张亚平,蛋白质组技术.ppt

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1、-周有文、张亚萍周有文、张亚萍什么是蛋白质组？什么是蛋白质组？主要方法蛋白质分离技术 凝胶双向电泳凝胶双向电泳、HPLC；蛋白质鉴定技术 Edman 测序、质谱技术质谱技术；图像分析与生物信息 图像分析软件，数据库；相互作用研究技术 酵母双杂交技术酵母双杂交技术、免疫共沉淀、蛋白质芯片等。双双向向电电泳泳技技术术、计计算算机机图图像像分分析析与与大大规规模模数数据据处处理理技技术术以以及及质质谱谱技技术术被被称称为为蛋蛋白白质质组组研研究究的的三三大大基基本本支支撑撑技技术术。蛋蛋白白质质组组研研究的技术路线如下图：究的技术路线如下图：样品样品细胞、组织、体液细胞、组织、体液双向双向电泳电泳电

2、转印到膜上电转印到膜上图象分析，数据处理图象分析，数据处理胶上胶上原位酶切原位酶切直接直接1继续处理继续处理2继继续续处处理理3常规蛋白质组学研究技术常规蛋白质组学研究技术Edman降解降解氨基酸分析氨基酸分析N端序列端序列氨基酸组成氨基酸组成肽肽混合物混合物MALDI/TOF/MS肽质量指纹谱肽质量指纹谱数据库检索数据库检索ESI/MS/MS肽序列标签肽序列标签PSD/MALDI/TOF/MS32蛋白质鉴定蛋白质鉴定寡寡核苷酸合成核苷酸合成蛋白实验蛋白实验免疫组化免疫组化肽肽合成合成基因基因抗体抗体蛋白活力蛋白活力蛋白定位蛋白定位蛋白质组数据库蛋白质组数据库双向凝胶电泳一、双向凝胶电泳的原理

3、二、双向凝胶电泳技术操作的基本过程三、双向凝胶电泳过程中需要注意的问题（一）、双向凝胶电泳的原理等电聚焦（Isoelectric focusing,IEF）蛋白质是两性电解质 在等电聚焦中蛋白质总是向与其等电点相同的pH位置移动并停留在此位置上 等电点相同的蛋白质都聚焦在与等电点相同的pH位置上pH1pH14-pI+SDS-PAGE 十二烷基硫酸钠（SDS）是一种阴离子去污剂，带大量的负电荷 SDS与蛋白质结合，其所带负电荷大大超过蛋白质所带电荷量，消除了不同蛋白之间所带电荷的差异 SDS-PAGE中，蛋白质迁移率只与蛋白质的分子量有关 先根据蛋白质的等电点不同，利用等电聚焦进行第一向分离，将

4、等电点相同的蛋白质集中在与等电点相同的pH区 再以与等电聚焦成90度角的方向进行SDS-PAGE第二向分离，将等电点相同的蛋白质再按分子量大小彼此分开 以此将复杂蛋白混合物中的蛋白质在二维平面上以点的形状分离。蛋白质双向凝胶电泳是各种蛋白质分离分析方法中唯一能同时分辨上千个蛋白质点的技术 蛋白质组学研究中主要的分离技术二）、双向凝胶电泳技术操作的基本过程提取蛋白样品，进行样品的预处理进行第一向等电聚焦电泳等电聚焦后的胶条经过平衡转移到第二向凝胶上，与等电聚焦呈垂直方向进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳用银或考马斯亮蓝染色，经双向凝胶电泳图像分析软件进行凝胶图像分析 找出差异表达的蛋白质点细胞的破碎

5、cell disruption去除干扰物removal of interfering substances蛋白溶解 solubilization of the proteins离子，脂质，多糖，DNA，RNA，酚类等样品制备样品制备中遵循以下原则样品制备中遵循以下原则:样本制备步骤尽可能简单样本制备步骤尽可能简单,以避免不必要的蛋白质损失；以避免不必要的蛋白质损失；裂解细胞或组织的方法应尽可能减少蛋白酶解裂解细胞或组织的方法应尽可能减少蛋白酶解(proteolysis)或降解或降解(degradation);；避免反复冻融样本。避免反复冻融样本。样本于双向电泳前新鲜制备及溶解样本于双向电泳前新

6、鲜制备及溶解;去除样本中的脱氧核糖核酸去除样本中的脱氧核糖核酸(DNA),核糖核酸核糖核酸(RNA),脂脂质等；质等；在样本加入尿素后避免加热；在样本加入尿素后避免加热；蛋白质提取一般使用含有变性剂、表面活性剂、还原剂、蛋白质提取一般使用含有变性剂、表面活性剂、还原剂、固定固定pH 梯度缓冲液梯度缓冲液(IPG buffer)。提取的主要方法是对细胞、组织等样品进行破碎、溶解、提取的主要方法是对细胞、组织等样品进行破碎、溶解、失活或还原失活或还原,尽可能断开蛋白质间的连接键尽可能断开蛋白质间的连接键,再采用三氯再采用三氯乙酸与冷丙酮联用来沉淀提取全部蛋白质。乙酸与冷丙酮联用来沉淀提取全部蛋白质

7、。第一向：变性的等电聚焦电泳，根据蛋白质的等电点进行分离第二向：SDS 聚丙烯酰胺电泳，根据蛋白质分子量进行分离（三）、双向凝胶电泳过程中需要注意的问题1.双向凝胶电泳结果的可重复性蛋白质样品制备是关键 1）.尽可能地使蛋白质组中的各种蛋白质成分都溶解在裂解液中 2）.防止制备过程中蛋白成分的降解与修饰 3）.要保证蛋白质彻底变性 4）.取材要有重现性：用细胞 不用组织5）裂解液中需加：尿素断裂蛋白质的氢键和疏水键 还原剂破坏蛋白质中的二硫键 兼性离子去垢剂增加疏水性氨基酸残基的溶解性 6）整个制备过程需在低温环境中进行，在裂解液中加入蛋白酶抑制剂用固相pH梯度等电聚焦（IPG）防止阴极飘移，

8、pH 梯度不稳定 载体两性电解质在电场中依据其等电点形成pH梯度，这种pH梯度因阴极飘移而不稳定，缺少重现性。IPG中的pH梯度是凝胶聚合过程中通过酸性和碱性丙烯酰胺缓冲液形成的，是稳定的 双向电泳中的等电聚焦选用IPG2 凝胶中蛋白质的染色同位素 同位素是目前已知最灵敏的蛋白质染色方法 同位素是在细胞代谢过程中掺入蛋白质的，不同蛋白质掺入的同位素量不同，因此同位素强度不能代表蛋白质的实际丰度 同位素标记的蛋白质不能直接用于后续的鉴定实验 银染色 银染色是除同位素外最灵敏的染色方法 只需110ng蛋白质即可显示出条带。酸性的硝酸银染色法更适合酸性蛋白的染色，碱性的银氨染色法对碱性蛋白质的灵敏度

9、稍高 双向电泳的染色（银染）双向电泳的染色（银染）考马斯亮蓝染色 考马斯亮蓝R-250为三苯基甲烷，考马斯亮蓝G-250为二甲花青亮蓝 R-250比G-250的灵敏度稍高，100ng左右蛋白质即可显示出条带，G-250更适合染色小分子多肽 方法简便，是最常用的染色方法 脱色后的蛋白质样品可用于质谱分析等后续研究 双向电泳的染色（考马斯亮蓝染色）双向电泳的染色（考马斯亮蓝染色）非共价修饰的荧光染料 如Sypro red 和Sypro orange 灵敏度可与银染媲美 方法简单，一步染色，无需脱色 样品可直接用于序列测定和质谱分析锌、铜负染 凝胶背景为不透明的乳白色或青绿色，蛋白斑点则是透明的 灵

10、敏度介于银染和考马斯亮蓝染色之间 染色对后续分析的干扰较小 目前在蛋白质组研究中经常将两种染色方法结合使用 先经银染分析确定有意义的蛋白斑点，再加大上样量，重作电泳，用考马斯亮蓝染色 纯化的样品经脱色后进一步进行质谱鉴定 差异凝胶电泳（Differential gel electrophoresis）2、质谱仪的基本组成、质谱仪的基本组成1.气体扩散2.直接进样3.气相色谱1.电子轰击2.化学电离3.场致电离4.激光 1.单聚焦 2.双聚焦 3.飞行时间4.四极杆 质谱图意义质谱图意义A:离子的相对强度离子的相对强度(Y axis)B:离子的质量与电荷比离子的质量与电荷比(m/z,X axis

11、)C:质谱图中最强的峰称为基峰质谱图中最强的峰称为基峰(base peak)D:相对于特定的检测器时称为峰的绝对强度相对于特定的检测器时称为峰的绝对强度E:所有质谱峰对应的是离子电信号强度和离子应在所有质谱峰对应的是离子电信号强度和离子应在m/z位置而非真实的离子强度和离子位置而非真实的离子强度和离子.F:棒状谱棒状谱(centroidal peak)G:高斯峰高斯峰(gauss peak)基基质辅质辅助激光解吸助激光解吸电电离离飞飞行行时间质谱时间质谱 （MALDI-TOF)MALDI-TOF)（1）主要技术主要技术基质辅助激光解吸电离基质辅助激光解吸电离(Matrix-assisted l

12、aser desorption/ionization,MALDI)技术线线性性飞飞行行时间质时间质量量检测检测器器(time of flighttime of flight，TOF)TOF)MALDI原理：将将分分析析物物分分散散在在基基质质分分子子(尼尼古古丁丁酸酸及及其其同同系系物物)中中并并形形成成晶晶体体，当当用用激激光光(337nm的的氮氮激激光光)照照射射晶晶体体时时，基基质质分分子子吸吸收收激激光光能能量量，样样品品解解吸吸附附，基基质质样样品品之之间间发发生生电电荷荷转转移移使使样样品品分分子子电电离离。基基质质的的使使用用是是这这一一电电离离技技术术的的关关键键，基基质质吸吸

13、收收了了激激光光的的大大部部分分能能量量并并气气化化，同同时时将将样样品品分分子子带带入入气气相相，样样品品分分子子只只吸吸收收少少量量激激光光能能量量，避避免免了了分分子子化化学学键键的的断断裂裂。基基质质在在样样品品离离子子形形成成过过程程中中充充当当了了质质子化或去子化或去质质子化子化试剂试剂，使，使样样品分子品分子带带上上正正电电荷或荷或负电负电荷荷。TOFTOF原理原理u离离子子源源中中每每一一脉脉冲冲激激光光产产生生的的离离子子先先经经过过一一个个加加速速电电场场，获获得得动动能能，再再进进入入一一个个高高真真空空无无电电场场飞飞行行管管道道离离子子在在此此无无电电场场飞飞行行管管

14、道道内内以以在在加加速速电电场场获获得得的的速速度度飞飞行行。质质量量较较轻轻的的离离子子飞飞行行速速度度快快，较较早早到到达达检检测测器器，较较重重的的离离子子飞飞行行速速度度慢慢，较较晚晚到到达达检检测测器器，离离子子的的飞飞行行时时间间与与其其质质荷荷比比的的平平方方根根(mz)成成正正比比，通通过过检检测测飞飞行行时时间间来来测测定离子的定离子的质质荷比。荷比。酵母双杂交技术酵母双杂交技术一、酵母双杂交系统的原理一、酵母双杂交系统的原理二、酵母双杂交系统的操作程序二、酵母双杂交系统的操作程序三、酵母双杂交系统的应用三、酵母双杂交系统的应用四、酵母双杂交系统的局限与发展四、酵母双杂交系统

15、的局限与发展酵母双杂交系统（酵母双杂交系统（Yeast two-hybrid system）也叫相互作用陷阱（也叫相互作用陷阱（Interaction trap）由由Fields和和Song于于1989年建立年建立 用于研究用于研究细胞内细胞内蛋白质与蛋白质间的相蛋白质与蛋白质间的相互作用。互作用。（一）、酵母双杂交技术原理酵母双杂交系统的建立基于对真核生物转录激活因子结构与功能的认识 真核生物转录激活因子真核生物转录激活因子DNA结合结构域结合结构域 转录激活结构域转录激活结构域BDAD组件式：结构可互相分开组件式：结构可互相分开 功能互相独立功能互相独立 空间较近时表现活性空间较近时表现活

16、性 中间序列对活性无影响中间序列对活性无影响酵母转录因子酵母转录因子GAL4N端端C端端147AA213AABDADLexA蛋白蛋白 单纯疱疹病毒的单纯疱疹病毒的VP编码区编码区 BDAD大肠杆菌的大肠杆菌的LexA蛋白蛋白 选择酵母细胞作为双杂交系统的宿主菌株：1.酵母细胞具有翻译后加工功能 2.酵母细胞有很多的营养缺陷型标记，筛选阳性克隆比较方便、容易。3.酵母细胞有性生殖形成二倍体细胞，转化容易，转化率高 构建两种可在大肠杆菌和酵母细胞中复制的穿梭质粒载体 1.Ampr基因基因-大肠杆菌筛大肠杆菌筛选标记选标记 2.Trp、Leu-酵母筛选标酵母筛选标记记3.X与与BD以融合蛋白形以融合

17、蛋白形式表达，式表达，Y与与AD以融合以融合蛋白表达蛋白表达报告基因 在GAL4结合的顺式作用元件下游需连接报告基因。目前应用最多的报告基因是LacZ基因，表达后能在X-Gal培养基上产生蓝色菌落。其次是His基因，表达后能使酵母菌在缺少组氨酸的培养基中生长。现在多提倡两种报告基因同时应用，颜色筛选和营养缺陷筛选同时进行，以降低假阳性的出现 酵母双杂交原理示意图酵母双杂交原理示意图（二）、酵母双杂交系统的操作程序1.构建X蛋白表达质粒 将X蛋白基因与BD质粒重组，转化大肠杆菌，用Amp抗性标记筛选阳性克隆，测序验证，并通过SDS-PAGE和Western Blotting检测融合蛋白。2.构建

18、Y蛋白表达质粒或预转文库 如Y蛋白是已知蛋白，则将Y蛋白基因与AD质粒重组。如Y蛋白是未知蛋白，则需用AD质粒构建cDNA文库。要求文库含有足够的转化子，数量在107以上，保证文库内含有研究者所感兴趣的蛋白。3.从大肠杆菌中提取两种重组质粒共转化酵母细胞 在缺少Trp、Leu和His,含有X-gal的培养基上筛选 在此培养基上生长的蓝色菌落证明X蛋白和Y蛋白能互相作用。酵母的接合型 a接合型接合型 接合型接合型 单倍体单倍体 二倍体二倍体 单倍体单倍体DNA-BD载体载体 DNA-AD载体载体转化转化转化转化 a接合型酵母接合型酵母 接合型酵母接合型酵母Trp、Leu、HisTrp筛选筛选X和

19、和Y蛋白相互作用蛋白相互作用Y基因与基因与DNA-AD质粒重组质粒重组分别转化大肠杆菌分别转化大肠杆菌X-BD重组质粒重组质粒Y-AD重组质粒重组质粒共转化酵母细胞共转化酵母细胞Trp和和Leu营养缺陷培养基营养缺陷培养基Trp、Leu、His营养缺陷培养基营养缺陷培养基X-gal蓝色菌落蓝色菌落X和和Y蛋白相互作用蛋白相互作用无菌落生长无菌落生长X和和Y蛋白间无作用蛋白间无作用Amp培养基培养基X基因与基因与DNA-BD质粒重组质粒重组（三）、酵母双杂交系统的应用1.检测两种已知蛋白质之间在体内是否存在相互作用.这是酵母双杂交系统最基本用途 将两种已知蛋白质的编码基因分别克隆到BD载体和AD

20、载体上，共同转染酵母细胞。若报告基因得到表达，则证明两种蛋白质之间在细胞内存在相互作用。2.筛选与已知蛋白质相互作用的新的蛋白质。这是酵母双杂交技术最广泛，最有价值的用途 将已知蛋白质基因克隆在BD载体上，将要筛选的 cDNA库克隆在AD载体上，据此可从cDNA库中筛选出能与已知蛋白质相互作用的新蛋白质。3.确定蛋白质之间相互作用的结构域或活性区 将一个蛋白质突变或缺失掉不同的片段，再检测两种蛋白质在双杂交系统中还能否保持转录激活作用，从而确定蛋白之间相互作用的结构域或活性区。4.筛选多肽类新药筛选多肽类新药 将药物作用的靶蛋白基因克隆在将药物作用的靶蛋白基因克隆在BD载载体上，待筛选的多肽药

21、物基因克隆在体上，待筛选的多肽药物基因克隆在AD载载体上，从中筛选作用于靶蛋白的多肽类新体上，从中筛选作用于靶蛋白的多肽类新药药5.绘制蛋白质相互作用网络或图谱 双杂交系统的BD及AD质粒均接上cDNA库，让它们随机表达蛋白 通过检测报告基因的表达可以证实一系列崭新蛋白中两两间的相互作用 如能证实在蛋白质A-B、B-C和C-D间都存在相互作用，据此可绘制出ABCD的蛋白间联系图谱（四）、酵母双杂交系统的局限与发展酵母双杂交系统局限性酵母双杂交系统局限性1.某些诱饵蛋白具有自身激活性质某些诱饵蛋白具有自身激活性质。2.-双杂交前删除该部分，但应避免删除相双杂交前删除该部分，但应避免删除相互作用的

22、结构域互作用的结构域2.某些蛋白在酵母中某些蛋白在酵母中不稳定表达或不能准确定位不稳定表达或不能准确定位到到胞核内。在细胞表面发生的相互作用可采用胞核内。在细胞表面发生的相互作用可采用噬菌噬菌体显示系统体显示系统。3.双杂交系统分析蛋白间的相互作用定位于细双杂交系统分析蛋白间的相互作用定位于细胞核内，而许多蛋白间的相互作用依赖于翻译后胞核内，而许多蛋白间的相互作用依赖于翻译后加工如糖基化、二硫键形成等，加工如糖基化、二硫键形成等，这些反应在核内这些反应在核内无法进行。无法进行。有时有时DNA-BD或或AD融合部分不包括相互作用位融合部分不包括相互作用位点，或破坏了融合蛋白的正确折叠。点，或破坏

23、了融合蛋白的正确折叠。4.哺乳动物蛋白之间相互作用有时要求正确的哺乳动物蛋白之间相互作用有时要求正确的折叠和翻译后修饰，而酵母细胞不能提供这样的折叠和翻译后修饰，而酵母细胞不能提供这样的环境。这限制了某些细胞外蛋白和细胞膜受体蛋环境。这限制了某些细胞外蛋白和细胞膜受体蛋白等的研究白等的研究 阳性克隆必须进行体外翻译和表达，用抗阳性克隆必须进行体外翻译和表达，用抗原表位特异性的抗体进行共定位研究。原表位特异性的抗体进行共定位研究。双杂交系统的得到的阳性结果一定要通过双杂交系统的得到的阳性结果一定要通过其它的实验手段来验证。其它的实验手段来验证。1.细菌双杂交系统 直接在细胞质内研究蛋白之间相互作

24、用，适用于不能进入细胞核的蛋白质。百日咳博代杆菌中腺苷酸环化酶催化结构域可分为T18和T25两个相对独立的功能单位 3.单杂交系统单杂交系统 用于研究蛋白质与用于研究蛋白质与DNA的相互作用的相互作用 检测蛋白质能否和检测蛋白质能否和DNA结合结合 筛选能和筛选能和DNA结合的蛋白质结合的蛋白质 只用双杂交系统中的DNA-AD质粒，不用DNA-BD质粒，故称为单杂交系统 待研究的蛋白质可看作双杂交系统中GAL4的BD结构域 将待研究蛋白质基因与DNA-AD质粒重组，以融合形式表达AD-蛋白质 重组质粒转入酵母细胞 酵母单杂交原理示意图酵母单杂交原理示意图 4.反向双杂交系统 鉴定导致蛋白质不能

25、相互作用的突变 鉴定能破坏蛋白质相互作用的因子采用反式选择性报告基因采用反式选择性报告基因 Ure3基因编码的酶催化嘧啶类似物基因编码的酶催化嘧啶类似物5-氟氟清酸转化成细胞毒性物质，使细胞死亡清酸转化成细胞毒性物质，使细胞死亡 两种蛋白质能相互作用，两种蛋白质能相互作用，Ure3基因表达，基因表达，细胞死亡细胞死亡 两种蛋白质不能相互作用，两种蛋白质不能相互作用，Ure3基因不基因不能表达，细胞得以生长能表达，细胞得以生长5.三杂交系统 研究蛋白质与RNA的相互作用 X为能与RNA特异结合的蛋白质，其基因与DNA-BD质粒重组，表达BD-X融合蛋白 待研究蛋白Y基因与DNA-AD质粒重组，表达AD-Y融合蛋白 另有质粒转录特定的RN 三种质粒同时转入酵母细胞酵母三杂交原理示意图酵母三杂交原理示意图 三杂交系统中有三个杂交体 BD-X和AD-Y两个融合蛋白不能直接作用，必须通过与RNA结合，间接地激活报告基因 BD-X的X蛋白必有与RNA结合的结构域 检测的是Y蛋白和RNA间有没有作用RNA可以换成蛋白质、小分子多肽、有机配体等 扩展三杂交系统的应用范围