实验六米氏常数.ppt

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1、实验六实验六 底物浓度对酶促反应速度的影响底物浓度对酶促反应速度的影响 米氏常数的测定米氏常数的测定 实验目的实验目的1.1.了解底物浓度对酶促反应的影响。了解底物浓度对酶促反应的影响。酶促反应动力学是研究酶促反应动力学是研究酶促反应的速度酶促反应的速度以及以及影响影响酶反应速度的各种因素酶反应速度的各种因素的科学。的科学。影响酶反应速度的因素有：影响酶反应速度的因素有：底物浓度、酶浓度、温度、底物浓度、酶浓度、温度、pH值、激活剂、抑制剂等。值、激活剂、抑制剂等。2.2.掌握测定米氏常数掌握测定米氏常数KmKm的原理和方法。的原理和方法。v在低底物浓度时在低底物浓度时,反应速反应速度与底物浓

2、度成正比，为度与底物浓度成正比，为一级反应。一级反应。v底物浓度增大与速度的增底物浓度增大与速度的增加不成正比加不成正比,为混合级反应为混合级反应.v当底物浓度达到一定值，当底物浓度达到一定值，几乎所有的酶都与底物结几乎所有的酶都与底物结合后，反应速度达到最大合后，反应速度达到最大值（值（V V maxmax），此时再增加），此时再增加底物浓度，反应速度不再底物浓度，反应速度不再增加，表现为零级反应。增加，表现为零级反应。底物浓度对酶促反应速度的影响底物浓度对酶促反应速度的影响(一一)V-S)V-S曲线曲线底物浓度对酶促反应初速度的影响V 初初V max实验原理实验原理低低实验原理实验原理酶促

3、反应速度与底物浓度的关系可用米氏方酶促反应速度与底物浓度的关系可用米氏方程来表示：程来表示：v v v v反应初速度（微摩尔浓度变化反应初速度（微摩尔浓度变化反应初速度（微摩尔浓度变化反应初速度（微摩尔浓度变化/minminminmin）；）；）；）；VmaxVmaxVmaxVmax最大反应速度（微摩尔浓度变化最大反应速度（微摩尔浓度变化最大反应速度（微摩尔浓度变化最大反应速度（微摩尔浓度变化/min/min/min/min）；）；）；）；S S S S底物浓度（底物浓度（底物浓度（底物浓度（mol/Lmol/Lmol/Lmol/L）；）；）；）；KmKmKmKm米氏常数（米氏常数（米氏常数（

4、米氏常数（mol/Lmol/Lmol/Lmol/L）。）。）。）。（二）米氏常数（二）米氏常数实验原理实验原理这个方程表明当已知这个方程表明当已知KmKm及及VmaxVmax时，酶反应速度与底时，酶反应速度与底物浓度之间的定量关系。物浓度之间的定量关系。KmKm值等于酶促反应速度达值等于酶促反应速度达到最大反应速度一半时所对应的底物浓度。不同的到最大反应速度一半时所对应的底物浓度。不同的酶酶KmKm值不同，同一种酶与不同底物反应值不同，同一种酶与不同底物反应KmKm值也不同。值也不同。KmKm值可近似的反应酶与底物的亲和力大小：值可近似的反应酶与底物的亲和力大小：KmKm值大，值大，表明亲和力

5、小；表明亲和力小；KmKm值小，表明亲合力大。测值小，表明亲合力大。测KmKm值是值是酶学研究的一个重要方法。大多数纯酶的酶学研究的一个重要方法。大多数纯酶的KmKm值在值在0.010.01100mmol/L100mmol/L。米氏常数的测定米氏常数的测定基基本本原原则则：将将米米氏氏方方程程变变化化成成相相当当于于y=ax+b的的直线方程，再用作图法求出直线方程，再用作图法求出Km。例：例：双倒数作图法双倒数作图法（Lineweaver-Burk法）法）米氏方程的双倒数形式：米氏方程的双倒数形式：1 1 K Km 1 1m 1 1 =+V V V Vmax S max S V Vmaxmax

6、取米氏方程式的倒数形式取米氏方程式的倒数形式取米氏方程式的倒数形式取米氏方程式的倒数形式：1/Vmax斜率斜率=Km/Vmax-1/Km米氏常数米氏常数KmKm的的测定：测定：本实验以胰蛋白酶消化酪蛋白本实验以胰蛋白酶消化酪蛋白本实验以胰蛋白酶消化酪蛋白本实验以胰蛋白酶消化酪蛋白为例，采用为例，采用为例，采用为例，采用LinewaeaverBurkLinewaeaverBurk双倒数作图法测定双倒数作图法测定双倒数作图法测定双倒数作图法测定KmKm值。胰蛋白值。胰蛋白值。胰蛋白值。胰蛋白酶催化蛋白质中碱性氨基酸（酶催化蛋白质中碱性氨基酸（酶催化蛋白质中碱性氨基酸（酶催化蛋白质中碱性氨基酸（L-

7、L-精精精精氨酸或者氨酸或者氨酸或者氨酸或者L-L-赖氨酸）的羧基所形成赖氨酸）的羧基所形成赖氨酸）的羧基所形成赖氨酸）的羧基所形成的肽键水解。水解时有自由氨基生的肽键水解。水解时有自由氨基生的肽键水解。水解时有自由氨基生的肽键水解。水解时有自由氨基生成，可用甲醛滴定法判断自由氨基成，可用甲醛滴定法判断自由氨基成，可用甲醛滴定法判断自由氨基成，可用甲醛滴定法判断自由氨基增加的数量而跟踪反应，求得初速增加的数量而跟踪反应，求得初速增加的数量而跟踪反应，求得初速增加的数量而跟踪反应，求得初速度。度。度。度。曼尼希反应曼尼希反应（Mannich反应）反应）vv曼尼希反应，也称作胺甲基化反应，是含有活

8、泼氢的化合物曼尼希反应，也称作胺甲基化反应，是含有活泼氢的化合物曼尼希反应，也称作胺甲基化反应，是含有活泼氢的化合物曼尼希反应，也称作胺甲基化反应，是含有活泼氢的化合物（通常为羰基化合物）与甲醛和二级胺或氨缩合，生成（通常为羰基化合物）与甲醛和二级胺或氨缩合，生成（通常为羰基化合物）与甲醛和二级胺或氨缩合，生成（通常为羰基化合物）与甲醛和二级胺或氨缩合，生成-氨基（羰基）化合物的有机化学反应。甲醛是最小的含氧有氨基（羰基）化合物的有机化学反应。甲醛是最小的含氧有氨基（羰基）化合物的有机化学反应。甲醛是最小的含氧有氨基（羰基）化合物的有机化学反应。甲醛是最小的含氧有机物，具有较高的反应活性，可以

9、和带有机物，具有较高的反应活性，可以和带有机物，具有较高的反应活性，可以和带有机物，具有较高的反应活性，可以和带有OHOHOHOH（羟基）、（羟基）、（羟基）、（羟基）、SHSHSHSH（巯基）、（巯基）、（巯基）、（巯基）、NH2NH2NH2NH2（氨基）基团的分子发生亲核加成反应，（氨基）基团的分子发生亲核加成反应，（氨基）基团的分子发生亲核加成反应，（氨基）基团的分子发生亲核加成反应，最终甲醛作为亚甲基（最终甲醛作为亚甲基（最终甲醛作为亚甲基（最终甲醛作为亚甲基（CH2CH2CH2CH2）的提供者，与上述基团中）的提供者，与上述基团中）的提供者，与上述基团中）的提供者，与上述基团中的两个

10、基团反应，使自由的分子链被甲醛交联起来的两个基团反应，使自由的分子链被甲醛交联起来的两个基团反应，使自由的分子链被甲醛交联起来的两个基团反应，使自由的分子链被甲醛交联起来 酶的酶的KmKm在实际应用中的意义在实际应用中的意义vv鉴定酶：通过测定鉴定酶：通过测定鉴定酶：通过测定鉴定酶：通过测定KmKmKmKm，可鉴别不同来源或相同来，可鉴别不同来源或相同来，可鉴别不同来源或相同来，可鉴别不同来源或相同来源但在不同发育阶段，不同生理状态下催化相同源但在不同发育阶段，不同生理状态下催化相同源但在不同发育阶段，不同生理状态下催化相同源但在不同发育阶段，不同生理状态下催化相同反应的酶是否是属于同一种酶。

11、反应的酶是否是属于同一种酶。反应的酶是否是属于同一种酶。反应的酶是否是属于同一种酶。vv判断酶的最适底物（天然底物）判断酶的最适底物（天然底物）判断酶的最适底物（天然底物）判断酶的最适底物（天然底物）。vv计算一定速度下底物浓度。计算一定速度下底物浓度。计算一定速度下底物浓度。计算一定速度下底物浓度。vv了解酶的底物在体内具有的浓度水平。了解酶的底物在体内具有的浓度水平。了解酶的底物在体内具有的浓度水平。了解酶的底物在体内具有的浓度水平。vv判断反应方向或趋势。判断反应方向或趋势。判断反应方向或趋势。判断反应方向或趋势。vv判断抑制类型。判断抑制类型。判断抑制类型。判断抑制类型。实验器材及试剂

12、器材：器材：50mL三角瓶、150mL三角瓶、吸管5mL，10mL、量筒100mL、25mL碱式滴定管及滴定台、蝴蝶夹、恒温水浴、滴管试剂：试剂：1040g/L酪蛋白溶液（pH8.5）、中性甲醛溶液、0.25%酚酞加50%乙醇溶液、标准0.1M NaOH溶液、胰蛋白酶溶液 实验步骤实验步骤1 1 1 1取取取取50mL50mL50mL50mL三角瓶三角瓶三角瓶三角瓶4 4 4 4个，加入个，加入个，加入个，加入5mL5mL5mL5mL甲醛与甲醛与甲醛与甲醛与1 1 1 1滴酚酞滴酚酞滴酚酞滴酚酞（pH8-10pH8-10pH8-10pH8-10），以），以），以），以0.1M0.1M0.1M0

13、.1M标准标准标准标准NaOHNaOHNaOHNaOH滴定至滴定至滴定至滴定至微红色微红色微红色微红色，4 4 4 4个瓶颜色应当一致，编号。个瓶颜色应当一致，编号。个瓶颜色应当一致，编号。个瓶颜色应当一致，编号。2 2 2 2量取量取量取量取40g/L40g/L40g/L40g/L酪蛋白酪蛋白酪蛋白酪蛋白50mL50mL50mL50mL，加入一，加入一，加入一，加入一150mL150mL150mL150mL三角三角三角三角瓶，瓶，瓶，瓶，37373737保温保温保温保温10101010分钟，同时胰蛋白酶液也在分钟，同时胰蛋白酶液也在分钟，同时胰蛋白酶液也在分钟，同时胰蛋白酶液也在373737

14、37保温保温保温保温10101010分钟，然后吸取分钟，然后吸取分钟，然后吸取分钟，然后吸取5mL5mL5mL5mL酶液加到酪蛋酶液加到酪蛋酶液加到酪蛋酶液加到酪蛋白液中。（同时计时！）充分混合后立即取出白液中。（同时计时！）充分混合后立即取出白液中。（同时计时！）充分混合后立即取出白液中。（同时计时！）充分混合后立即取出10mL10mL10mL10mL反应液（定为反应液（定为反应液（定为反应液（定为0 0 0 0时样品）加入一含甲醛的时样品）加入一含甲醛的时样品）加入一含甲醛的时样品）加入一含甲醛的小三角瓶中（小三角瓶中（小三角瓶中（小三角瓶中（1 1 1 1号）加号）加号）加号）加1010

15、1010滴酚酞；以滴酚酞；以滴酚酞；以滴酚酞；以0.1M NaOH0.1M NaOH0.1M NaOH0.1M NaOH滴定至微弱而持续的微红色。在接近终点时，滴定至微弱而持续的微红色。在接近终点时，滴定至微弱而持续的微红色。在接近终点时，滴定至微弱而持续的微红色。在接近终点时，按耗去的按耗去的按耗去的按耗去的NaOHmLNaOHmLNaOHmLNaOHmL数，数，数，数，每每每每mLmLmLmL加一滴酚酞加一滴酚酞加一滴酚酞加一滴酚酞，再继续，再继续，再继续，再继续滴至终点，记下耗去的滴至终点，记下耗去的滴至终点，记下耗去的滴至终点，记下耗去的0.1M0.1M0.1M0.1M标准标准标准标准

16、NaOH mLNaOH mLNaOH mLNaOH mL数。数。数。数。实验步骤实验步骤3.3.3.3.在在在在1 1 1 1分钟、分钟、分钟、分钟、2 2 2 2分钟、分钟、分钟、分钟、6 6 6 6分钟时，分别取出分钟时，分别取出分钟时，分别取出分钟时，分别取出10mL10mL10mL10mL反反反反应液，加入应液，加入应液，加入应液，加入2 2 2 2号、号、号、号、3 3 3 3号、号、号、号、4 4 4 4号小三角瓶，同上操号小三角瓶，同上操号小三角瓶，同上操号小三角瓶，同上操作，记下耗去作，记下耗去作，记下耗去作，记下耗去NaOH mLNaOH mLNaOH mLNaOH mL数。

17、数。数。数。以滴定度（即耗去的以滴定度（即耗去的以滴定度（即耗去的以滴定度（即耗去的NaOH mLNaOH mLNaOH mLNaOH mL数）对时间数）对时间数）对时间数）对时间作图作图作图作图，得一直线，其斜率即，得一直线，其斜率即，得一直线，其斜率即，得一直线，其斜率即初速度为初速度为初速度为初速度为V V V V40404040（相对（相对（相对（相对于于于于40g/L40g/L40g/L40g/L的酪蛋白浓度）。的酪蛋白浓度）。的酪蛋白浓度）。的酪蛋白浓度）。4.4.4.4.然后分别量取然后分别量取然后分别量取然后分别量取30g/L30g/L30g/L30g/L、20g/L20g/L

18、20g/L20g/L、10g/L10g/L10g/L10g/L的酪蛋白的酪蛋白的酪蛋白的酪蛋白溶液，重复上述操作，分别测出溶液，重复上述操作，分别测出溶液，重复上述操作，分别测出溶液，重复上述操作，分别测出V V V V30303030、V V V V20202020、V V V V10101010。利用上述结果，利用上述结果，利用上述结果，利用上述结果，以以以以1/v1/v1/v1/v对对对对1/s1/s1/s1/s作图作图作图作图，即求，即求，即求，即求出出出出VmaxVmaxVmaxVmax与与与与KmKmKmKm值。值。值。值。实验步骤（1 1 1 1）实验表明，反应速度只在最初一段时

19、间内）实验表明，反应速度只在最初一段时间内）实验表明，反应速度只在最初一段时间内）实验表明，反应速度只在最初一段时间内保持恒定，随着反应时间的延长，酶促反应速保持恒定，随着反应时间的延长，酶促反应速保持恒定，随着反应时间的延长，酶促反应速保持恒定，随着反应时间的延长，酶促反应速度逐渐下降。原因有多种，如底物浓度降低，度逐渐下降。原因有多种，如底物浓度降低，度逐渐下降。原因有多种，如底物浓度降低，度逐渐下降。原因有多种，如底物浓度降低，产物浓度增加而对酶产生抑制作用并加速逆反产物浓度增加而对酶产生抑制作用并加速逆反产物浓度增加而对酶产生抑制作用并加速逆反产物浓度增加而对酶产生抑制作用并加速逆反应

20、的进行，酶在一定应的进行，酶在一定应的进行，酶在一定应的进行，酶在一定pHpHpHpH及温度下部分失活等。及温度下部分失活等。及温度下部分失活等。及温度下部分失活等。因此，研究酶的活力以酶促反应的初速度为准。因此，研究酶的活力以酶促反应的初速度为准。因此，研究酶的活力以酶促反应的初速度为准。因此，研究酶的活力以酶促反应的初速度为准。（2 2 2 2）本实验是一个定量测定方法，为获得准确）本实验是一个定量测定方法，为获得准确）本实验是一个定量测定方法，为获得准确）本实验是一个定量测定方法，为获得准确的实验结果，应尽量减少实验操作中带来的误的实验结果，应尽量减少实验操作中带来的误的实验结果，应尽量

21、减少实验操作中带来的误的实验结果，应尽量减少实验操作中带来的误差。因此配制各种底物溶液时应用同一母液进差。因此配制各种底物溶液时应用同一母液进差。因此配制各种底物溶液时应用同一母液进差。因此配制各种底物溶液时应用同一母液进行稀释，保证底物浓度的准确性。各种试剂的行稀释，保证底物浓度的准确性。各种试剂的行稀释，保证底物浓度的准确性。各种试剂的行稀释，保证底物浓度的准确性。各种试剂的加量也应准确，并严格控制准确的酶促反应时加量也应准确，并严格控制准确的酶促反应时加量也应准确，并严格控制准确的酶促反应时加量也应准确，并严格控制准确的酶促反应时间。间。间。间。思考题思考题1.1.试述底物浓度对酶促反应速度的影响。试述底物浓度对酶促反应速度的影响。2.2.在什么条件下，测定酶的在什么条件下，测定酶的KmKm值可以作为值可以作为鉴定酶的一种手段，为什么？鉴定酶的一种手段，为什么？3.3.米氏方程中的米氏方程中的KmKm值有何实际应用？值有何实际应用？