实验一氨基酸的分离鉴定纸层析法.ppt

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1、1基基 础础 生生 物物 化化 学学 实实 验验2实验内容安排实验内容安排l实验一实验一 氨基酸的分离鉴定（纸层析法）（氨基酸的分离鉴定（纸层析法）（P P3535）l实验二实验二 胰蛋白酶抑制剂的分离纯化和活性测定（胰蛋白酶抑制剂的分离纯化和活性测定（P P4040）l实验三实验三 酶的基本性质（酶的基本性质（P P8585）l实验四实验四 酵母核糖核酸的分离与组分鉴定（酵母核糖核酸的分离与组分鉴定（P P159159）l实验五实验五 PAGEPAGE分离过氧化物同工酶（分离过氧化物同工酶（P P9898）l实验六实验六 血液血液DNADNA的提取（的提取（P P162162）3熟悉和掌握基

2、本的生物化学实验操作及技能；熟悉和掌握基本的生物化学实验操作及技能；通过实验加深对生物化学基本理论和概念的理通过实验加深对生物化学基本理论和概念的理解；解；培养分析问题和解决问题的能力以及严谨细致培养分析问题和解决问题的能力以及严谨细致的科学作风。的科学作风。实验目的4通过实验应该做到掌握各个实验的基本原理，学会严密地组织自己掌握各个实验的基本原理，学会严密地组织自己的实验，合理地安排实验步骤和时间。的实验，合理地安排实验步骤和时间。训练实验的动手能力，学会熟练地使用各种生化训练实验的动手能力，学会熟练地使用各种生化实验仪器。实验仪器。以实事求是的科学态度如实记录实验结果，认真以实事求是的科学

3、态度如实记录实验结果，认真分析并作出客观结论。分析并作出客观结论。掌握生物化学的基本实验方法和实验技术，为今掌握生物化学的基本实验方法和实验技术，为今后参加科研工作打下坚实的基础。后参加科研工作打下坚实的基础。5实验要求实验前预习实验前预习准时到实验室准时到实验室实验两人一组，固定座位。实验两人一组，固定座位。进实验室后不乱动实验台上的仪器、试剂进实验室后不乱动实验台上的仪器、试剂动手实验前认真听老师讲解实验原理、实验步骤及实验中动手实验前认真听老师讲解实验原理、实验步骤及实验中需注意的问题。需注意的问题。实验课中保持纪律，不随意走动，不大声喧哗，不早退。实验课中保持纪律，不随意走动，不大声喧

4、哗，不早退。操作过程要规范，用完物品及时归位。操作过程要规范，用完物品及时归位。及时记录实验现象，按时上交实验报告。及时记录实验现象，按时上交实验报告。全班分六组，每次实验结束后留一组打扫卫生。全班分六组，每次实验结束后留一组打扫卫生。6实验报告 实验报告实验报告实验报告实验报告是学生实验研究结果的记录和总结，同时也是评是学生实验研究结果的记录和总结，同时也是评价学生实验课成绩的重要依据。价学生实验课成绩的重要依据。实验报告的格式：实验报告的格式：一、实验目的一、实验目的 二、实验原理二、实验原理 三、仪器和试剂三、仪器和试剂 四、实验方法与步骤四、实验方法与步骤 五、实验结果与分析五、实验结

5、果与分析 六、讨论、心得六、讨论、心得 注意注意注意注意 讨论部分不是对结果的重述，而是实验结果、实验讨论部分不是对结果的重述，而是实验结果、实验方法和实验异常结果的分析和讨论，以及对实验设计的认识、方法和实验异常结果的分析和讨论，以及对实验设计的认识、体会及建议。体会及建议。7考核方式与评分方法 采取采取“学生实验平时考核学生实验平时考核学生实验平时考核学生实验平时考核”的方法进行实验考核。评分方的方法进行实验考核。评分方法采用百分制，每个环节都制定了法采用百分制，每个环节都制定了评分标准评分标准评分标准评分标准,各实验项目总各实验项目总成绩的平均值就是实验成绩。成绩的平均值就是实验成绩。实

6、验成绩实验成绩实验成绩实验成绩（预习成绩（预习成绩1010实验过程成绩实验过程成绩40%40%报告成绩报告成绩5050）N N 预习报告预习报告10101010 实验过程实验过程40404040 实验报告实验报告50505050 N N为所做实验项目的总个数为所做实验项目的总个数8基础生物化学实验课评分标准实验课中迟到或早退者其实验过程成绩须扣分。实验课中迟到或早退者其实验过程成绩须扣分。无故不做实验的学生其实验项目成绩评为零分。无故不做实验的学生其实验项目成绩评为零分。实验课缺勤超过实验课缺勤超过1/31/3的学生其实验总成绩评为不及的学生其实验总成绩评为不及格。格。在规定的时间内不能按时交

7、实验报告的学生其实在规定的时间内不能按时交实验报告的学生其实验报告成绩须扣分。验报告成绩须扣分。实验成绩占基础生物化学考试成绩的实验成绩占基础生物化学考试成绩的2020。9实验一 氨基酸的分离鉴定（纸层析法）通过实验，掌握纸层析法的一般原理和操作技术。通过实验，掌握纸层析法的一般原理和操作技术。掌握纸层析法分离鉴定氨基酸的一般过程。掌握纸层析法分离鉴定氨基酸的一般过程。【实验目的实验目的】10 【实验原理实验原理】层析技术层析技术层析技术层析技术 是一种物理的分离方法，利用混合物中各是一种物理的分离方法，利用混合物中各组分的物理化学性质的差别，使各组分以不同程度组分的物理化学性质的差别，使各组

8、分以不同程度分布在两相中，其中一相为分布在两相中，其中一相为固定相固定相固定相固定相，另一相流过此，另一相流过此相称作相称作流动相流动相流动相流动相，并使各组分以不同速度移动，从而，并使各组分以不同速度移动，从而达到分离的目的。达到分离的目的。可分离物质可分离物质可分离物质可分离物质 糖类、有机酸、氨基酸、核苷糖类、有机酸、氨基酸、核苷11【实验原理实验原理】支持物支持物支持物支持物 指层析法中用以指层析法中用以支持、容纳样品支持、容纳样品支持、容纳样品支持、容纳样品的物质。支持物的物质。支持物的本身或其包含的水、特殊基团在层析中起分离样品物质的本身或其包含的水、特殊基团在层析中起分离样品物质

9、的作用。如纸层析中的滤纸。的作用。如纸层析中的滤纸。固定相固定相固定相固定相 在层析中在层析中起分离作用而不随层析过程移动起分离作用而不随层析过程移动起分离作用而不随层析过程移动起分离作用而不随层析过程移动的物质。的物质。如纸层析中固定相是滤纸纤维中结合的水。固定相被看成如纸层析中固定相是滤纸纤维中结合的水。固定相被看成是样品移动的阻力。是样品移动的阻力。流动相流动相流动相流动相 在层析过程因其本身流动而在层析过程因其本身流动而推动样品移动推动样品移动推动样品移动推动样品移动的物质。的物质。12名称名称操作方式操作方式固定相固定相流动相流动相分离依据分离依据 分配层析分配层析 纸层析纸层析 薄

10、层层析薄层层析液体液体液体液体 溶解度溶解度 离子交换层析离子交换层析 离子交换柱层析离子交换柱层析固体固体液体液体 带电性带电性 静电引力静电引力 吸附层析吸附层析 吸附薄层层析吸附薄层层析 气体吸附层析气体吸附层析固体固体液体液体气体气体 吸附力吸附力 亲合层析亲合层析 酶与底物酶与底物 抗原与抗体抗原与抗体固体固体液体液体 配体专一性配体专一性 凝胶层析凝胶层析 凝胶过滤凝胶过滤固体固体液体液体 分子大小分子大小【实验原理实验原理】层析的分类层析的分类13 分配层析分配层析分配层析分配层析：是利用不同物质在两种不相溶的溶剂中：是利用不同物质在两种不相溶的溶剂中的分配系数不同而达到分离的一

11、种技术。的分配系数不同而达到分离的一种技术。分配系数分配系数 =溶质在固定相的浓度溶质在固定相的浓度溶质在流动相的浓度溶质在流动相的浓度【实验原理实验原理】14 【实验原理实验原理】纸层析纸层析 是以滤纸作为惰性支持物的是以滤纸作为惰性支持物的分配层析分配层析分配层析分配层析：纸纤：纸纤维上的维上的 -OH-OH 基具有亲水性，所以能基具有亲水性，所以能吸附吸附吸附吸附一层一层水水水水作作作作为为为为固定相固定相固定相固定相，而通常把而通常把有机溶剂有机溶剂有机溶剂有机溶剂作为作为流动相流动相流动相流动相。流动相。流动相流经支持物时与固定相间连续抽提，使物质在两相流经支持物时与固定相间连续抽提

12、，使物质在两相间不断地分配而得到分离。间不断地分配而得到分离。15【实验原理实验原理】分配系数不同的溶质移动速率不同。分配系数不同的溶质移动速率不同。溶质在滤纸上的移动速度用溶质在滤纸上的移动速度用R Rf f值表示：值表示：R Rf f=原点到层析斑点中心的距离原点到层析斑点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离原点到溶剂前沿的距离 在一定的条件下某种物质的在一定的条件下某种物质的RfRf值是常数。值是常数。RfRf值的大小值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析与物质的结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。本实验利用纸层析法分离氨基酸。温度等因素有关。本实验

13、利用纸层析法分离氨基酸。氨基酸与茚三酮的显色反应。氨基酸与茚三酮的显色反应。16【仪器和试剂仪器和试剂】实验仪器实验仪器1.1.电热鼓风干燥箱电热鼓风干燥箱2.2.培养皿、青霉素小瓶、毛细管、小型喷雾器培养皿、青霉素小瓶、毛细管、小型喷雾器3.3.层析滤纸、滤纸芯层析滤纸、滤纸芯实验材料和试剂实验材料和试剂1.1.氨氨基基酸酸溶溶液液 分分别别配配制制0.02M0.02M的的LeuLeu、ValVal、ProPro、ThrThr、LysLys溶液及氨基酸混合液。溶液及氨基酸混合液。2.2.显色剂显色剂0.1%0.1%水合茚三酮溶液。水合茚三酮溶液。3.3.扩展剂（展层剂）扩展剂（展层剂）酸溶剂

14、系统：正丁醇酸溶剂系统：正丁醇:冰醋酸冰醋酸:水水4:1:54:1:5（体积比）（体积比）17【实验方法与步骤实验方法与步骤】滤纸的准备滤纸的准备 在长度在长度15cm左右滤纸下方左右滤纸下方2、4cm处画一直线，在处画一直线，在4cm处的直线平均画处的直线平均画4个点，标记编号。个点，标记编号。点样点样 分别在每个点样处点同一样品分别在每个点样处点同一样品3次，次，每次干后点第二每次干后点第二次次，每次直径，每次直径2mm，铅笔标记。，铅笔标记。注意：手尽量少接触滤纸注意：手尽量少接触滤纸 滤纸芯、层析液滤纸芯、层析液18【实验方法与步骤实验方法与步骤】平衡平衡 在层析缸中倒入层析液，将滤纸

15、置于层析缸中，盖上在层析缸中倒入层析液，将滤纸置于层析缸中，盖上玻璃板，平衡玻璃板，平衡15min。注意：此时切勿使层析液接触到注意：此时切勿使层析液接触到2cm处的直线（点样）。处的直线（点样）。层析层析 待溶剂前沿走到滤纸待溶剂前沿走到滤纸2/3，取出滤纸，取出滤纸，铅笔描出溶剂铅笔描出溶剂前沿位置前沿位置。80烘箱中烘干，进行显色。烘箱中烘干，进行显色。显色显色 用喷雾器将用喷雾器将0.1%水合茚三酮显色剂均匀喷在层析滤纸水合茚三酮显色剂均匀喷在层析滤纸上，放入上，放入 80烘箱中约烘箱中约5min，即显出各氨基酸色斑，即显出各氨基酸色斑，铅铅笔描出各色斑轮廓笔描出各色斑轮廓。19【实验结果与分析实验结果与分析】20【实验结果与分析实验结果与分析】氨基酸标准溶液Leu ProLys 原点到层析斑点中心的距离(cm)原点到溶剂前沿的距离(cm)Rf 混合氨基酸溶液aa1 aa2 aa3原点到层析斑点中心的距离(cm)原点到溶剂前沿的距离(cm)Rf判断待测氨基酸21【讨论、心得讨论、心得】讨论部分不是对结果的重述，而是实验结果、实验方讨论部分不是对结果的重述，而是实验结果、实验方法和实验异常结果的分析和讨论，以及对实验设计的认识、法和实验异常结果的分析和讨论，以及对实验设计的认识、体会及建议。体会及建议。