）。）。基因工程概述基因工程概述基因工程概述基因工程概述 工工 具具 酶酶限制性内切核酸酶限制性内切核酸

4、酶DNADNA聚合酶聚合酶（KlenowKlenow片段）片段）逆转录酶逆转录酶T4DNAT4DNA连接酶连接酶碱性磷酸酶碱性磷酸酶末端脱氧核苷酰转移酶末端脱氧核苷酰转移酶TaqTaq DNA DNA聚合酶和其它聚合酶和其它耐热耐热DNADNA聚合酶聚合酶修饰酶修饰酶二二 限制性内切核酸酶限制性内切核酸酶1 1、限制性内切核酸酶的命名：、限制性内切核酸酶的命名：命名规则：命名规则：用来源细菌的英文缩写斜体符号命名。它的第一用来源细菌的英文缩写斜体符号命名。它的第一个字母大写，代表细菌的属名；第二、三字母小个字母大写，代表细菌的属名；第二、三字母小写，代表细菌的种名；第四个字母代表菌株；最写，代

5、表细菌的种名；第四个字母代表菌株；最后用罗马字母表示同一菌株中不同限制酶的编号。后用罗马字母表示同一菌株中不同限制酶的编号。名称名称属名属名种名种名株名株名序号序号菌株来源菌株来源EcoR E coREscherichia coli R Hind HindHaemophilus influenzae dHindHindHaemophilus influenzae dHpaHpa/Haemophilusparainfluenzae 2 2、限制性酶分类、限制性酶分类.限制酶：通常在识别位点下游限制酶：通常在识别位点下游10010001001000bpbp处切处切割割DNADNA，切割位点难以预测

6、。切割位点难以预测。每隔一段每隔一段DNADNA序列随序列随机切断双连机切断双连DNADNA分子分子,没有序列特异性没有序列特异性.限制酶：限制酶：在识别位点切割在识别位点切割DNADNA，切割位点固定，切割位点固定，序列可知。序列可知。限制酶：在识别位点附近切割限制酶：在识别位点附近切割DNADNA，切割位点切割位点难以预测。难以预测。第第类限制性酶类限制性酶能识别一段特异的能识别一段特异的DNADNA序列序列,准确准确地酶切双链地酶切双链DNADNA的特异序列（的特异序列（回纹对称序列）回纹对称序列）.从两个方向阅读序列相同的序列称为从两个方向阅读序列相同的序列称为回纹对称序列回纹对称序列

7、5GAATTC3 5GAATTC3 5GAATTC3 5GAATTC3 3CTTAAG5 3CTTAAG53CTTAAG5 3CTTAAG5v3 3、切割方式：、切割方式：v交错切割交错切割DNA DNA 双链双链,产生两个相同的单链产生两个相同的单链黏性末端黏性末端(sticky end)(sticky end)；平齐切割；平齐切割DNA DNA 双链双链,产生两个相同产生两个相同的单链的单链平齐末端平齐末端。v例如：例如：5GAATTC3 5GAATTC3 5GAATTC3 5GAATTC3 3CTTAAG5 3CTTAAG53CTTAAG5 3CTTAAG55G 5-AATTC35G 5

8、-AATTC33CTTAA G53CTTAA G5v 5-CCCGGG3 5-CCCGGG3v 3GGGCCC5 3GGGCCC5 v 5-CCC GGG3 5-CCC GGG3v 3GGG CCC5 3GGG CCC5v末端转移酶末端转移酶（terminal transferaseterminal transferase）该酶全该酶全称为末端脱氧核苷酸转移酶（称为末端脱氧核苷酸转移酶（terminal terminal deoxynucleotidyl transferasedeoxynucleotidyl transferase），它所催化的），它所催化的反应与反应与DNA pol I D

9、NA pol I 相似，所不同的是它不需要模相似，所不同的是它不需要模板，它可以含有板，它可以含有的片段为引物，的片段为引物，在在端加入核苷酸达几百个。端加入核苷酸达几百个。末端转移末端转移酶常用于在平头上合成一段寡聚核苷酸，酶常用于在平头上合成一段寡聚核苷酸，从而形成粘性末端。从而形成粘性末端。v连接酶连接酶（DNA ligaseDNA ligase）该酶常从噬菌）该酶常从噬菌体的受感细胞中提取，是由噬菌体基因组所体的受感细胞中提取，是由噬菌体基因组所编码的，所以基因工程中常用的连接酶是连编码的，所以基因工程中常用的连接酶是连接酶。它可接酶。它可催化中磷酸二脂键催化中磷酸二脂键的形成，从的形

10、成，从而使两个片段以共价键的形式结合起来。而使两个片段以共价键的形式结合起来。v DNADNA连接酶对具有粘性末端的连接酶对具有粘性末端的DNADNA分子能很好地分子能很好地连接，连接，对平末端的对平末端的DNADNA分子也可以进行连接，但分子也可以进行连接，但连接效率较低，必须加大酶的用量。连接效率较低，必须加大酶的用量。连接酶连接酶限制酶限制酶v反转录酶反转录酶（reverse transcriptasereverse transcriptase）这类酶来自于反转录病毒，它这类酶来自于反转录病毒，它可以可以为模板，催化合成。为模板，催化合成。目前常用的有目前常用的有禽源（禽源（AMVAMV

11、）及鼠源（）及鼠源（M-MLVM-MLV）反转录酶两）反转录酶两种。种。三、载三、载体（体（vector）载载体体克隆载体克隆载体表达载体表达载体质粒质粒 噬菌体噬菌体粘性质粒粘性质粒M13噬菌体噬菌体大肠杆菌表载体大肠杆菌表载体酵母菌表达载体酵母菌表达载体哺乳动物表达载体哺乳动物表达载体具具复制原点复制原点(ori),(ori),在宿主细胞中不仅能独立地自我在宿主细胞中不仅能独立地自我复制复制,而且能带动携带的外源而且能带动携带的外源DNADNA片段一起复制片段一起复制.具有具有多个克隆位点多个克隆位点(multiple cloning site,MCS,(multiple cloning

12、site,MCS,或称或称polylinker region),polylinker region),即具有多种限制性酶的切即具有多种限制性酶的切点点,而每一种酶的切点只有一个而每一种酶的切点只有一个,用于克隆外源用于克隆外源DNA DNA 片片段段.这些酶切位点不存在于复制原点或抗性选择标记这些酶切位点不存在于复制原点或抗性选择标记基因内基因内,以保持载体的自主复制特性及表型标记性状以保持载体的自主复制特性及表型标记性状.至少具有一个至少具有一个选择标记基因选择标记基因,这个基因通常是抗菌这个基因通常是抗菌素的抗性基因或某种酶的基因素的抗性基因或某种酶的基因,而宿主细胞则没有这而宿主细胞则没

13、有这种基因种基因,使有或无载体的宿主细胞具有易鉴别的表型使有或无载体的宿主细胞具有易鉴别的表型.易从宿主细胞中易从宿主细胞中回收回收.载体需要具备以下载体需要具备以下4 4个条件个条件:（一）质粒（一）质粒（plasmidplasmid）概念：质粒是细菌细胞内携带的染色体外的能独概念：质粒是细菌细胞内携带的染色体外的能独立进行复制的环状立进行复制的环状DNADNA分子。分子。具有以下特点具有以下特点（例如例如pUCpUC1818质粒）质粒）分子量小分子量小(2.69kb),(2.69kb),也可以接受较大的外源片段也可以接受较大的外源片段.拷贝数多拷贝数多,在每个宿主细胞的拷贝数可达在每个宿主

14、细胞的拷贝数可达500500个个;多克隆位点多多克隆位点多,克隆方便克隆方便;具有具有-互补显色表型互补显色表型,可作为检测重组质粒存在与否的可作为检测重组质粒存在与否的选择标记选择标记.-互补互补：是指来自细菌是指来自细菌DNADNA的的lacZlacZ酶酶(-(-半乳糖苷酶半乳糖苷酶)N)N端端的一段氨基酸残基的一段氨基酸残基(-(-肽肽),),在与在与-肽缺失的酶混合后肽缺失的酶混合后(体体外或体内外或体内),),能恢复能恢复lacZlacZ酶的活性的一种基因内互补现象酶的活性的一种基因内互补现象.HindEcoRBamHindMst多克隆位点多克隆位点Multiple cloning

15、sites-互补原理互补原理 Lac Z Lac Z是是lac Zlac Z基因的突变型，编码半乳糖苷酶基因的突变型，编码半乳糖苷酶N N端的端的146146个氨基酸（全长个氨基酸（全长12011201氨基酸）。氨基酸）。MCSMCS也在这个区域内。这类载也在这个区域内。这类载体的适合宿主细胞必须是体的适合宿主细胞必须是Z Z基因突变型，只具有基因突变型，只具有Z Z基因基因C C端的序端的序列。当两个列。当两个Z Z基因的突变产物在一起时可产生基因的突变产物在一起时可产生蛋白质间的互补，蛋白质间的互补，称称互补互补。具有具有互补的细菌培养在含互补的细菌培养在含IPTGIPTG（异丙基硫代（异

16、丙基硫代-D-D-半乳半乳糖苷）及糖苷）及X-galX-gal（5-5-溴溴-4-4-氯氯-3-3-吲哚吲哚-D-D-半乳糖苷）的培养半乳糖苷）的培养基上会形成兰色菌落。相反，不互补则产生白色的菌落。基上会形成兰色菌落。相反，不互补则产生白色的菌落。X-X-galgal本身是无色的，在半乳糖苷酶的水解下产生兰色的物质本身是无色的，在半乳糖苷酶的水解下产生兰色的物质（被水解为无色的半乳糖及深兰色的（被水解为无色的半乳糖及深兰色的5-5-溴溴-4-4-氯靛兰），因此氯靛兰），因此菌落为兰色。当在多克隆位点插入一个外源菌落为兰色。当在多克隆位点插入一个外源DNADNA片段时片段时,破坏了破坏了-肽的

17、阅读框架肽的阅读框架,使使-肽不能正确表达肽不能正确表达,，则不能产生，则不能产生互互补，因此菌落是白色的。补，因此菌落是白色的。所以白色为阳性克隆所以白色为阳性克隆。IPTGIPTG起诱导表达的作用，相当于乳糖，但它的诱导效率起诱导表达的作用，相当于乳糖，但它的诱导效率远高于乳糖。远高于乳糖。-半乳糖苷酶半乳糖苷酶5-溴溴-4氯氯-3-吲哚吲哚-D-半乳糖苷半乳糖苷（X-gal）蓝色物质蓝色物质蓝白斑筛选重组质粒蓝白斑筛选重组质粒噬菌体的噬菌体的DNADNA中间约中间约2/32/3的序列为中间基因簇的序列为中间基因簇,位于两端位于两端的为的为DNA DNA 左臂和右臂左臂和右臂.中间基因簇序

18、列可被外源中间基因簇序列可被外源DNADNA片段取片段取代代,而不影响噬菌体感染细菌及形成噬菌斑的能力而不影响噬菌体感染细菌及形成噬菌斑的能力.因此因此,在在改造利用改造利用噬菌体做载体时噬菌体做载体时,在两个臂与中间基因簇处导入在两个臂与中间基因簇处导入限制性酶切点限制性酶切点,酶切酶切DNADNA后分别得到两个臂后分别得到两个臂,再将经同一种再将经同一种酶酶切的外源酶酶切的外源DNADNA片段与两个臂连接构成重组片段与两个臂连接构成重组DNADNA分子分子.形成形成的重组的重组DNADNA分子用噬菌体蛋白包装提取物体外包装后分子用噬菌体蛋白包装提取物体外包装后,经感染经感染具有适宜基因型的

19、宿主细菌菌株具有适宜基因型的宿主细菌菌株,形成噬菌斑形成噬菌斑.然后据噬菌斑然后据噬菌斑的形态即可鉴定出阳性克隆的形态即可鉴定出阳性克隆.噬菌体作载体与细菌质粒相比噬菌体作载体与细菌质粒相比,具有易操作具有易操作,阳性克隆阳性克隆数多等特点数多等特点,现广泛用于各类基因库的构建现广泛用于各类基因库的构建.噬菌体噬菌体柯斯质粒柯斯质粒(cosmid)(cosmid)是利用部分是利用部分噬菌体噬菌体DNADNA与部分细菌与部分细菌质粒质粒DNADNA序列组建而成的序列组建而成的.柯斯质粒具有柯斯质粒具有噬菌体的噬菌体的coscos序列序列(12bp)(12bp)和细菌质粒的和细菌质粒的复制原点复制

20、原点.coscos序列是噬菌体序列是噬菌体DNADNA包装成噬菌体时所必需的包装成噬菌体时所必需的,而质粒的复制原点可使柯斯质粒在细菌细胞中同普通细而质粒的复制原点可使柯斯质粒在细菌细胞中同普通细菌质粒一样自主复制菌质粒一样自主复制.柯斯质粒也具有抗生素抗性基因柯斯质粒也具有抗生素抗性基因.尽管这种质粒的分子量较小尽管这种质粒的分子量较小,但他可接受长达但他可接受长达50kb50kb的外的外源源DNADNA片段片段,这在克隆真核生物基因中十分有用这在克隆真核生物基因中十分有用,因为一个因为一个DNA DNA 片段就可能具有真核生物基因的编码序列及其他调片段就可能具有真核生物基因的编码序列及其他

21、调控序列控序列.柯斯质粒不仅直接用于真核生物基因的分离与克柯斯质粒不仅直接用于真核生物基因的分离与克隆，还与隆，还与YACYAC克隆系统结合克隆系统结合,用于基因作图分析用于基因作图分析.柯斯质粒柯斯质粒是指能在两种不同的生物中复制的载体是指能在两种不同的生物中复制的载体.例如既能在例如既能在原核生物中复制原核生物中复制,又能在真核生物中复制的载体又能在真核生物中复制的载体.因此因此,这类载体既具有细菌质粒的复制原点及选择标记基因这类载体既具有细菌质粒的复制原点及选择标记基因,又有真核生物的自主复制序列又有真核生物的自主复制序列(ARS)(ARS)以及选择标记性状以及选择标记性状,具有多克隆位

22、点具有多克隆位点.通常穿梭载体在细菌中用于扩增克隆通常穿梭载体在细菌中用于扩增克隆的基因的基因,在酵母菌中用于基因表达分析在酵母菌中用于基因表达分析.YepYep为酵母菌附加体质粒为酵母菌附加体质粒.Yep.Yep的的AmpAmp和四环素和四环素(Tc)(Tc)抗性抗性用于细菌中选择用于细菌中选择,而而URAURA3 3(尿嘧啶尿嘧啶)基因用于在酵母菌中基因用于在酵母菌中选择。可将外源选择。可将外源DNADNA片段插在抗生素基因中片段插在抗生素基因中,通过插入失通过插入失活活,选择阳性克隆选择阳性克隆.将带有将带有URAURA3 3基因的基因的YepYep转化为转化为URAURA3 3-酵酵母

23、菌菌株后母菌菌株后,阳性克隆可在不含附加尿嘧啶的培养基上阳性克隆可在不含附加尿嘧啶的培养基上生长生长,而非阳性克隆则不能生长而非阳性克隆则不能生长.穿梭载体穿梭载体细菌人工染色体细菌人工染色体(BAC)(BAC)为了克隆较大的外源为了克隆较大的外源DNADNA片段而设片段而设计构建的计构建的.BACBAC载体是基于细菌的性因子载体是基于细菌的性因子(F(F因子因子)质粒的一些特点构建质粒的一些特点构建的的.F.F因子是细菌细胞内能自我复制的质粒因子是细菌细胞内能自我复制的质粒,约约100kb,100kb,同时能同时能在细菌接合时转移在细菌接合时转移1000kb 1000kb 的细菌染色体片段的

24、细菌染色体片段.将将F F因子经基因子经基因工程改良构成的因工程改良构成的BACBAC载体载体,可用于克隆可用于克隆100kb100kb以上的以上的DNADNA片段片段.BAC.BAC载体本身分子量小载体本身分子量小,如由小如由小F F质粒构建的载体质粒构建的载体pBeloBACpBeloBAC1111全长全长7.4kb,7.4kb,仅带有自我复制，控制拷贝数仅带有自我复制，控制拷贝数(repE)(repE)及质粒分配及质粒分配(parE,parA,parB)(parE,parA,parB)所必须的最少序列所必须的最少序列.这些基因均来自这些基因均来自F F因子因子.BAC.BAC载体还具有氯

25、霉素抗性选择基因以及多克隆位点载体还具有氯霉素抗性选择基因以及多克隆位点.在在pBeloBACpBeloBAC1111中中,多克隆位点多克隆位点lacZlacZ基因内基因内,因此可采用选择因此可采用选择pUCpUC1818阳性重组子的方法阳性重组子的方法,即即-互补显色法选择阳性互补显色法选择阳性BACBAC重组子重组子.细菌人工染色体细菌人工染色体(BAC)(BAC)根据穿梭质粒根据穿梭质粒YepYep的一些特点构建而成的一些特点构建而成.1996.1996年酵母菌基年酵母菌基因组全部序列已经测定因组全部序列已经测定,为分析为分析YACYAC克隆提供了直接依据克隆提供了直接依据.将来自将来自

26、YACYAC克隆的序列与酵母菌基因组序列比较克隆的序列与酵母菌基因组序列比较,即可以即可以完全排除重组完全排除重组YACYAC载体来自酵母菌载体来自酵母菌DNADNA的可能性的可能性.同同YepYep载体一样，载体一样，YACYAC也具有自主复制序列、克隆位点以也具有自主复制序列、克隆位点以及可在细菌和酵母菌中选择的标记基因。此外，及可在细菌和酵母菌中选择的标记基因。此外，YACYAC还具还具有酵母菌染色体的一些特点。有酵母菌染色体的一些特点。YACYAC可以接受可以接受1001000kb 1001000kb 的外源的外源DNADNA片段片段，这一特点使，这一特点使YACYAC成为人类基因组计

27、划及成为人类基因组计划及图位克隆分离基因的重要工具，并促进了发展人类人工图位克隆分离基因的重要工具，并促进了发展人类人工染色体（染色体（human artificial chromosomehuman artificial chromosome，HACHAC）的研究。的研究。酵母人工染色体酵母人工染色体(YAC)(YAC)TiTi质粒是一种细菌质粒质粒是一种细菌质粒 ，它自然存在于根瘤土壤杆菌，它自然存在于根瘤土壤杆菌细胞中。根瘤土壤杆菌可感染大多数双子叶植物的受伤部细胞中。根瘤土壤杆菌可感染大多数双子叶植物的受伤部位，使之产生冠瘿瘤。植物产生的这种根瘤细胞与动物的位，使之产生冠瘿瘤。植物产生

28、的这种根瘤细胞与动物的癌细胞癌细胞(tumor)(tumor)相似，它们能独立地、不受控制地生长。相似，它们能独立地、不受控制地生长。根瘤细胞的形成是因为根瘤细胞的形成是因为根瘤土壤杆菌中存在着一种诱导瘤根瘤土壤杆菌中存在着一种诱导瘤细胞细胞(tumor-inducing(tumor-inducing，Ti)Ti)的质粒，这种质粒被称为的质粒，这种质粒被称为TiTi质质粒。粒。TiTi质粒的一部分质粒的一部分DNADNA叫做转移叫做转移DNADNA（transferDNAtransferDNA，T-T-DNADNA），），DNA DNA整合到宿主植物细胞的染色体后，就诱导出根整合到宿主植物细胞

29、的染色体后，就诱导出根瘤，并使根瘤细胞合成冠瘿碱瘤，并使根瘤细胞合成冠瘿碱 ，作为根瘤土壤杆菌的碳源，作为根瘤土壤杆菌的碳源和氮源。和氮源。七七TiTi质粒质粒及其衍生载体及其衍生载体(1)Ti(1)Ti质粒具有质粒具有5 5个主要功能区域个主要功能区域 。它们分别是。它们分别是T-DNAT-DNA、质、质粒转移粒转移(plasmid transfer)(plasmid transfer)、冠瘿碱代谢、冠瘿碱代谢 、复制原点、复制原点 和和毒性区域毒性区域 。(2)T-DNA(2)T-DNA内的致瘤细胞诱导根瘤细胞，由这类细胞不能再内的致瘤细胞诱导根瘤细胞，由这类细胞不能再生成植株。生成植株。

30、T-DNAT-DNA区域内的所有基因与转移无关，所以将致区域内的所有基因与转移无关，所以将致瘤基因全部缺失即卸甲（瘤基因全部缺失即卸甲（disamdisam）后，将细菌抗生素的抗性）后，将细菌抗生素的抗性基因或其他序列插入到这个区域，形成的基因或其他序列插入到这个区域，形成的T-DNAT-DNA仍可将仍可将RBRB至至LBLB内的序列内的序列 转移并整合到植物基因组。转移并整合到植物基因组。(3)vir(3)vir的毒性基因是的毒性基因是T-DNAT-DNA转移所必需的，毒性基因可以顺转移所必需的，毒性基因可以顺式及反式两种方式控制式及反式两种方式控制T-DNAT-DNA转移。转移。TiTi质

31、粒的特点质粒的特点原核生物主要载体用途小结原核生物主要载体用途小结：载体体 用途用途质粒粒 cosmidM13YAC大片段大片段DNA克隆克隆+基因文基因文库构建构建+cDNA文文库构建构建+序列分析序列分析+单链探探针+工程菌工程菌+(一一)从基因库中分离基因从基因库中分离基因 11构建基因库构建基因库(1)(1)核基因库。核基因库。核基因库核基因库(GENOMIC library (GENOMIC library 或或 genomic genomic bank)bank)是将某一生物的全部基因组是将某一生物的全部基因组DNADNA酶切后与载体连接构酶切后与载体连接构建而成的。建而成的。通常

32、的通常的方法方法是，尽量提取大分子量的核是，尽量提取大分子量的核DNADNA，用限制性酶，用限制性酶酶切后，分离选择具有一定长度酶切后，分离选择具有一定长度(大于大于15kb)15kb)的的DNADNA片段，片段，与适宜的载体与适宜的载体(如如EMBL)EMBL)连接构成重组连接构成重组DNADNA分子，根据所分子，根据所用的载体，选择相应的宿主细胞用于克隆。用的载体，选择相应的宿主细胞用于克隆。四、基因的分离与鉴定四、基因的分离与鉴定-获取目的基因及鉴定基因产物获取目的基因及鉴定基因产物提取基因组提取基因组DNADNA限制酶酶切基因组限制酶酶切基因组DNADNA转移入大肠杆菌进行克隆转移入大

33、肠杆菌进行克隆酶切酶切DNADNA片段与质粒载体连接片段与质粒载体连接(2)(2)染色体基因库。将基因组的一部分染色体基因库。将基因组的一部分(如一根染色体如一根染色体)用来构建基因库，用来构建基因库，（3)cDNA3)cDNA库：库：cDNAcDNA库是以库是以mRNAmRNA为模板为模板,经反转录酶合成经反转录酶合成互补互补DNA(complementary DNA,cDNA)DNA(complementary DNA,cDNA)构建的基因库构建的基因库。合成合成方法方法：利用一段：利用一段poly-Tpoly-T为引物为引物 ，与，与poly-Apoly-A互补配互补配对，在反转录酶作用

34、下，用对，在反转录酶作用下，用poly-Tpoly-T引物引导合成一条互引物引导合成一条互补补DNADNA，形成，形成RNA-DNARNA-DNA杂合双链杂合双链 。第一条互补。第一条互补DNADNA链形成链形成时，通常在其时，通常在其33末端回转形成发夹结构，作为引物引导末端回转形成发夹结构，作为引物引导合成第二条链合成第二条链DNADNA，再用，再用S Sl l核酸酶将发夹结构的单链部核酸酶将发夹结构的单链部分降解，就得到了双链分降解，就得到了双链DNADNA。也可在形成。也可在形成RNA-DNARNA-DNA杂合链杂合链后，用后，用RNA HRNA H酶酶(Rnase H)(Rnase

35、H)在在mRNAmRNA链上产生一些缺刻链上产生一些缺刻 (nick)(nick)，形成很多，形成很多RNARNA分子小片段，在分子小片段，在DNADNA聚合酶的作用聚合酶的作用下，以这些下，以这些RNARNA小片段为引物引导合成第二条小片段为引物引导合成第二条DNADNA链。链。从细胞中分离出从细胞中分离出mRNAmRNA逆转录生成逆转录生成cDNAcDNA与载体连接成重组与载体连接成重组DNADNA转移入大肠杆菌进行克隆转移入大肠杆菌进行克隆合成双链合成双链DNADNA逆转录酶逆转录酶T4DNAT4DNA聚合酶聚合酶 利用一段核苷酸序列利用一段核苷酸序列(DNA(DNA，cDNAcDNA或

36、寡聚核苷酸或寡聚核苷酸)作作探针探针(probe)(probe)，用放射性同位素或非放射性同位素标记，用放射性同位素或非放射性同位素标记探针，筛选基因库。探针，筛选基因库。若筛选入噬菌体构建的库，可利用若筛选入噬菌体构建的库，可利用菌斑杂交法菌斑杂交法：将经：将经重组噬菌体重组噬菌体(来自构建的基因库来自构建的基因库)感染宿主细菌细胞，噬感染宿主细菌细胞，噬菌体在宿主细胞内复制扩增后形成噬菌斑。一个噬菌斑菌体在宿主细胞内复制扩增后形成噬菌斑。一个噬菌斑就是一个克隆。再将培养皿中的噬菌斑转到硝酸纤维膜就是一个克隆。再将培养皿中的噬菌斑转到硝酸纤维膜或尼龙膜上变性，然后用标记的探针或尼龙膜上变性，

37、然后用标记的探针(也变性成单链也变性成单链)与与膜上的噬菌体膜上的噬菌体DNADNA杂交，将杂交膜用杂交，将杂交膜用X X光片放射自显影，光片放射自显影，检测杂交信号。检测杂交信号。凡是与探针杂交的噬菌斑即为阳性克隆，凡是与探针杂交的噬菌斑即为阳性克隆，在在X X光片上有杂交信号光片上有杂交信号(黑点黑点)。根据杂交信号在膜上的。根据杂交信号在膜上的相对位置，定位找出培养皿中所对应的噬菌斑，挑出并相对位置，定位找出培养皿中所对应的噬菌斑，挑出并培养阳性噬菌斑，培养阳性噬菌斑，22筛选基因库筛选基因库首先将阳性克隆首先将阳性克隆DNADNA酶切；然后将酶切的产物用琼酶切；然后将酶切的产物用琼脂糖

38、凝胶电泳，最后做出图谱。脂糖凝胶电泳，最后做出图谱。Page227Page227图图3 3、阳性克隆的分析与鉴定、阳性克隆的分析与鉴定 ：(1)(1)限制性酶图谱。限制性酶图谱。泳泳Southern Southern 杂交分析杂交分析(Southern blotting)(Southern blotting)是基因工是基因工程中常用的方法，程中常用的方法，1975 1975年由英国的年由英国的SouthernSouthern发明。先发明。先是将是将DNADNA用限制性酶酶切，然后将酶切的用限制性酶酶切，然后将酶切的DNADNA进行琼脂进行琼脂糖凝胶电泳，经过变性处理后，将凝胶上的糖凝胶电泳，经

39、过变性处理后，将凝胶上的DNADNA转移到转移到膜上，再用经过放射性同位素或非放射性同位素标记膜上，再用经过放射性同位素或非放射性同位素标记的的DNADNA探针与膜上的探针与膜上的DNADNA片段杂交，洗去膜上非特异性片段杂交，洗去膜上非特异性结合的探针后，用结合的探针后，用X X光片放射自显影检测杂交信号。如光片放射自显影检测杂交信号。如果转移的膜上具有与杂交探针相同或部分同源的序列，果转移的膜上具有与杂交探针相同或部分同源的序列，放射自显影后就会检测到杂交带信号。放射自显影后就会检测到杂交带信号。(2)(2)核酸分子杂交。核酸分子杂交。SangerSanger于于19771977年发明的年

40、发明的双脱氧核苷酸链终止法双脱氧核苷酸链终止法 ：将序列：将序列反应分为反应分为A A、C C、G G和和T4T4管，每管中含有变性的管，每管中含有变性的DNADNA模板、模板、DNADNA聚合酶、标记的引物、聚合酶、标记的引物、4 4种脱氧核苷酸，再掺入一种一种脱氧核苷酸，再掺入一种一定比例的双脱氧核苷酸定比例的双脱氧核苷酸 。在。在DNADNA合成过程中，双脱氧核苷合成过程中，双脱氧核苷酸与互补序列配对被整合到正在延长的酸与互补序列配对被整合到正在延长的DNADNA链中，在不同链中，在不同DNADNA链上随机地整合在不同位置。由于双脱氧核苷酸在第链上随机地整合在不同位置。由于双脱氧核苷酸在

41、第三位没有游离的羟基三位没有游离的羟基(-0H)(-0H)，无法再连接另一个核苷酸，无法再连接另一个核苷酸，导致导致DNADNA链合成在这里终止。结果每一个反应管中都合成链合成在这里终止。结果每一个反应管中都合成一系列不同大小的一系列不同大小的DNADNA分子。将分子。将4 4个反应产物并排点在聚丙个反应产物并排点在聚丙烯酰胺凝胶上的烯酰胺凝胶上的4 4个孔中，电泳后每个孔中形成一条梯状个孔中，电泳后每个孔中形成一条梯状DNADNA带，带，从底部往上阅读，即是从底部往上阅读，即是55到到33端的序列端的序列 。(3)(3)核酸序列测定。核酸序列测定。O碱基碱基CPOHH12345O碱基碱基CP

42、OHH12345OH脱脱氧氧核核苷苷酸酸的的连连接接DNA测序测序O碱基碱基CPOH12345O碱基碱基CPOHH12345H2O脱脱氧氧核核苷苷酸酸的的连连接接O碱基碱基CPHH12345O碱基碱基CPOHH12345OHX双双脱脱氧氧核核苷苷酸酸?四四套套反反应应体体系系1-dATP,dCTP,dGTP,dTTP.+ddATP2-dATP,dCTP,dGTP,dTTP.+ddCTP3-dATP,dCTP,dGTP,dTTP.+ddGTP4-dATP,dCTP,dGTP,dTTP.+ddTTPATGCGGTACCAT53测序模板5 TA5TACGCCA5TACGCCATGGTACCC第一套反

43、应第二套反应555ACGTATGGTACCGCATDNA自动测序 分析核酸序列是不是所需要的基因，或具有什么功能，分析核酸序列是不是所需要的基因，或具有什么功能，同源性比较是常用的方法之一。同源性比较是常用的方法之一。另一种方法是分析核酸序列的阅读框架。另一种方法是分析核酸序列的阅读框架。(4)(4)核酸序列分析。核酸序列分析。(二二)聚合酶链式反应聚合酶链式反应(PCR)(PCR)扩增基因扩增基因聚合酶链式反应聚合酶链式反应(poly-merase chain reaction (poly-merase chain reaction,PCR),PCR)是体外快速扩增是体外快速扩增DNADNA

44、的方法。由美国的的方法。由美国的MullisMullis于于19861986年发明的方法，可在数年发明的方法，可在数h h内使目的基因片段扩内使目的基因片段扩增到数百万个拷贝增到数百万个拷贝.PCR.PCR反应包括下述反应包括下述3 3个步骤。个步骤。11变性变性 在在94-9594-95o oc c使模板使模板DNADNA的双链变性成单链。的双链变性成单链。2 2复性复性 两个引物分别与单链两个引物分别与单链DNADNA互补复性，复性互补复性，复性的的 温度为温度为50-7050-70o oC C 3 3延伸延伸 在引物的引导及在引物的引导及TapTap酶的作用下，于酶的作用下，于7272o

45、 oC C记记 下合成模板下合成模板DNADNA的互补链。的互补链。PCR技术技术原理示意图原理示意图靶序列靶序列变性和引变性和引物复性物复性循环循环1循环循环2循环循环3变性和引变性和引物复性物复性链延伸链延伸链延伸链延伸 DNA DNA以指数形式扩增以指数形式扩增(2(2n n)，其中长片段以线性形式扩增其中长片段以线性形式扩增 (2n+2)(2n+2)，最终主产物片段长度在两个引物之间。，最终主产物片段长度在两个引物之间。预变性预变性(92-95(92-95 C,2-5m)C,2-5m)变性变性(92-95(92-95 C,30s)C,30s)复性复性(40-60(40-60 C,30s

46、)C,30s)延伸延伸(72(72 C,30-60s)C,30-60s)总延伸总延伸(72(72 C,7m)C,7m)(25-35)(25-35)PCRPCR的一般过程：的一般过程：经过经过3030次的循环次的循环,扩增的扩增的DNADNA片段可达片段可达100100万倍以上。万倍以上。2402401616256256114114525222228 82 20 00 0短片段（单链）短片段（单链）1414121210108 86 64 42 2长片段（单链）长片段（单链）128128646432321616总片段（单链）总片段（单链）循环数循环数先化学合成多个含有先化学合成多个含有8-1008

47、-100个核苷酸的寡聚核苷酸，个核苷酸的寡聚核苷酸，每个寡聚核苷酸之间具有每个寡聚核苷酸之间具有19-2419-24个核苷酸的重叠序列个核苷酸的重叠序列,再将各个寡聚核苷酸等量再将各个寡聚核苷酸等量(摩尔浓度摩尔浓度)混合，在混合，在DNADNA聚聚合酶合酶(或或TapTap酶酶)作用下，各寡聚核苷酸又作为引物合作用下，各寡聚核苷酸又作为引物合成新链，使单链部分补齐成为双链。再用两个成新链，使单链部分补齐成为双链。再用两个PCRPCR引物，引物，经经PCRPCR扩增出扩增出DNADNA片段。若将两个片段。若将两个DNADNA片段放在一起，经片段放在一起，经多级多级SOE-PCRSOE-PCR扩

48、增出完整的基因片段扩增出完整的基因片段.(三三)人工合成基因人工合成基因:(一一)基因工程工业：基因工程工业：如细菌中表达人的胰岛素，先人工合成成熟胰岛素原如细菌中表达人的胰岛素，先人工合成成熟胰岛素原的的A A链和链和B B链核苷酸链核苷酸(A(A链链63bp63bp，B B链链90bp),90bp),再分别与载体再分别与载体中的中的-半乳糖苷酶序列连接，构成半乳糖苷酶序列连接，构成-半乳糖苷酶半乳糖苷酶-胰岛胰岛素原融合蛋白，受素原融合蛋白，受-半乳糖苷酶启动子控制。将构建的半乳糖苷酶启动子控制。将构建的重组质粒转化大肠杆菌细胞，分别表达重组质粒转化大肠杆菌细胞，分别表达-半乳糖苷酶与半乳

49、糖苷酶与A A链或链或B B链的融合蛋白。从细菌中纯化的融合蛋白用溴化链的融合蛋白。从细菌中纯化的融合蛋白用溴化氰处理裂解，将氰处理裂解，将-半乳糖苷酶与半乳糖苷酶与A A链或链或B B链分开，得到纯链分开，得到纯胰岛素原蛋白。再将纯化的胰岛素原蛋白。再将纯化的A A链和链和B B链混合后，经二硫键链混合后，经二硫键连接成为完整的胰岛素。连接成为完整的胰岛素。五、基因工程的应用五、基因工程的应用胰岛素原的人工合成胰岛素原的人工合成胰脏胰脏(A)n胰岛素原胰岛素原mRNAcDNA重组质粒重组质粒转化细菌转化细菌mRNA反转录酶反转录酶胰岛素原基因胰岛素原基因与质粒与质粒连接连接感染感染E.col

50、i胰岛素原胰岛素原植物基因工程：植物基因转化是指将外源基因转移到植物基因工程：植物基因转化是指将外源基因转移到植物细胞内，并整合到植物基因组中稳定遗传和表达植物细胞内，并整合到植物基因组中稳定遗传和表达的过程。的过程。1 1，根瘤土壤杆菌转化技术，根瘤土壤杆菌转化技术:将目的基因与花椰菜病毒将目的基因与花椰菜病毒35S35S启动子及终止子组成嵌合启动子及终止子组成嵌合DNADNA分子，插入到分子，插入到TiTi衍生衍生质粒的质粒的RBRB与与LBLB内构成重组质粒，再转化到根瘤土壤杆内构成重组质粒，再转化到根瘤土壤杆菌细胞，将得到的重组根瘤土壤杆菌去感染植物细胞，菌细胞，将得到的重组根瘤土壤杆