齐鲁医学细胞工程主要技术.pptx

《齐鲁医学细胞工程主要技术.pptx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《齐鲁医学细胞工程主要技术.pptx（99页珍藏版）》请在淘文阁 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、细胞工程主要技术细胞工程主要技术12021/7/27 星期二2动物细胞工程主要技术动物细胞工程主要技术l第一章第一章 动物细胞转化（诱变）动物细胞转化（诱变）l第二章第二章 细胞融合技术细胞融合技术l第三章第三章 哺乳动物克隆技术哺乳动物克隆技术l第四章第四章 哺乳动物胚胎培养与移植哺乳动物胚胎培养与移植l利用杂交瘤制备单克隆抗体技术利用杂交瘤制备单克隆抗体技术l干细胞技术干细胞技术2021/7/27 星期二3第一章第一章动物物细胞的胞的转化（化（诱变）通通通通过过过过细细细细胞胞胞胞培培培培养养养养，世世世世界界界界上上上上已已已已建建建建立立立立了了了了大大大大量量量量细细细细胞胞胞胞株株

2、株株，我我我我国国国国业业业业已已已已建立了上百个细胞株，为细胞生物学和医学做出了重大贡献。建立了上百个细胞株，为细胞生物学和医学做出了重大贡献。建立了上百个细胞株，为细胞生物学和医学做出了重大贡献。建立了上百个细胞株，为细胞生物学和医学做出了重大贡献。正正正正常常常常组组组组织织织织的的的的初初初初级级级级培培培培养养养养物物物物，在在在在传传传传代代代代培培培培养养养养过过过过程程程程中中中中，细细细细胞胞胞胞的的的的寿寿寿寿命命命命有有有有一一一一定定定定的的的的限限限限度度度度，只只只只有有有有癌癌癌癌细细细细胞胞胞胞和和和和发发发发生生生生转转转转化化化化的的的的细细细细胞胞胞胞才才

3、才才能能能能无无无无限限限限增增增增殖下去。殖下去。殖下去。殖下去。所所所所谓谓谓谓转化即即即即是是是是指指正正常常细细胞胞在在某某种种因因子子的的作作用用下下发发生生突突变变而成为具有癌特性的细胞。而成为具有癌特性的细胞。2021/7/27 星期二4建建立立无无限限细细胞胞系系的的关关键键就就是是要要千千方方百百计计地地使使培培养养细细胞胞发发生生转转化化，即即用用某某种种因因子子刺刺激激正常细胞发生突变而具有癌特性。正常细胞发生突变而具有癌特性。目目前前，使使正正常常培培养养细细胞胞发发生生转转化化的的刺刺激激因因子子主主要要有有三三大大类类：物物理理因因子子、化化学学因因子子和和生物因子

4、。生物因子。2021/7/27 星期二5（一）物理因子（一）物理因子能使培养能使培养能使培养能使培养细细胞胞胞胞发发生生生生转转化的化的化的化的物理因子主要是指物理因子主要是指物理因子主要是指物理因子主要是指一些一些一些一些电电离离离离辐辐射：射：射：射：放射性同位素的射放射性同位素的射放射性同位素的射放射性同位素的射线线：60606060CoCoCoCo、14141414C C C C、131131131131I I I I、32323232P P P P、3 3 3 3H H H HX X 射线射线射线射线紫外线照射紫外线照射紫外线照射紫外线照射物物理理致致癌癌剂剂2021/7/27 星期

5、二6（二）化学因子（二）化学因子对细对细胞具有胞具有胞具有胞具有转转化作用的化作用的化作用的化作用的化学因子达数千种之多，化学因子达数千种之多，化学因子达数千种之多，化学因子达数千种之多，其中有无机物，也有有机物。其中有无机物，也有有机物。其中有无机物，也有有机物。其中有无机物，也有有机物。无机物：砷砷砷砷、石石石石棉棉棉棉、铬铬化化化化合合合合物物物物、镍镍化化化化合合合合物物物物、镉镉化化化化合合合合物物物物有机物：苯苯苯苯、联联苯苯苯苯胺胺胺胺、杂杂环环烃烃、煤煤煤煤焦焦焦焦油油油油、黄黄黄黄曲曲曲曲霉霉霉霉素素素素(aflatoxin)(aflatoxin)、亚亚硝胺、烟碱硝胺、烟碱硝

6、胺、烟碱硝胺、烟碱(nicotine)(nicotine)化化学学致致癌癌剂剂2021/7/27 星期二7（三）生物因子（三）生物因子对对细细胞胞胞胞具具具具有有有有转转化化化化作作作作用用用用的的的的生生生生物物物物因因因因子子子子为为肿肿肿肿瘤瘤瘤瘤病病病病毒毒毒毒(tumor(tumor virus)virus)，又又又又 称称称称 致致致致 癌癌癌癌 病病病病 毒毒毒毒(oncogenic(oncogenic virus)virus)。现现已已已已发发现现有有有有许许多多多多种种种种病病病病毒毒毒毒可可可可引引引引起起起起动动物物物物或或或或植植植植物物物物发发生生生生肿肿瘤瘤瘤瘤。肿

7、肿瘤瘤瘤瘤病病病病毒毒毒毒中中中中有有有有DNADNA病病病病毒毒毒毒，也也也也有有有有RNARNA病病病病毒。毒。毒。毒。2021/7/27 星期二8RousRous肉瘤病毒(Rous(Rous sarcoma sarcoma virus)virus)：一一一一种种种种RNARNA病病病病毒毒毒毒，其其其其基基基基因因因因组组含含含含有有有有一一一一个个个个癌癌癌癌基基基基因因因因srcsrc，编编码码产产物物物物为为具具具具有有有有蛋蛋蛋蛋白白白白质质激激激激酶酶活活活活性性性性的的的的pp60pp60srcsrc蛋蛋蛋蛋白白白白，可可可可使使使使许许多蛋白多蛋白多蛋白多蛋白质质磷酸化，通

8、磷酸化，通磷酸化，通磷酸化，通过级联过级联反反反反应应，诱发细诱发细胞癌胞癌胞癌胞癌变变。pp60pp60srcsrc蛋蛋蛋蛋白白白白是是是是一一一一种种种种膜膜膜膜蛋蛋蛋蛋白白白白，结结合合合合在在在在质质膜膜膜膜的的的的内内内内表表表表面面面面，它它它它可可可可催催催催化化化化磷磷磷磷酸酸酸酸根根根根转转移移移移到到到到一一一一些些些些蛋蛋蛋蛋白白白白质质的的的的酪酪酪酪氨氨氨氨酸酸酸酸残残残残基基基基上上上上，使使使使磷磷磷磷酸酸酸酸化化化化酪酪酪酪氨氨氨氨酸酸酸酸在在在在细细胞胞胞胞中中中中的的的的含含含含量量量量提提提提高高高高了了了了1010倍。倍。倍。倍。2021/7/27 星期

9、二9(Src(Src蛋白蛋白蛋白蛋白,Tyr,Tyr激酶激酶激酶激酶)P PTyrTyr蛋白质磷酸化蛋白质磷酸化蛋白质磷酸化蛋白质磷酸化细胞癌变细胞癌变无活性无活性无活性无活性pp60pp60srcsrcRSV病毒中病毒中v-src基因的致癌机制图解基因的致癌机制图解质膜质膜质膜质膜跨膜受体蛋白跨膜受体蛋白跨膜受体蛋白跨膜受体蛋白细胞外配体细胞外配体细胞外配体细胞外配体活性活性活性活性p pp60p60srcsrc质膜质膜质膜质膜跨膜受体蛋白跨膜受体蛋白跨膜受体蛋白跨膜受体蛋白磷酸化酪氨酸两种作用：磷酸化酪氨酸两种作用：一是使细胞的正常调节一是使细胞的正常调节机制失调机制失调,细胞增殖失去细胞

10、增殖失去控制；控制；二是使细胞的粘着性丧二是使细胞的粘着性丧失失,易发生扩散和转移。易发生扩散和转移。2021/7/27 星期二10虽虽虽虽然然然然动动动动物物物物细细细细胞胞胞胞在在在在培培培培养养养养皿皿皿皿、培培培培养养养养瓶瓶瓶瓶、培培培培养养养养板板板板中中中中均均均均可可可可生生生生长长长长，但但但但在在在在体体体体外外外外利利利利用用用用培培培培养养养养罐罐罐罐进进进进行行行行大大大大量量量量培培培培养养养养就就就就不不不不象象象象培培培培养养养养细细细细菌菌菌菌和酵母那样容易，是动物细胞培养的技术难题之一。和酵母那样容易，是动物细胞培养的技术难题之一。和酵母那样容易，是动物细胞

11、培养的技术难题之一。和酵母那样容易，是动物细胞培养的技术难题之一。目目目目前前前前这这一一一一问问题题已已已已经经解解解解决决决决，人人人人们们在在在在微微微微生生生生物物物物培培培培养养养养用用用用的的的的发发酵酵酵酵罐罐罐罐的的的的基基基基础础上上上上研研研研制制制制出出出出一一一一种种种种用用用用于于于于哺哺哺哺乳乳乳乳动动动动物物物物细细细细胞胞胞胞培培培培养养养养的的的的反反反反应应应应罐罐罐罐，用用用用以以以以大大大大量量量量培培培培养养养养悬悬浮浮浮浮细细胞胞胞胞（1 1个个个个振振振振动动搅搅拌拌拌拌器器器器：可可可可以以以以使使使使细细胞得到充足的胞得到充足的胞得到充足的胞得

12、到充足的营营养和氧气）。养和氧气）。养和氧气）。养和氧气）。转化动物细胞的规模化培养转化动物细胞的规模化培养2021/7/27 星期二11细细细细 胞胞胞胞 融融融融 合合合合(Cell(Cell fusion)fusion)又又又又 称称称称 为为为为 细细细细 胞胞胞胞 杂杂杂杂 交交交交(Cell(Cell hybridization)hybridization)，现现现现多多多多统统统统称称称称为为为为细细细细胞胞胞胞杂杂杂杂交交交交，是是是是指指指指2 2个个个个或或或或2 2个个个个以以以以上的细胞融合成上的细胞融合成上的细胞融合成上的细胞融合成1 1个细胞的过程个细胞的过程个细胞

13、的过程个细胞的过程。人人人人工工工工的的的的细细胞胞胞胞融融融融合合合合开开开开始始始始于于于于1950s1950s，此此此此后后后后作作作作为为一一一一门门新新新新兴兴技技技技术术发发展展展展非非非非常常常常快快快快，应应用用用用范范范范围围也也也也极极极极为为广广广广泛泛泛泛，不不不不仅仅同同同同种种种种类类细细胞胞胞胞间间可以融合，种可以融合，种可以融合，种可以融合，种间远缘细间远缘细胞也能融合。胞也能融合。胞也能融合。胞也能融合。细胞工程的发展是建立在细胞融合基础上的细胞工程的发展是建立在细胞融合基础上的细胞工程的发展是建立在细胞融合基础上的细胞工程的发展是建立在细胞融合基础上的。第二

14、章第二章 细胞融合技术细胞融合技术2021/7/27 星期二12细细胞胞胞胞融融融融合合合合不不不不仅仅可可可可用用用用于于于于生生生生物物物物学学学学的的的的基基基基础础理理理理论论研研研研究究究究，而而而而且且且且在在在在生生生生产产实实践践践践上上上上还还有有有有重重重重要要要要的的的的应应用用用用价价价价值值，如如如如目目目目前前前前在在在在单单克克克克隆隆隆隆抗抗抗抗体体体体的的的的制制制制备备、核核核核质质关关关关系系系系、体体体体细细胞胞胞胞的的的的遗遗传传和和和和发发育育育育、新新新新品品品品种种种种的的的的培培培培养养养养、免免免免疫疫疫疫作作作作用用用用、疾疾疾疾病病病病的

15、的的的治治治治疗疗和和和和性性性性状状状状的的的的改改改改良、潜伏病毒的研究等，已取得了良、潜伏病毒的研究等，已取得了良、潜伏病毒的研究等，已取得了良、潜伏病毒的研究等，已取得了显显著的成著的成著的成著的成绩绩。其中最突出的就是在制其中最突出的就是在制其中最突出的就是在制其中最突出的就是在制备备单克隆抗体单克隆抗体单克隆抗体单克隆抗体方面的方面的方面的方面的应应用！用！用！用！2021/7/27 星期二13根根根根据据据据所所所所用用用用促促促促融融融融剂剂的的的的不不不不同同同同，细细胞胞胞胞融融融融合合合合技技技技术术主主主主要要要要可可可可分分分分为为四大四大四大四大类类：病毒介导的细胞

16、融合技术病毒介导的细胞融合技术病毒介导的细胞融合技术病毒介导的细胞融合技术化学介导的细胞融合技术化学介导的细胞融合技术化学介导的细胞融合技术化学介导的细胞融合技术电击介导的细胞融合技术电击介导的细胞融合技术电击介导的细胞融合技术电击介导的细胞融合技术激光介导的细胞融合技术激光介导的细胞融合技术激光介导的细胞融合技术激光介导的细胞融合技术2021/7/27 星期二14一、病毒介导的细胞融合技术一、病毒介导的细胞融合技术vv促促促促融融融融剂剂剂剂：麻麻麻麻疹疹疹疹病病病病毒毒毒毒、副副副副流流流流感感感感病病病病毒毒毒毒、新新新新城城城城鸡鸡鸡鸡瘟瘟瘟瘟病病病病毒毒毒毒、仙仙仙仙台台台台病病病病

17、毒毒毒毒以以以以及及及及其其其其他他他他一一一一些些些些副副副副粘粘粘粘液液液液科科科科的病毒的病毒的病毒的病毒vv基基基基本本本本原原原原理理理理：病病病病毒毒毒毒被被被被膜膜膜膜中中中中的的的的糖糖糖糖蛋蛋蛋蛋白白白白含含含含有有有有融融融融合合合合蛋蛋蛋蛋白白白白(fusion(fusion protein)protein),既既既既可可可可介介介介导导导导病病病病毒毒毒毒同同同同宿宿宿宿主主主主细细细细胞融合胞融合胞融合胞融合,又可诱导细胞与细胞融合。又可诱导细胞与细胞融合。又可诱导细胞与细胞融合。又可诱导细胞与细胞融合。操作繁琐；操作繁琐；操作繁琐；操作繁琐；促融效果较好促融效果较好

18、促融效果较好促融效果较好2021/7/27 星期二15融融融融合合合合蛋蛋蛋蛋白白白白是是是是副副副副粘粘粘粘病病病病毒毒毒毒的的的的两两两两种种种种包包包包膜膜膜膜糖糖糖糖蛋蛋蛋蛋白白白白之之之之一一一一，其其其其主主主主要要要要功功功功能能能能是是是是引引引引起起起起病病病病毒毒毒毒包包包包膜膜膜膜与与与与靶靶靶靶细细胞胞胞胞膜膜膜膜或或或或被被被被感感感感染染染染的靶的靶的靶的靶细细胞膜之胞膜之胞膜之胞膜之间发间发生融合。生融合。生融合。生融合。细细胞胞胞胞融融融融合合合合过过程程程程需需需需要要要要另另另另一一一一种种种种包包包包膜膜膜膜糖糖糖糖蛋蛋蛋蛋白白白白血血血血凝凝凝凝素素素素

19、-神神神神经经氨氨氨氨酸酸酸酸酶酶的的的的协协助助助助。融融融融合合合合蛋蛋蛋蛋白白白白需需需需要要要要和和和和同同同同源源源源性性性性血血血血凝凝凝凝素素素素-神神神神经经氨氨氨氨酸酸酸酸酶酶共共共共同同同同表表表表达达达达才才才才能能能能显显示示示示出出出出融融融融合合合合细细胞的活性。胞的活性。胞的活性。胞的活性。2021/7/27 星期二16病毒病毒病毒病毒增殖增殖增殖增殖紫外线灭活紫外线灭活紫外线灭活紫外线灭活稀释稀释稀释稀释细胞悬液细胞悬液细胞悬液细胞悬液细胞融合细胞融合细胞融合细胞融合诱导诱导诱导诱导基本操作流程基本操作流程筛选筛选筛选筛选2021/7/27 星期二17二、化学介

20、导的细胞融合技术二、化学介导的细胞融合技术聚乙二醇聚乙二醇聚乙二醇聚乙二醇(polyethyleneglycol(polyethyleneglycol，PEGPEG)vv促融剂：促融剂：促融剂：促融剂：vv基基基基本本本本原原原原理理理理：一一一一般般般般认认认认为为为为，PEGPEG改改改改变变变变各各各各类类类类细细细细胞胞胞胞的的的的膜膜膜膜结结结结构构构构，使使使使两两两两细细细细胞胞胞胞相相相相互互互互接接接接触触触触部部部部位位位位的的的的膜膜膜膜脂脂脂脂双双双双层层层层中中中中磷磷磷磷脂脂脂脂分分分分子子子子发发发发生生生生疏疏疏疏散散散散、进进进进而而而而使使使使其其其其结结结

21、结构构构构发发发发生生生生重重重重排排排排，再再再再加加加加上上上上膜膜膜膜脂脂脂脂双双双双层层层层的的的的相相相相互互互互亲亲亲亲合合合合以以以以及及及及彼彼彼彼此此此此间间间间表表表表面面面面张张张张力力力力的的的的作作作作用用用用，引引引引起起起起相相相相临临临临的的的的重重重重排排排排质质质质膜膜膜膜在在在在修修修修复复复复时时时时相相相相互互互互合合合合并并并并在在在在一一一一起起起起,使使使使两两两两细细细细胞胞胞胞的的的的胞胞胞胞质质质质沟通沟通沟通沟通,从而造成相互接触的细胞之间发生融合。从而造成相互接触的细胞之间发生融合。从而造成相互接触的细胞之间发生融合。从而造成相互接触的

22、细胞之间发生融合。操作简便；操作简便；操作简便；操作简便；促融效果好促融效果好促融效果好促融效果好2021/7/27 星期二18诱导诱导基本操作流程基本操作流程A A细胞细胞细胞细胞融合细胞融合细胞B B细胞细胞细胞细胞A/BA/B细胞混合物细胞混合物细胞混合物细胞混合物按一定数量比例混合按一定数量比例混合与细胞混合物充分混匀与细胞混合物充分混匀与细胞混合物充分混匀与细胞混合物充分混匀一定温度、一定时间一定温度、一定时间一定温度、一定时间一定温度、一定时间计数计数筛选筛选筛选筛选PEG配配制制：加加热热溶溶化化，按按体体积积比比加加入入预预热热至至50oC的的无无血血清清培培养养基基后后混混匀

23、匀，降降温温至至使用温度待用使用温度待用PEGPEG配制配制配制配制PEG(MW1000-PEG(MW1000-4000,4060%)4000,4060%)2021/7/27 星期二19促促促促融融融融效效效效果果果果与与与与PEGPEG的的的的分分分分子子子子量量量量及及及及其其其其浓浓浓浓度度度度成成成成正正正正比比比比；但但但但PEGPEG分分分分子子子子量量量量越越越越大大大大、浓浓浓浓度度度度越越越越高高高高,对对对对细细细细胞胞胞胞的的的的毒毒毒毒性性性性也也也也就就就就越越越越大大大大（在在在在实实实实验验验验时时时时常常常常常常常常采采采采用用用用的的的的分分分分子子子子量量量

24、量1000400010004000的的的的PEGPEG，浓度一般为，浓度一般为，浓度一般为，浓度一般为4060%4060%）PEGPEG介导细胞融合效果的影响因素：介导细胞融合效果的影响因素：介导细胞融合效果的影响因素：介导细胞融合效果的影响因素：1.PEG1.PEG1.PEG1.PEG分子量与浓度分子量与浓度分子量与浓度分子量与浓度:融融融融合合合合效效效效果果果果与与与与温温温温度度度度成成成成正正正正比比比比（质质质质膜膜膜膜流流流流动动动动性性性性与与与与温温温温度度度度成成成成正正正正比比比比），为为为为获获获获得得得得最最最最佳佳佳佳融融融融合合合合效效效效果果果果,在在在在细细细

25、细胞胞胞胞可可可可能能能能承承承承受受受受的的的的温温温温度度度度范范范范围围围围内内内内可可可可适适适适当当当当提提提提高高高高处处处处理理理理的的的的温温温温度度度度（哺乳动物细胞，一般采用（哺乳动物细胞，一般采用（哺乳动物细胞，一般采用（哺乳动物细胞，一般采用38403840）2.PEG2.PEG2.PEG2.PEG的的的的pHpHpHpH值值值值:pH8.08.2pH8.08.2：融合效果较好：融合效果较好：融合效果较好：融合效果较好3.PEG3.PEG3.PEG3.PEG作用时间作用时间作用时间作用时间:处处处处理理理理时时时时间间间间越越越越长长长长，融融融融合合合合效效效效果果果

26、果越越越越好好好好,但但但但对对对对细细细细胞胞胞胞的的的的毒毒毒毒害害害害也也也也就就就就越越越越大大大大（一一一一般般般般将将将将处处处处理理理理时时时时间间间间限限限限制制制制在在在在1min1min之内）之内）之内）之内）4.4.4.4.融合温度融合温度融合温度融合温度:2021/7/27 星期二20三、电击介导的细胞融合技术三、电击介导的细胞融合技术操作简便、快速操作简便、快速操作简便、快速操作简便、快速/促促促促融效果好融效果好融效果好融效果好/高回收率高回收率高回收率高回收率/对细胞毒性小对细胞毒性小对细胞毒性小对细胞毒性小原原理理：游游游游离离离离动动物物物物细细胞胞胞胞或或或

27、或去去去去壁壁壁壁原原原原生生生生质质体体体体，在在在在电电融融融融合合合合室室室室中中中中，在在在在高高高高频频交交交交流流流流电电场场的的的的作作作作用用用用下下下下，细细胞胞胞胞被被被被极极极极化化化化成成成成偶偶偶偶极极极极子子子子，造造造造成成成成细细胞胞胞胞间间相相相相互互互互连连接接接接成成成成点点点点接接接接触触触触状状状状态态；然然然然后后后后施施施施加加加加方方方方波波波波脉脉脉脉冲冲冲冲予予予予以以以以刺刺刺刺激激激激，由由由由于于于于电电脉脉脉脉冲冲冲冲的的的的瞬瞬瞬瞬间间作作作作用用用用，可可可可击击破破破破两两两两细细胞胞胞胞接接接接触触触触点点点点处处的的的的质质

28、膜膜膜膜，此此此此时时质质膜膜膜膜的的的的脂脂脂脂类类分分分分子子子子发发生生生生重重重重组组，同同同同时时由由由由于于于于细细胞胞胞胞表表表表面面面面的的的的张张力力力力作作作作用，两个点接触用，两个点接触用，两个点接触用，两个点接触细细胞逐步胞逐步胞逐步胞逐步发发生生生生细细胞融合。胞融合。胞融合。胞融合。BioRadBioRad电融合仪电融合仪电融合仪电融合仪2021/7/27 星期二21动物细胞动物细胞动物细胞动物细胞0.6M0.6M甘露醇，甘露醇，甘露醇，甘露醇，0.5mMCaC10.5mMCaC12 22H2H2 20 080-300V/cm,80-300V/cm,0.5-10.5

29、-1兆赫兹兆赫兹兆赫兹兆赫兹,30-9030-90秒秒秒秒0.5-1.5KV/cm,0.5-1.5KV/cm,幅度脉宽幅度脉宽幅度脉宽幅度脉宽2525微秒微秒微秒微秒融合细胞融合细胞融合细胞融合细胞诱导诱导诱导诱导基本操作流程基本操作流程筛选筛选筛选筛选电击液电击液电击液电击液悬浮于悬浮于悬浮于悬浮于融合小室的电极间融合小室的电极间融合小室的电极间融合小室的电极间加入至加入至加入至加入至细胞排列成串细胞排列成串细胞排列成串细胞排列成串电泳效应电泳效应电泳效应电泳效应正弦交变电场正弦交变电场正弦交变电场正弦交变电场施加施加施加施加2-32-3个脉冲电场个脉冲电场个脉冲电场个脉冲电场施加施加施加施

30、加2021/7/27 星期二22原原理理：贴贴贴贴在在在在一一一一起起起起的的的的两两两两个个个个细细细细胞胞胞胞，用用用用高高高高峰峰峰峰值值值值功功功功率率率率密密密密度度度度激激激激光光光光对对对对细细细细胞胞胞胞接接接接触触触触处处处处的的的的质质质质膜膜膜膜进进进进行行行行辐辐辐辐照照照照，质质质质膜膜膜膜发发发发生生生生光光光光击击击击穿穿穿穿，可可可可产产产产生生生生微微微微米米米米量量量量级级级级的的的的微微微微孔孔孔孔，因因因因质质质质膜膜膜膜上上上上的的的的微微微微孔孔孔孔可可可可逆逆逆逆，质质质质膜膜膜膜分分分分子子子子在在在在重重重重组组组组过过过过程程程程中中中中借借

31、借借助助助助细细细细胞胞胞胞连连连连接接接接处处处处小小小小孔孔孔孔的的的的很很很很高高高高的的的的表表表表面面面面曲曲曲曲率而处于高张力状态，导致细胞发生融合。率而处于高张力状态，导致细胞发生融合。率而处于高张力状态，导致细胞发生融合。率而处于高张力状态，导致细胞发生融合。四、激光细胞融合技术四、激光细胞融合技术2021/7/27 星期二23激光细胞融合法与其它化学物理方法相比较具有许多优点：激光细胞融合法与其它化学物理方法相比较具有许多优点：激光细胞融合法与其它化学物理方法相比较具有许多优点：激光细胞融合法与其它化学物理方法相比较具有许多优点：（1 1 1 1）能选择任意两个细胞之间进行融

32、合；）能选择任意两个细胞之间进行融合；）能选择任意两个细胞之间进行融合；）能选择任意两个细胞之间进行融合；（2 2 2 2）因因因因仅仅仅仅在在在在两两两两个个个个细细细细胞胞胞胞的的的的接接接接触触触触点点点点照照照照射射射射激激激激光光光光，故故故故作作作作用用用用于细胞的应力和障碍小于细胞的应力和障碍小于细胞的应力和障碍小于细胞的应力和障碍小;（3 3 3 3）可进行非接触、安全且远距离的无菌操作；）可进行非接触、安全且远距离的无菌操作；）可进行非接触、安全且远距离的无菌操作；）可进行非接触、安全且远距离的无菌操作；（4 4 4 4）能适时观察融合过程。）能适时观察融合过程。）能适时观察

33、融合过程。）能适时观察融合过程。2021/7/27 星期二24第三章第三章第三章第三章 哺乳动物克隆技术哺乳动物克隆技术哺乳动物克隆技术哺乳动物克隆技术（细胞核移植技术）（细胞核移植技术）（细胞核移植技术）（细胞核移植技术）2021/7/27 星期二25随随随随着着着着19971997年年年年2 2月月月月NatureNature杂杂杂杂志志志志报报报报道道道道英英英英国国国国RoslinRoslin研研研研究究究究所所所所I.WilmutI.WilmutI.WilmutI.Wilmut等等等等人人人人创创创创造造造造的的的的克克克克隆隆隆隆羊羊羊羊多多多多莉莉莉莉(Dolly)(Dolly)

34、诞诞诞诞生生生生，生物工程掀开了新的一页。生物工程掀开了新的一页。生物工程掀开了新的一页。生物工程掀开了新的一页。克克克克隆隆隆隆(clone)(clone)一一一一词词词词原原原原意意意意为为为为无无无无性性性性繁繁繁繁殖殖殖殖系系系系，在在在在体体体体外外外外培培培培养养养养的的的的细细细细胞胞胞胞中中中中早早早早有有有有使使使使用用用用，细细细细胞胞胞胞克克克克隆隆隆隆是是是是指指指指由由由由一一一一个个个个细细细细胞胞胞胞经经经经细细细细胞胞胞胞分分分分裂裂裂裂而而而而产产产产生生生生出出出出的的的的一一一一群群群群细细细细胞胞胞胞，而而而而动动动动物物物物克克克克隆隆隆隆是是是是指指

35、指指由由由由一一一一个个个个动动动动物物物物经经经经无无无无性性性性繁繁繁繁殖殖殖殖而而而而产产产产生生生生的的的的遗遗遗遗传传传传性性性性状状状状完完完完全全全全相相相相同同同同的的的的后代个体。后代个体。后代个体。后代个体。2021/7/27 星期二26克克克克隆隆隆隆羊羊羊羊“多多多多莉莉莉莉”诞诞诞诞生生生生后后后后，克克克克隆隆隆隆技技技技术术术术研研研研究究究究立立立立即即即即成成成成为为为为世世世世界界界界各各各各国国国国生生生生物物物物学学学学家家家家竞竞竞竞相相相相开开开开展展展展的的的的生生生生物物物物学学学学高高高高新新新新技技技技术研究。术研究。术研究。术研究。克克克克

36、隆隆隆隆技技技技术术术术之之之之所所所所以以以以一一一一经经经经产产产产生生生生立立立立即即即即引引引引起起起起高高高高度度度度重重重重视视视视，是是是是因因因因为为为为克克隆隆技技术术不不但但具具有有重重要要的的理理论论意意义义而而且且具具有良好的应用前景有良好的应用前景。2021/7/27 星期二为什么要进行动物克隆?例：例：1997年，美国威斯康星州的一个奶牛年，美国威斯康星州的一个奶牛场有一头叫卢辛达的奶牛，年产牛奶场有一头叫卢辛达的奶牛，年产牛奶30.8 t，创造了世界奶牛产奶量最高的纪录；，创造了世界奶牛产奶量最高的纪录；而一头普通奶牛的产奶量年平均水平仅为而一头普通奶牛的产奶量年

37、平均水平仅为3-4 t，如果能用体细胞核移植技术，克隆，如果能用体细胞核移植技术，克隆高产奶牛，就可以大大提高牛奶产量。高产奶牛，就可以大大提高牛奶产量。272021/7/27 星期二282021/7/27 星期二29第一节第一节 哺乳动物克隆的发展历史哺乳动物克隆的发展历史同种胚胎细胞克隆同种胚胎细胞克隆同种体细胞克隆同种体细胞克隆异种体细胞克隆异种体细胞克隆克克克克隆隆隆隆动动动动物物物物技技技技术术术术的的的的发发发发展展展展已已已已经经经经历历历历了了了了6060余余余余年年年年的的的的漫漫漫漫长长长长探探探探索索索索，根根根根据据据据供供供供体体体体细细细细胞胞胞胞核核核核与与与与去

38、去去去核核核核卵卵卵卵细细细细胞胞胞胞的的的的来来来来源源源源可可可可归纳为归纳为归纳为归纳为3 3个标志性的发展阶段个标志性的发展阶段个标志性的发展阶段个标志性的发展阶段。2021/7/27 星期二3019381938年年年年,德国科学家德国科学家德国科学家德国科学家SpemannSpemann最早提出克隆设想最早提出克隆设想最早提出克隆设想最早提出克隆设想。19521952年年年年,美美美美国国国国科科科科学学学学家家家家BriggsBriggs和和和和KingKing将将将将发发发发育育育育后后后后期期期期的的的的青青青青蛙胚胎细胞核植入青蛙卵中蛙胚胎细胞核植入青蛙卵中蛙胚胎细胞核植入青

39、蛙卵中蛙胚胎细胞核植入青蛙卵中,没有发育。没有发育。没有发育。没有发育。19651965年年年年,中中中中国国国国科科科科学学学学家家家家童童童童第第第第周周周周完完完完成成成成了了了了金金金金鱼鱼鱼鱼核核核核移移移移植植植植并并并并获获获获得成功得成功得成功得成功。19811981年年年年,IllmenseeIllmensee和和和和HoppeHoppe用用用用小小小小鼠鼠鼠鼠胚胚胚胚胎胎胎胎细细细细胞胞胞胞第第第第一一一一次次次次获得了获得了获得了获得了克隆小鼠克隆小鼠克隆小鼠克隆小鼠，但其实验未能被重复。，但其实验未能被重复。，但其实验未能被重复。，但其实验未能被重复。19841984年

40、年年年,丹丹丹丹麦麦麦麦科科科科学学学学家家家家WilladsenWilladsen用用用用胚胚胚胚胎胎胎胎细细细细胞胞胞胞克克克克隆隆隆隆羊羊羊羊获成功。获成功。获成功。获成功。第一阶段第一阶段 同种胚胎细胞克隆同种胚胎细胞克隆2021/7/27 星期二童第周童第周童第周童第周（1902-19791902-1979）童第周等童第周等(1965)将金鱼囊胚细将金鱼囊胚细胞核移植到鳑鮍的去核卵中胞核移植到鳑鮍的去核卵中,获得了少数核质杂种获得了少数核质杂种(nucleo-cytoplasmic hybrid,NCH)幼鱼幼鱼312021/7/27 星期二321990199019901990年年年

41、年,中中中中国国国国科科科科学学学学院院院院发发发发育育育育生生生生物物物物学学学学研研研研究究究究所所所所杜杜杜杜淼淼淼淼获获获获得得得得了了了了克克克克隆隆隆隆兔兔兔兔。随随随随后后后后,中中中中国国国国科科科科学学学学家家家家利利利利用用用用胚胚胚胚胎胎胎胎细细细细胞胞胞胞相相相相继克隆成了继克隆成了继克隆成了继克隆成了羊、猪、牛、小鼠羊、猪、牛、小鼠羊、猪、牛、小鼠羊、猪、牛、小鼠等几种动物。等几种动物。等几种动物。等几种动物。1993199319931993年年年年,美美美美国国国国的的的的FirstFirstFirstFirst用用用用牛牛牛牛内内内内细细细细胞胞胞胞团团团团细细细

42、细胞胞胞胞成成成成功功功功地地地地获获获获得了得了得了得了克隆牛克隆牛克隆牛克隆牛。1997199719971997年年年年,中国学者孟励在美国中国学者孟励在美国中国学者孟励在美国中国学者孟励在美国成功获得成功获得成功获得成功获得克隆猴克隆猴克隆猴克隆猴。至此至此至此至此,国内外动物克隆采用的均为国内外动物克隆采用的均为国内外动物克隆采用的均为国内外动物克隆采用的均为胚胎细胞。胚胎细胞。胚胎细胞。胚胎细胞。2021/7/27 星期二331997199719971997年，用胚胎细胞获得的克隆猴年，用胚胎细胞获得的克隆猴年，用胚胎细胞获得的克隆猴年，用胚胎细胞获得的克隆猴2021/7/27 星期

43、二3419641964年年年年,Gurdon,Gurdon以爪以爪以爪以爪蟾为材料蟾为材料蟾为材料蟾为材料,最早进行了最早进行了最早进行了最早进行了体细胞核移植的尝试体细胞核移植的尝试体细胞核移植的尝试体细胞核移植的尝试,获得了获得了获得了获得了1.51.5的蝌蚪。的蝌蚪。的蝌蚪。的蝌蚪。第二阶段第二阶段 同种体细胞克隆同种体细胞克隆2021/7/27 星期二35Dolly 的产生的产生19971997年年年年,英英英英国国国国罗罗罗罗斯斯斯斯林林林林研研研研究究究究所所所所I.I.WilmutWilmut等等等等宣宣宣宣布布布布用用用用成成成成年年年年羊羊羊羊乳乳乳乳腺腺腺腺细细细细胞胞胞胞

44、首首首首次次次次获获获获得得得得克克克克隆隆隆隆羊羊羊羊“多莉多莉多莉多莉”。2021/7/27 星期二实验成功的关键：实验成功的关键：血清饥饿法血清饥饿法 使细胞核与去核卵细胞处于细胞周期的同使细胞核与去核卵细胞处于细胞周期的同步状态步状态,以利于恢复核的全能性以利于恢复核的全能性(重编程重编程).).362021/7/27 星期二372021/7/27 星期二3819981998年年，美美国国夏夏威威夷夷大大学学的的YanagimachiYanagimachi等等用用克克隆隆鼠鼠的的卵卵丘丘细细胞胞核核作作供供体体，获获得得了克隆再克隆小鼠。了克隆再克隆小鼠。19981998年年，新新西西

45、兰兰成成功功地地克克隆隆了了奶奶牛牛，并并克克隆了世界上仅存的最后一头珍稀牛。隆了世界上仅存的最后一头珍稀牛。至此，同种体细胞克隆进入成熟阶段。至此，同种体细胞克隆进入成熟阶段。2021/7/27 星期二39克隆牛克隆牛克隆牛克隆牛克隆猕猴克隆猕猴克隆猕猴克隆猕猴克隆狗克隆狗克隆狗克隆狗2021/7/27 星期二4020022002年初，我国首批成年体细胞克隆牛的群体诞生年初，我国首批成年体细胞克隆牛的群体诞生年初，我国首批成年体细胞克隆牛的群体诞生年初，我国首批成年体细胞克隆牛的群体诞生2021/7/27 星期二41第三阶段第三阶段 异种体细胞克隆异种体细胞克隆 濒危物种数量日益减少，很难提

46、供用于克隆濒危物种数量日益减少，很难提供用于克隆濒危物种数量日益减少，很难提供用于克隆濒危物种数量日益减少，很难提供用于克隆的卵母细胞和代孕受体，的卵母细胞和代孕受体，的卵母细胞和代孕受体，的卵母细胞和代孕受体，促使科学家提出了异种促使科学家提出了异种促使科学家提出了异种促使科学家提出了异种克隆的设想：克隆的设想：克隆的设想：克隆的设想：将一种动物的体细胞核移植到另一将一种动物的体细胞核移植到另一将一种动物的体细胞核移植到另一将一种动物的体细胞核移植到另一种动物的去核种动物的去核种动物的去核种动物的去核(遗传物质遗传物质遗传物质遗传物质)卵母细胞中卵母细胞中卵母细胞中卵母细胞中，来得以实，来得

47、以实，来得以实，来得以实现克隆的技术。但此阶段技术还处在实验探究阶现克隆的技术。但此阶段技术还处在实验探究阶现克隆的技术。但此阶段技术还处在实验探究阶现克隆的技术。但此阶段技术还处在实验探究阶段，尚未完全成熟。段，尚未完全成熟。段，尚未完全成熟。段，尚未完全成熟。2021/7/27 星期二421998199819981998年年年年1 1 1 1月，美国威斯康星大学的科学家们月，美国威斯康星大学的科学家们月，美国威斯康星大学的科学家们月，美国威斯康星大学的科学家们以牛的卵细胞为受体以牛的卵细胞为受体以牛的卵细胞为受体以牛的卵细胞为受体，成功克隆出猪、牛、羊、，成功克隆出猪、牛、羊、，成功克隆出

48、猪、牛、羊、，成功克隆出猪、牛、羊、鼠和猕猴五种哺乳动物的胚胎。鼠和猕猴五种哺乳动物的胚胎。鼠和猕猴五种哺乳动物的胚胎。鼠和猕猴五种哺乳动物的胚胎。1998199819981998年年年年1999199919991999年，美国人年，美国人年，美国人年，美国人WhiteWhiteWhiteWhite用珍稀动物用珍稀动物用珍稀动物用珍稀动物盘羊的体细胞核与牛卵结合，我国学者陈大元将盘羊的体细胞核与牛卵结合，我国学者陈大元将盘羊的体细胞核与牛卵结合，我国学者陈大元将盘羊的体细胞核与牛卵结合，我国学者陈大元将大熊猫体细胞核与兔卵结合，大熊猫体细胞核与兔卵结合，大熊猫体细胞核与兔卵结合，大熊猫体细胞核

49、与兔卵结合，均成功克隆出早期均成功克隆出早期均成功克隆出早期均成功克隆出早期胚胎胚胎胚胎胚胎。2021/7/27 星期二4320002000年，欧洲盘羊年，欧洲盘羊-奥姆布雷塔被成功克隆，科奥姆布雷塔被成功克隆，科学家是为了营救目前世界上数目稀少的欧洲盘羊，学家是为了营救目前世界上数目稀少的欧洲盘羊，避免它们从地球上灭绝消失。避免它们从地球上灭绝消失。2021/7/27 星期二442003200320032003年年年年5 5 5 5月，世界上第一只克隆骡子月，世界上第一只克隆骡子月，世界上第一只克隆骡子月，世界上第一只克隆骡子-格姆在美国诞生格姆在美国诞生格姆在美国诞生格姆在美国诞生2021

50、/7/27 星期二4520052005年年8 8月月2424日，中国科学院动物研究所陈大元教授日，中国科学院动物研究所陈大元教授领导的团队，国际首例体细胞克隆亚洲黄羊在山东领导的团队，国际首例体细胞克隆亚洲黄羊在山东顺利降生（用山羊做受体）。顺利降生（用山羊做受体）。2021/7/27 星期二46第二节第二节 哺乳动物克隆的技术方法哺乳动物克隆的技术方法克隆动物主要方法：克隆动物主要方法：p胚胎分割胚胎分割p胚胎细胞核移植胚胎细胞核移植p体细胞核移植体细胞核移植p连续细胞核移植连续细胞核移植2021/7/27 星期二47优质动物体细胞的来源优质动物体细胞的来源优质动物体细胞的来源优质动物体细胞