实验三血清醋酸纤维薄膜电泳精品文稿.ppt

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1、实验三血清醋酸纤维薄膜电泳实验三血清醋酸纤维薄膜电泳第1页，本讲稿共32页实验目的：实验目的：掌握电泳的基本原理，加深对蛋白质两性解掌握电泳的基本原理，加深对蛋白质两性解离性质的理解。离性质的理解。掌握血清醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白质掌握血清醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白质的基本操作。的基本操作。第2页，本讲稿共32页实实 验验 原原 理理第3页，本讲稿共32页电泳技术（电泳技术（Electrophoresis）电泳的概念电泳的概念：带电物质在电场中向相反电极移动的带电物质在电场中向相反电极移动的现象称为电泳现象称为电泳.正极正极负极负极带负电粒子带负电粒子带正电粒子带正电粒子第4页，本讲稿共

2、32页背景：背景：电泳现象早在十九世纪初就已发现电泳现象早在十九世纪初就已发现（1808年俄国物理学家年俄国物理学家Ress进行了世界进行了世界上第一次电泳实验）。但电泳技术的广泛上第一次电泳实验）。但电泳技术的广泛应用，则是在应用，则是在1937年用滤纸作为支持介质年用滤纸作为支持介质成功地进行纸电泳以后，是近几十年以来，成功地进行纸电泳以后，是近几十年以来，电泳技术发展很快，各种类型的电泳技术电泳技术发展很快，各种类型的电泳技术相继诞生，在生物化学、医学、免疫学等相继诞生，在生物化学、医学、免疫学等领域得到了广泛应用。领域得到了广泛应用。第5页，本讲稿共32页为了克服溶液对电泳离子的影响，

3、一般在电泳体系中加入不流动的固为了克服溶液对电泳离子的影响，一般在电泳体系中加入不流动的固体支持物体支持物。（一）按支持物的物理性状不同，可分为：（一）按支持物的物理性状不同，可分为：1 1滤纸及其它纤维滤纸及其它纤维(如玻璃纤维、聚氯乙烯纤维薄膜、如玻璃纤维、聚氯乙烯纤维薄膜、醋酸纤醋酸纤维维)电泳电泳2 2粉末电泳：如纤维素粉、淀粉电泳；粉末电泳：如纤维素粉、淀粉电泳；3 3凝胶电泳：如琼脂、琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶电泳；凝胶电泳：如琼脂、琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶电泳；4 4丝线电泳：尼龙丝、人造丝电泳。丝线电泳：尼龙丝、人造丝电泳。电泳的分类 第6页，本讲稿共32页（二）按支持物的装置形式不

4、同，可分为：1 1平板式电泳：支持物水平放置；平板式电泳：支持物水平放置；2 2垂直板式电泳：聚丙烯酰胺凝胶可做成垂直板式电泳；垂直板式电泳：聚丙烯酰胺凝胶可做成垂直板式电泳；3 3垂直柱式电泳：聚丙烯酰胺盘状电泳垂直柱式电泳：聚丙烯酰胺盘状电泳 第7页，本讲稿共32页(三)按pH 的连续性不同，区带电泳可分为：1连续pH 电泳：即整个电泳过程pH 保持不变，如常用的纸电泳、醋酸纤维薄膜电泳等。2非连续pH 电泳：缓冲液和电泳支持物间有不同的pH 的电泳，如聚丙烯酰胺凝胶盘状电脉，等电聚焦电泳等。第8页，本讲稿共32页电泳速度电泳速度:带电粒子在电场中运动时，单位带电粒子在电场中运动时，单位电

5、场强度内粒子运动的速度，以电场强度内粒子运动的速度，以u u表示，即表示，即 V粒子运动的速度粒子运动的速度 X电场强度电场强度Q粒子所带电荷粒子所带电荷 r粒子的半径粒子的半径介质的粘度介质的粘度影响电泳速度的主要因素影响电泳速度的主要因素第9页，本讲稿共32页 1.1.样品本身样品本身:分子带电量：分子带电量：Q越多，越多，u越大；越大；分子大小分子大小:分子小，分子小，r越小，越小，u越大；越大；分子形状：分子形状：形状越小，与支持物介质摩擦形状越小，与支持物介质摩擦 越小，越小，u越大。越大。形状越规则，形状越规则，u越大，越大，反之则越反之则越 小。小。球形分子球形分子 纤维状分子纤

6、维状分子第10页，本讲稿共32页2 2.缓冲溶液缓冲溶液：A A.pH.pH值：值：(pH-pI)(pH-pI)越大，越大，Q Q越多，越多，u u越大越大B.离子强度(I)：离子强度代表所有类型的离子所产生的静电力，也就是全部的离子效应，它取决于离子电荷的总数，而与溶液中盐类的性质无关。溶液的离子强度越高，带电质点的泳动速度越慢；离子强度越低，质点泳动的速度越快。一般离子强度的选择范围在0.020.2之间。第11页，本讲稿共32页3.3.电场强度电场强度(X):(X):电场强度：电泳支持物上每厘米的电位降，也称电势梯度。X越大，u越快。支持物越短，X越大，u越快。注意：电场强度越大或支持物越

7、短，电流将随之增加，产热也增加，影响分离效果。在进行高压电泳的时候必须用冷却装置，否则可引起蛋白质等样品发生热变性而无法分离。第12页，本讲稿共32页 电泳缓冲液相对于固体支持物的移动称电泳缓冲液相对于固体支持物的移动称电渗电渗。如纸电泳时，。如纸电泳时，滤纸吸附滤纸吸附OHOH-带负电荷，与纸接触的缓冲液带正电荷向负极移动，带负电荷，与纸接触的缓冲液带正电荷向负极移动，会对颗粒的移动造成不良影响，故电泳时，电渗小些为好。会对颗粒的移动造成不良影响，故电泳时，电渗小些为好。4 4电渗现象电渗现象第13页，本讲稿共32页醋酸纤维薄膜电泳醋酸纤维薄膜电泳第14页，本讲稿共32页 醋酸纤维是纤维素的

8、醋酸酯，由纤维素的羟基经醋酸纤维是纤维素的醋酸酯，由纤维素的羟基经 乙酰化而成。涂抹成均匀的薄膜则成为醋酸纤维素薄乙酰化而成。涂抹成均匀的薄膜则成为醋酸纤维素薄膜。该膜具有均一的泡沫状的结构，有强渗透性，厚膜。该膜具有均一的泡沫状的结构，有强渗透性，厚度约为度约为120120微米微米。醋酸纤维素薄膜电泳有以下醋酸纤维素薄膜电泳有以下优点优点：微量、快速、简便、分辨力高、微量、快速、简便、分辨力高、对样品无拖尾和吸附现象对样品无拖尾和吸附现象 第15页，本讲稿共32页实验原理实验原理以蛋白质为例：以蛋白质为例：pHpI pH=pI pHpI血清蛋白带负电荷血清蛋白带负电荷,在电场中向正极移动。在

9、电场中向正极移动。第17页，本讲稿共32页 经醋酸纤维素薄膜电泳可将血清蛋白按电泳速度分为5条区带第18页，本讲稿共32页染色和定量膜条经过氨基黑膜条经过氨基黑10B10B染色后显出清晰色带。染色后显出清晰色带。各色带蛋白质含量与染料结合量基本成正比。各色带蛋白质含量与染料结合量基本成正比。可将各色带剪开，分别溶于碱性溶液中。可将各色带剪开，分别溶于碱性溶液中。用分光光度法计算各种蛋白质的百分数。用分光光度法计算各种蛋白质的百分数。第19页，本讲稿共32页实验步骤实验步骤：1准备与点样：取一条取一条2.58cm2.58cm的的膜条膜条充分浸透在巴充分浸透在巴比妥缓冲液中比妥缓冲液中取出膜条取出

10、膜条滤纸吸去滤纸吸去多余的缓多余的缓冲液冲液无光面距一无光面距一端端1.5cm1.5cm处作处作点样线点样线点样器下端点样器下端粘上薄层血粘上薄层血清清垂直垂直点样点样第20页，本讲稿共32页（注意：在薄膜负极端写好学号或者做好标记（注意：在薄膜负极端写好学号或者做好标记)第21页，本讲稿共32页2电泳放置放置膜条膜条点样端置于阴极点样端置于阴极点样面向下点样面向下膜条贴膜条贴紧滤纸，拉紧滤纸，拉直膜条直膜条平衡平衡10分钟分钟通通电电电压：电压：160v时间：时间：50 min关闭关闭电源电源第22页，本讲稿共32页第23页，本讲稿共32页3染色、脱色通电通电完毕完毕取出取出膜条膜条浸于染色

11、液浸于染色液（氨基黑（氨基黑10B10B）中）中3min取出取出膜条膜条依次浸于漂依次浸于漂洗液洗液、各各5min直至直至漂净漂净滤纸吸滤纸吸干薄膜干薄膜第24页，本讲稿共32页第25页，本讲稿共32页.定量(两人的膜条共用)取试管取试管6支，编号支，编号16试管编号A1200.4mol/LNaOH 6.0ml3.0ml3.0ml3.0ml3.0ml3.0ml蛋白条带 清蛋白1球蛋白2球蛋白球蛋白球蛋白无蛋白区充分振荡、脱净染料充分振荡、脱净染料比比 色、定色、定 量量15min第26页，本讲稿共32页实验结果实验结果：原始数据：各样品吸光度值清蛋白1球蛋白2球蛋白球蛋白球蛋白A仪器型号：吸收

12、波长：650nm第27页，本讲稿共32页光密度总和光密度总和T T2A2A1 12 21 1计算出各部分蛋白质占总蛋白质的百分数。计算出各部分蛋白质占总蛋白质的百分数。清蛋白（清蛋白（2 2A A/T T）1001001 1球蛋白（球蛋白（1 1/T T）1001002 2球蛋白（球蛋白（2 2/T T）100100球蛋白（球蛋白（/T T）100100球蛋白（球蛋白（/T T）1001002 2计算出清蛋白与球蛋白之比值（计算出清蛋白与球蛋白之比值（2 2A/GA/G）G=G=1 12 2第28页，本讲稿共32页血清蛋白电泳结果的临床意义：可能相关疾病清蛋白1球蛋白2球蛋白球蛋白球蛋白骨髓瘤

13、*肾病综合症*肾炎*肝硬化*急性肝坏死*传染性肝炎*急性感染初期*慢性炎症/感染后期*低球蛋白血症*临床上还可用临床上还可用A/GA/G比来表示清球蛋白的量的关系：比来表示清球蛋白的量的关系：正常人正常人A/GA/G1.51.52.52.5第29页，本讲稿共32页注意事项注意事项：1、点样时，应将薄膜表面多余的缓冲液用、点样时，应将薄膜表面多余的缓冲液用滤纸吸去，吸水量以不干不湿为宜。滤纸吸去，吸水量以不干不湿为宜。2、点样时，动作要轻、稳，用力不能太大，、点样时，动作要轻、稳，用力不能太大，以免损坏膜以免损坏膜 片或印出凹陷影响电泳区带分片或印出凹陷影响电泳区带分离效果。离效果。3、点样应点

14、在薄膜的毛面上，点样量要适、点样应点在薄膜的毛面上，点样量要适量，不宜过多或过少。量，不宜过多或过少。第30页，本讲稿共32页 4、电泳时应将薄膜的点样端置于电泳槽的、电泳时应将薄膜的点样端置于电泳槽的负极端，且点样面向下。负极端，且点样面向下。5、应控制染色时间。时间长，薄膜底色不、应控制染色时间。时间长，薄膜底色不易脱去；时间太短，着色不易区分，或造成易脱去；时间太短，着色不易区分，或造成条带染色不均匀。条带染色不均匀。第31页，本讲稿共32页下次实验：下次实验：血清血清-球蛋白的提纯球蛋白的提纯 预习要点预习要点：1.盐析、凝胶层析、透析法分离纯化蛋白 质的基本原理及操作 2.蛋白质定性检测的方法。3.离心机的原理及操作。第32页，本讲稿共32页