基因的克隆方法大全.ppt
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1、第三章第三章基因的克隆方法基因的克隆方法前言前言 基因基因是生物染色体上的是生物染色体上的一段一段DNADNA序列序列,具有转录、翻译成某种蛋白质,具有转录、翻译成某种蛋白质调控生物生命活动的功能。调控生物生命活动的功能。2基基因因的的表表达达过过程程mRNAmRNA翻译成翻译成翻译成翻译成蛋白质蛋白质蛋白质蛋白质基因组基因组基因组基因组DNADNA3 3如何获得基因?如何获得基因?即基因的克隆方法即基因的克隆方法 基于基于基因产物基因产物的基因克隆方法的基因克隆方法 基于基于基因加标签基因加标签的基因克隆方法的基因克隆方法 基于基于基因序列基因序列的基因克隆方法的基因克隆方法 基于基于基因图
2、谱基因图谱的基因克隆方法的基因克隆方法4一、一、基于基因产物的基因克隆方法基于基因产物的基因克隆方法mRNAmRNA翻译成翻译成翻译成翻译成蛋白质蛋白质蛋白质蛋白质1 1、根据、根据蛋白质序列蛋白质序列克隆目的基因克隆目的基因2 2、根据、根据基因表达差异(基因表达差异(mRNAmRNA)克隆基因克隆基因5 原理:根据蛋白质上的一段多原理:根据蛋白质上的一段多肽的氨基酸序列,反推核苷酸序列,肽的氨基酸序列,反推核苷酸序列,然后设计探针或引物从基因组文库然后设计探针或引物从基因组文库或或cDNAcDNA文库中分离出相应的基因。文库中分离出相应的基因。1 1、蛋白质序列克隆法、蛋白质序列克隆法6实
3、用性:实用性:分离纯化蛋白质十分困难CysCys Met Asp Met Asp GluGlu Met Met LysLys ArgArg AsnAsn IleIleTGTTGTATGATGGACGACGAAGAAATGATGAAAAAAAGAAGAAACAACATAATA C C T T G GATGATG G G G G T T T T C C据某段氨基酸序列推导可能的核苷酸序列据某段氨基酸序列推导可能的核苷酸序列注意!注意!密码子密码子有简并有简并性现象!性现象!72 2、根据基因表达差异(、根据基因表达差异(mRNAmRNA)克隆基因)克隆基因基因表达的差异表现:基因表达的差异表现:一
4、是基因表达的种类的不同;一是基因表达的种类的不同;二是基因表达水平的改变。二是基因表达水平的改变。8 差减杂交(差减杂交(SHSH)抑制性差减杂交抑制性差减杂交(SSHSSH)差异显示差异显示PCRPCR(DD RT-PCRDD RT-PCR)DNADNA代表性差异分析代表性差异分析(DNA RDADNA RDA)扩增限制性片段长度多样性(扩增限制性片段长度多样性(AFLPAFLP)cDNAcDNA微阵列微阵列已发展的相应基因克隆方法:已发展的相应基因克隆方法:9 差减杂交(差减杂交(SHSH)n最早由最早由Lamar和和Palmer于于1984年提出并年提出并用于雄鼠用于雄鼠Y染色体的染色体
5、的DNA研究。研究。超声波超声波打断雌鼠打断雌鼠的的DNA(过量过量100倍)倍)(XX)MboI完全消化雄鼠完全消化雄鼠的的DNA(XY)变性、复性变性、复性去除共有序列去除共有序列BamHI酶切酶切表达载体表达载体连接、转化、测序分析连接、转化、测序分析缺点:技术要求高,耗时,工作量大缺点:技术要求高,耗时,工作量大NO.1NO.2NO.310SH在mRNA研究上的应用机理:!不足之处:重复性差,灵敏度低,回收的cDNA量有限。特异表达基因特异表达基因的样本(的样本(TS)无特异表达基因的无特异表达基因的无特异表达基因的无特异表达基因的样本(样本(样本(样本(RSRS)提取mRNA提取mR
6、NAcDNAcDNA转录转录过量杂交TS的CDNA纯化、富集、扩增去除过量的RS的cDNA及杂交分子11 基因突变体的研究:如基因的表达与不表达;基因时空表达的研究:如根、茎、叶;不同处理条件下的基因表达差异:如施肥与不施肥、光照与不光照。差减杂交技术的应用方面差减杂交技术的应用方面:121.2.2 抑制性差减杂交(抑制性差减杂交(SSH)Tester样本样本mRNADriver样本样本mRNASfiI AcDNAcDNASfiI BAB混合,变性杂交混合,变性杂交过量ABPCR扩增扩增5313应用应用基因突变体的研究:如基因的表达与不基因突变体的研究:如基因的表达与不表达表达基因时空表达的研
7、究:如根、茎、叶基因时空表达的研究:如根、茎、叶不同处理条件下的基因表达差异:如施不同处理条件下的基因表达差异:如施肥与不施肥、光照与不光照肥与不施肥、光照与不光照141.2.3 差异显示差异显示PCR(DD RT-PCR)最先由最先由Liang等于等于1992年报道,目前已广泛在年报道,目前已广泛在实验室使用。实验室使用。主要原理:利用真核生物主要原理:利用真核生物mRNA结尾处有结尾处有POLY(A)结构,在其结构,在其3端设计象端设计象5-T11GA样引物,该引物可样引物,该引物可与与mRNA总数的十二分之总数的十二分之一结合,从而使这部分基因得到逆转录,同一结合,从而使这部分基因得到逆
8、转录,同时结合时结合5端的随机引物(端的随机引物(20条条10-mer),),可可以使不同长度的基因得到扩增。以使不同长度的基因得到扩增。53AAAAAAAAATGCAGCTTTTTTTTTTRPmRNA1553AAAAAAAAATGCAGCTTTTTTTTTTRPmRNAAATTTTTTTTACTTTTTTTTAGTTTTTTTTTATTTTTTTTTCTTTTTTTTTGTTTTTTTTCATTTTTTTTCCTTTTTTTTCGTTTTTTTTGATTTTTTTTGCTTTTTTTTGGTTTTTTTT1617具体操作:具体操作:1、提取、提取mRNA;2、特定引物(、特定引物(12分之
9、一)反转录;分之一)反转录;3、特定引物和、特定引物和RP结合结合RT-PCR;4、把不同处理的样品扩增产物按引物组合、把不同处理的样品扩增产物按引物组合分别进行电泳比较分别进行电泳比较DNA带,从而找出差别带,从而找出差别DNA。18缺点:缺点:假阳性条带多,对低丰度的基因表达不容假阳性条带多,对低丰度的基因表达不容易检测。易检测。工作量大。工作量大。无法定量研究。无法定量研究。扩出的条带往往是扩出的条带往往是3端比较短的端比较短的UTR区的一区的一段序列,提供的信息较少。段序列,提供的信息较少。19优点:优点:简便、灵敏、高效、省时,能快速显示简便、灵敏、高效、省时,能快速显示mRNA的组
10、成。的组成。所需的所需的mRNA量量少。少。各样本各样本mRNA的差异可同时进行比较。的差异可同时进行比较。扩出的扩出的cDNA可直接用于测序、文库筛选等。可直接用于测序、文库筛选等。20二、基于基因加标签的基因克隆二、基于基因加标签的基因克隆方法方法原理:主要是在生物基因组中原理:主要是在生物基因组中插入插入外源的一段外源的一段DNA,使生物体产生使生物体产生某种突变表型,然后反过来利用这某种突变表型,然后反过来利用这段外源已知的段外源已知的DNA片段来克隆基片段来克隆基因的方法。因的方法。21外源外源DNA基因组染色体基因组染色体DNA基因基因A产生突变型产生突变型 分类:分类:T-DNA
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