基因工程第三组核算的提取PPT讲稿.ppt

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1、基因工程第三组核算的提取第1页，共54页，编辑于2022年，星期六提纲p前言前言pDNA提取提取DNA提取的原则DNA提取的方法pRNA提取提取RNA提取相关知识RNA提取方法及注意事项pDNA和和RNA提取常见问题分析提取常见问题分析p核酸提取方法在不同材料中的改进核酸提取方法在不同材料中的改进第2页，共54页，编辑于2022年，星期六前言n核酸包括DNA、RNA两种分子，在细胞中都以与蛋白质结合的状态存在。真核生物的染色体DNA为双链线性分子，原核生物的染色体DNA、质粒及真核细胞器DNA为双链环状分子；有些噬菌体DNA为单链环状分子；n大多数生物体内RNA分子均为单链线性分子并具有不同的

2、结构特点，如真核生物mRNA分子多数在3端带有polyA结构。第3页，共54页，编辑于2022年，星期六DNA提取nDNA提取的原则保证DNA一级结构的完整性完整的一级结构是保证核酸结构与功能研究的最基本要求排除其它分子的污染RNA、蛋白质、多糖等第4页，共54页，编辑于2022年，星期六DNA纯化要求n核酸样品中不存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；n其它生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应降到最低程度；n排除其它核酸分子的污染，如提取DNA分子时应去除RNA，反之亦然.第5页，共54页，编辑于2022年，星期六DNA提取的方法n基因组DNA的提取nCTAB法nSDS法n

3、质粒DNA的提取n碱裂解法n煮沸法n线粒体、叶绿体DNA的提取n差速离心结合SDS裂解法第6页，共54页，编辑于2022年，星期六基因组DNA提取主要方法nCTAB法适用于植物组织，真菌等nSDS法适用于动物组织，血液，细胞，细菌，酵母等第7页，共54页，编辑于2022年，星期六CTAB法(植物DNA提取经典法)n原理原理nCTAB（hexadecyltrimethylammoniumbromide，十六烷基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物。n该复合物在高盐溶液中（0.7mol/LNaCl）是可溶的，通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀

4、即可使核酸分离出来。注：CTAB溶液在低于15时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15。第8页，共54页，编辑于2022年，星期六基因组DNACTAB法nTrisHC（pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；nEDTA螯合Mg2+或Mn2+离子抑制DNase活性；nNaCl提供一个高盐环境使DNP充分溶解，存在于液相中；nCTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；n巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除组份TrisHCl（pH8.0）EDTA（pH8.0）NaClCTAB巯基乙醇终浓度100mM20mM1.4M2

5、%(W/V)0.1%（V/V）使用前加入CTABCTAB提取缓冲液的经典配方第9页，共54页，编辑于2022年，星期六基因组DNACTAB法nCTAB提取缓冲液的改进配方组份TrisHCl（pH8.0）EDTA（pH8.0）NaClCTABPVP40巯基乙醇终浓度100mM20mM1.4M2%(W/V)5%(W/V)0.1%（V/V）使用前加入PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。第10页，共54页，编辑于2022年，星期六CTAB法流程图植物材料液氮研磨细胞裂解细胞裂解裂解液抽提抽提上层溶液

6、酒精沉淀酒精沉淀离心洗涤离心洗涤干燥溶解干燥溶解DNA溶液第11页，共54页，编辑于2022年，星期六SDS法n原理原理nSDS阴离子去垢剂n核酸本身带负电荷，结合带正电荷的蛋白质。用于核酸提取的去垢剂，一般都是阴离子去垢剂。n溶解膜蛋白及脂肪，使细胞膜破裂；n溶解核糖体上面的蛋白质，使其解聚，将核酸释放出来；n对DNase、RNase有一定的抑制作用。n高盐(KAc或NH4Ac)或降低温度（冰浴）n使蛋白质及多糖杂质沉淀n上清液中的DNA用酚/氯仿抽提乙醇沉淀水相中的DNA第12页，共54页，编辑于2022年，星期六SDS提取缓冲液的配方组份TrisHCl（pH8.0）EDTA（pH8.0）

7、NaClSDS终浓度100mM20mM1.4M2%(W/V)TrisHCl（pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性；NaCl提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液相中；SDS裂解细胞，使蛋白变性，染色体离析；第13页，共54页，编辑于2022年，星期六SDS法流程图动物组织细胞组织匀浆细胞裂解细胞裂解裂解液抽提抽提上层溶液酒精沉淀酒精沉淀离心洗涤离心洗涤干燥溶解干燥溶解DNA溶液第14页，共54页，编辑于2022年，星期六基因组DNA其它裂解方法n根据细胞裂解方式的不同有：物理方式：玻璃珠、超声波、研磨、冻融化学方式：异硫氰酸

8、胍、碱裂解生物方式：酶法第15页，共54页，编辑于2022年，星期六基因组DNA纯化的方法n吸附材料结合法：吸附材料 纯化原理硅质材料 高盐低pH值结合核酸低盐高pH值洗脱阴离子交换树脂低盐高pH值结合核酸高盐低pH值洗脱磁珠磁性微粒挂上不同基团可吸附不同的目的物，从而达到分离目的第16页，共54页，编辑于2022年，星期六质粒DNA提取p碱裂解法碱裂解法p煮沸法煮沸法第17页，共54页，编辑于2022年，星期六碱裂解法原理染色体DNA比质粒DNA分子大得多，且染色体DNA为线状分子，而质粒DNA为共价闭合环状分子当用碱处理DNA溶液时，线状染色体DNA容易发生变性，共价闭环的质粒DNA在回到

9、中性pH时即恢复其天然构象；变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀，而复性的超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在液相中，从而可通过离心将两者分开。第18页，共54页，编辑于2022年，星期六碱裂解法流程图对数期菌体溶液I充分重悬溶液溶液II II裂解裂解上清液抽提抽提上层溶液酒精沉淀酒精沉淀离心洗涤离心洗涤干燥溶解干燥溶解DNA溶液溶液IIIIII中和第19页，共54页，编辑于2022年，星期六细胞器DNA提取线粒体叶绿体p差速离心法原理是利用物质比重的不同分离混合物的一种方法。将待分离物质置于均匀介质（蔗糖）中，以一定的转速进行离心，比重大的物质优先沉降，比重小的却处于上层，

10、从而得以分离。第20页，共54页，编辑于2022年，星期六DNA提取基本步骤基因组DNA新鲜材料，低温保存血液基因组DNA提取选择有核细胞细胞培养时间不能过长含病毒的液体材料提取前先富集质粒DNA对数期的菌体培养时应加入筛选压力低拷贝或大质粒，应加大菌体用量菌株不要频繁转接（质粒丢失）材料准备细胞裂解核酸分离纯化核酸溶解保存核酸沉淀第21页，共54页，编辑于2022年，星期六基因组DNA材料过多影响裂解，导致DNA量少，纯度低针对不同材料，选择适当的裂解预处理方式：植物材料液氮研磨动物组织匀浆或液氮研磨组培细胞蛋白酶K细菌溶菌酶破壁酵母破壁酶或玻璃珠质粒DNA菌体量适当，除净培养基变性的时间不

11、要过长（5分钟）控制复性时间，避免基因组DNA的污染G菌、酵母细胞酶或机械处理材料准备细胞裂解核酸分离纯化核酸溶解保存DNA提取基本步骤核酸沉淀第22页，共54页，编辑于2022年，星期六DNA提取基本步骤采用吸附材料吸附分离DNA，应提供相应的缓冲体系采用有机溶剂（酚/氯仿）抽提时应充分而轻柔的混匀离心分离两相时，应保证一定的转速和时间针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相应的去杂质的方法材料准备细胞裂解核酸分离纯化核酸溶解保存核酸沉淀第23页，共54页，编辑于2022年，星期六DNA提取基本步骤蛋白质的去除：酚/氯仿抽提使用变性剂（SDS、异硫氰酸胍等）蛋白酶处理材料准备细胞裂解核酸分离纯

12、化核酸溶解保存核酸沉淀第24页，共54页，编辑于2022年，星期六DNA提取基本步骤多糖的去除：多糖水解酶在提取缓冲液中加1/2体积氯苯，氯苯可以与多糖的羟基作用，从而去除多糖。用PEG8000代 替乙醇沉淀DNA：在500 LDNA液 中加入200l 20%PEG8000(含1.2MNaCl)，冰浴20min。材料准备细胞裂解核酸分离纯化核酸溶解保存核酸沉淀第25页，共54页，编辑于2022年，星期六DNA提取基本步骤多酚的去除：加入还原剂：巯基乙醇、抗坏血酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇等加入易与酚类结合的试剂：如PVP、PEG，可防止酚类与DNA的结合盐离子的去除：70的乙醇洗涤材料准备细胞裂解

13、核酸分离纯化核酸沉淀核酸溶解保存第26页，共54页，编辑于2022年，星期六DNA提取基本步骤预冷的乙醇或异丙醇更充分沉淀加入1/10体积的NaAc（pH5.2，3M）更充分沉淀晾干DNA，让乙醇充分挥发材料准备细胞裂解核酸分离纯化核酸溶解保存若长期储存建议使用TE缓冲液溶解pH值为8.0，可防止DNA发生酸解核酸沉淀第27页，共54页，编辑于2022年，星期六分离核酸注意事项分离核酸注意事项n温度不要过高，高温如长时间煮沸，除水沸腾带来的剪切力外，高温本身对核酸分子中的有些化学键也有破坏作用。n控制PH范围（PH4到10）n保持一定离子强度n减少物理因素对核酸的机械剪切力n防止核酸的生物降解

14、n细胞内或外来的各种核酸酶消化核酸链中的磷酸二酯键，直接破坏核酸的一级结构n所用器械和一些试剂需要高温灭菌，提取缓冲液中需加入核酸酶抑制剂第28页，共54页，编辑于2022年，星期六RNA提取及常见问题分析第29页，共54页，编辑于2022年，星期六RNA提取及常见问题分析nRNA提取相关知识nRNA提取方法及注意事项nRNA提取常见问题分析第30页，共54页，编辑于2022年，星期六细胞中RNA的含量n107个细胞10g30mg动物组织30100mg植物组织nrRNA占8085%nmRNA占15%第31页，共54页，编辑于2022年，星期六mRNA的应用nRTPCR,Northern杂交,c

15、DNA文库构建nmRNA末端快速扩增(RACE),差异表达(DDRTPCR),引物延伸反应,体外转录RNA标记,RNA酶保护试验,RNA微注射(RNAMicroinjection)第32页，共54页，编辑于2022年，星期六RNA的不稳定性n内因内因:核糖残基的2和3位置带有羟基,易被水解n外因外因:内源、外源RNA酶含量丰富,加热后仍能够正确折叠恢复活性,不易失活第33页，共54页，编辑于2022年，星期六提取RNA的注意事项n经常更换新手套。皮肤和实验室用品上可能有RNase,会导致RNase污染n塑料器皿可用0.1%DEPC水浸泡410小时,再灭菌n玻璃器皿可在180烘烤4小时n塑料制品

16、和枪头避免交叉污染第34页，共54页，编辑于2022年，星期六常用的RNA酶抑制剂n焦碳酸二乙酯焦碳酸二乙酯(DEPC)与RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性,强烈但不彻底的RNA酶抑制剂n异硫氰酸胍异硫氰酸胍目前是最有效的RNA酶抑制剂,裂解组织的同时也使RNA酶失活。第35页，共54页，编辑于2022年，星期六常用的RNA酶抑制剂nRNasin从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。可以和多种RNA酶结合,使其失活n氧钒核糖核苷复合物氧钒核糖核苷复合物由氧化钒离子和核苷形成的复合物,它和RNA酶结合形成过渡态类物质,几乎能完全抑制RNA酶的活性nSDS、尿素、硅藻土等、尿素、硅

17、藻土等第36页，共54页，编辑于2022年，星期六RNA提取流程示意图研磨或匀浆动植物材料细胞裂解加入裂解液(TRNzol)氯仿离心水相有机相PH5.7RNA基因组DNA纯化第37页，共54页，编辑于2022年，星期六RNA提取流程示意图等体积异丙醇沉淀70%乙醇洗涤沉淀晾干溶解RNA吸附柱去蛋白液漂洗洗脱传统方法:有机溶剂抽提,得率高柱纯化法:纯度高,无有机溶剂水相RNA第38页，共54页，编辑于2022年，星期六RNA提取基本步骤材料准备TRNzol裂解细胞加入氯仿抽提RNA沉淀柱纯化RNA溶解保存植物组织选取杂质少生长较快的幼嫩部培养细胞除尽培养液消化系统的组织选取杂质少的部位细菌和酵母

18、需要破壁处理样品切成小块投入液氮或专门的RNA样品储存液中保存液氮研磨时不要使液氮挥发净第39页，共54页，编辑于2022年，星期六RNA提取基本步骤异硫氰酸胍、酚(TRNzol)裂解细胞灭活RNaseTRNzol要与细胞组织充分接触裂解尽量充分材料准备TRNzol裂解细胞加入氯仿抽提RNA沉淀柱纯化RNA溶解保存第40页，共54页，编辑于2022年，星期六RNA提取基本步骤材料准备TRNzol裂解细胞加入氯仿抽提RNA沉淀柱纯化RNA溶解保存氯仿抽提时充分混匀离心分离两相,保证一定的转速和时间,使蛋白质、多糖和DNA分布到有机相和中间层,RNA留在水相中注意避免吸入中间层不慎吸入再次用有机溶

19、剂抽提第41页，共54页，编辑于2022年，星期六RNA提取基本步骤材料准备TRNzol裂解细胞加入氯仿抽提RNA沉淀柱纯化RNA溶解保存异丙醇低温沉淀RNA高盐低pH值,核酸与硅胶膜结合70%乙醇洗涤,晾干用经DEPC处理过的水或专门的试剂来洗脱或溶解RNA70分装保存或加入RNase抑制剂(RNAsafe)第42页，共54页，编辑于2022年，星期六DNA和和RNA提取常见问题提取常见问题及注意事项及注意事项第43页，共54页，编辑于2022年，星期六问题一：DNA降解1.材料不新鲜、反复冻融或细胞衰老2.提取操作过于剧烈，DNA被打断3.外源核酸酶污染1.低温保存，避免反复冻融。2.液氮

20、研磨或匀浆组织，应在解冻前加入裂解缓冲液3.增加裂解液中螯合剂的含量4.细胞裂解后操作应尽量轻柔5.试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌6.DNA分装保存于缓冲液，避免反复冻融第44页，共54页，编辑于2022年，星期六问题二：DNA样品不纯1.DNA中含有蛋白、多糖、多酚类杂质2.DNA在溶解前，有酒精残留，酒精抑制后续酶解反应3.DNA中残留有金属离子1.重新纯化DNA，去除蛋白、多糖、多酚等杂质（具体方法见前）2.重新沉淀DNA，让酒精充分挥发3.增加70乙醇洗涤的次数（23次）第45页，共54页，编辑于2022年，星期六问题三：DNA提取量少1.实验材料不佳或量少2.破壁或裂解不充分3.沉

21、淀不完全4.洗涤时DNA丢失1.尽量选用新鲜（幼嫩）的材料2.动植物要匀浆研磨充分；G菌、酵母裂解前先用生物酶或机械方式破壁3.高温裂解时，时间适当延长（对于动物细胞、细菌可增加PK的用量）4.低温沉淀，延长沉淀时间5.加辅助物，促进沉淀6.洗涤时，最好用枪头将洗涤液吸出，勿倾倒第46页，共54页，编辑于2022年，星期六RNA提取常见问题一：样品不纯1.蛋白2.多糖多酚3.DNA4.离子1.保证彻底的裂解和一定转数一定时间的离心2.增加有机溶剂抽提的次数，用吸附柱纯化3.减少处理样品的量4.加入不含RNase的DNase处理；再次纯化第47页，共54页，编辑于2022年，星期六RNA提取常见

22、问题二：得率低1.样品太多或太少2.RNA在柱子上未洗出3.洗出液中有酒精1.减少或增加样品使用量2.加入RNaseFree,放置几分钟再离心3.漂洗后再次离心第48页，共54页，编辑于2022年，星期六RNA提取常见问题三：降解1.样品不新鲜或保存不当2.RNase污染3.RNA溶液储存不当1.取新鲜的样品；取样后立即放入液氮或储存液保存2.研磨样品及时补充液氮3.严格处理相应的器具和试剂4.70冻存，分装使用第49页，共54页，编辑于2022年，星期六核酸提取方法在不同核酸提取方法在不同材料中的改进材料中的改进第50页，共54页，编辑于2022年，星期六核酸提取方法在不同材料中的改进对于不

23、同的材料相对应的改进方法不同，我们简要为大家介绍几种：n可以采用不同氯化钠浓度比差别法来抽提DNA蛋白,得到一个较为理想的氯化钠浓度（不同植物所需浓度不同）;用SDS处理材料后再用氯仿-异戊醇抽提除去蛋白质，并且用十二烷基硫酸钠代替十二烷基磺酸钠配制SDS能够更方便、易配；加入乙醇脱水析出DNA时，则通过用旋转法作顺时针摇动析出DNA代替用滴泵反复吸乙醇析出的DNA,使脱水析出的丝状DNA能顺着势能相互缠绕成团析出,确保丝状DNA分子不被人为断裂。第51页，共54页，编辑于2022年，星期六核酸提取方法在不同材料中的改进p在葡萄总DNA的提取方法改进中，党尉,尉亚辉等以葡萄幼叶为材料,分别采用

24、溴化十六烷基三甲基铵(CTAB)法、高盐低pH法、简易法、高盐沉淀法和改良十二烷基硫酸钠(SDS)法5种方法提取总DNA，对所得DNA溶液进行定量、定性分析和综合比较。结果显示高盐低pH法、高盐沉淀法综合效果较好,改良SDS法所得DNA纯度最佳。p马利华，武安全等则巧用DNA凝胶回收柱提纯种子RNA。禾谷作物种子中含有大量淀粉，由于多糖与RNA溶解性非常相似，所以很难提取和纯化其中的RNA。而经过尝试，发现 DNA 凝胶回收柱不仅可用于纯化回收琼脂糖凝胶上的 DNA，同样可用于纯化富含多糖的植物 RNA。该结合法避免了先提取再纯化的繁琐操作，省去了苯酚-氯仿的抽提，免去了 RNA 反复沉淀溶解

25、等步骤。试验结果表明该方法是一种简捷、高效，能较为彻底除去种子RNA中的多糖杂质的新方法。第52页，共54页，编辑于2022年，星期六核酸提取方法在不同材料中的改进p朱新霞，艾尼江等则采用改进的CTAB法同步提取棉花DNA和RNA，他们在水相中加入licl溶液在-20放置一段时间后，则RNA会特异性的沉淀下来，而DNA会继续留在水相中，通过离心可使RNA分离出来。而留在上清液中的DNA会和预冷的异丙醇较快生成絮状物被分离出来。提取步骤中使用的乙酸钠和低浓度的乙醇，不仅可以帮助去除多糖，还可以去除色素类物质。p杜何为，孙川则通过对CTAB法的改进得到了纯度较高、较为完整的小麦总RNA，他们在小麦总RNA的提取过程中，省略了液氮研磨，而是直接将RNA提取液和小麦幼苗组织混在一起研磨。第53页，共54页，编辑于2022年，星期六Thank You!第54页，共54页，编辑于2022年，星期六