基因工程 第三章优秀课件.ppt
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1、基因工程 第三章第1页,本讲稿共55页载体定义载体定义 分子克隆载体是一类可供外源分子克隆载体是一类可供外源DNADNA插入并携带重组插入并携带重组DNADNA分子进入适当分子进入适当宿主细胞的宿主细胞的DNADNA分子。分子。第2页,本讲稿共55页载体特点载体特点 1.1.1.1.至少有一个复制起点,因而至少可在至少有一个复制起点,因而至少可在至少有一个复制起点,因而至少可在至少有一个复制起点,因而至少可在一种生物体中自主复制。一种生物体中自主复制。一种生物体中自主复制。一种生物体中自主复制。2.2.2.2.至少应有一个克隆位点,以供外源至少应有一个克隆位点,以供外源至少应有一个克隆位点,以
2、供外源至少应有一个克隆位点,以供外源DNADNADNADNA插入。插入。插入。插入。3.3.3.3.至少应有一个遗传标记基因,以指至少应有一个遗传标记基因,以指至少应有一个遗传标记基因,以指至少应有一个遗传标记基因,以指示载体或重组示载体或重组示载体或重组示载体或重组DNADNADNADNA分子是否进入宿主细胞分子是否进入宿主细胞分子是否进入宿主细胞分子是否进入宿主细胞第3页,本讲稿共55页载体种类载体种类质粒载体(plasmid)plasmid)噬菌体的衍生物柯斯质粒(cosmid)单链DNA噬菌体M13M13动物病毒第4页,本讲稿共55页 第一节 质粒载体一、质粒载体的一般生物学特征染色体
3、DNA质粒DNA大肠杆菌细胞第5页,本讲稿共55页1.定义定义:质粒是染色体外能够自主复制的双链质粒是染色体外能够自主复制的双链闭合环状闭合环状DNA分子。广泛存在于细菌细胞中,在蓝藻、霉广泛存在于细菌细胞中,在蓝藻、霉菌、酵母甚至真菌细胞中都发现有质粒分菌、酵母甚至真菌细胞中都发现有质粒分子的存在。子的存在。第6页,本讲稿共55页2.质粒DNA的一般生物学特性 (1 1)分子特性)分子特性 a a 构型构型 三种三种 SC型 超螺旋L型 线型 OC型 开环b 分子量 1-200kb第7页,本讲稿共55页(2 2)质粒的复制类型 根据质粒根据质粒DNADNA复制与宿主之间的关系或质粒在宿主复制
4、与宿主之间的关系或质粒在宿主细胞中拷贝数的多少将质粒分为两种类型:细胞中拷贝数的多少将质粒分为两种类型:严紧型严紧型 1-31-3个拷贝个拷贝 松弛型松弛型 10-20010-200个拷贝个拷贝 第8页,本讲稿共55页(3 3)质粒的不亲和性)质粒的不亲和性 所谓质粒的不亲和性(不相容性)是指所谓质粒的不亲和性(不相容性)是指在没有选择压力的情况下,两种不同质粒不在没有选择压力的情况下,两种不同质粒不能在同一个宿主细胞系中稳定地的共存的现能在同一个宿主细胞系中稳定地的共存的现象。象。第9页,本讲稿共55页(4)质粒的转移性 质粒的转移性是指质粒从一个细胞转移到另质粒的转移性是指质粒从一个细胞转
5、移到另一个细胞的特性。一个细胞的特性。结合型:可自我转移,大多为严紧型质粒结合型:可自我转移,大多为严紧型质粒 非结合型:不可自我转移,安全,为基因工程中常用。非结合型:不可自我转移,安全,为基因工程中常用。大多为松弛型质粒大多为松弛型质粒第10页,本讲稿共55页二、理想质粒载体的必备条件二、理想质粒载体的必备条件1.1.天然质粒用作载体的局限性天然质粒用作载体的局限性 天然质粒是指没有经过体外修饰改造的质粒天然质粒是指没有经过体外修饰改造的质粒 具有分子量大,克隆能力低,拷贝数低,提取具有分子量大,克隆能力低,拷贝数低,提取难度大,克隆位点有限,编码基因具免疫筛选等不难度大,克隆位点有限,编
6、码基因具免疫筛选等不足之处。足之处。第11页,本讲稿共55页2.理想质粒载体的必备条件:理想质粒载体的必备条件:(1 1)分子量尽量小,分子量尽量小,(2 2)应最大限度的具有各种常用限制性内切酶的)应最大限度的具有各种常用限制性内切酶的 单一酶切位点,单一酶切位点,(3 3)具两种以上的选择标记基因)具两种以上的选择标记基因 ;(4 4)缺失)缺失mobmob基因基因 (5 5)重组质粒较易导入宿主细胞并复制和表达。)重组质粒较易导入宿主细胞并复制和表达。第12页,本讲稿共55页二、普通型载体二、普通型载体pBR322pBR322的质粒图的质粒图第13页,本讲稿共55页pBR322的构建过程
7、的构建过程1.PBR322PBR322质粒载体的构建第14页,本讲稿共55页1.PBR3221.PBR322的一般生物学特性的一般生物学特性 a PBR322 a PBR322 大小为大小为4.363kb 4.363kb 为松弛型质粒,为松弛型质粒,复制起始点来源于复制起始点来源于pMB1 pMB1 b b 四环素抗性基因(四环素抗性基因(TetTet r r)来源于来源于pSC101pSC101 c c 氨苄青霉素抗性基因(氨苄青霉素抗性基因(AmpAmp r r)来源于)来源于pSF2124 pSF2124 d 12 d 12 种限制性内切酶的单一识别位点。种限制性内切酶的单一识别位点。分
8、别位于分别位于TetTet r r 和和AmpAmp r r中中第15页,本讲稿共55页2.PBR3222.PBR322的优点的优点 a a 分子量小分子量小 4363bp 4363bp 统一规定记数从统一规定记数从EcoRIEcoRI识别位点识别位点GAATTCGAATTC的第一个的第一个T T为为1 1 b b 两种抗生素抗性基因,可作为重组体的选择标记,便于筛选两种抗生素抗性基因,可作为重组体的选择标记,便于筛选重组体。重组体。TetTetr r 基因内有基因内有7 7个酶切位点,个酶切位点,AmpAmpr r 基因内有基因内有3 3 个酶切位点,个酶切位点,OriOri内有内有2 2个
9、酶切位点个酶切位点 插入失活:因插入外源插入失活:因插入外源DNA DNA 片段而使基因失活的现象片段而使基因失活的现象c c 具有较高的拷贝数具有较高的拷贝数 1000-3000/1000-3000/细胞细胞 第16页,本讲稿共55页用Hea消化PBR322使其缺失Hea的B和G片段,缺失了迁移蛋白基因(mob),增加了安全性3.PBR322的改良第17页,本讲稿共55页 为了克服为了克服EcoR IEcoR I位点不具备插入失活效应这一缺位点不具备插入失活效应这一缺点,引入具有点,引入具有EcoR IEcoR I单一酶切位点的单一酶切位点的CmlCmlr r基因,得到基因,得到新质粒新质粒
10、pBR325pBR325.第18页,本讲稿共55页三、常用质粒载体类型三、常用质粒载体类型(一)(一)克隆质粒载体克隆质粒载体 克隆质粒载体是指专用于基因或克隆质粒载体是指专用于基因或DNADNA片片段无性繁殖的质粒载体。目前常用的克段无性繁殖的质粒载体。目前常用的克隆质粒载体有隆质粒载体有pBR322pBR322、pUCpUC及其派生质粒载及其派生质粒载体。体。第19页,本讲稿共55页1.pBR322及其派生的质粒载体 pAT153 pBR325 2.pUC系列的质粒载体 一种典型的一种典型的pUCpUC系列的质粒载体包括如下系列的质粒载体包括如下4 4个组成部分个组成部分:(1)pBR32
11、2 (1)pBR322的复制起始点的复制起始点 (2)(2)氨苄青霉素抗性基因氨苄青霉素抗性基因()acZacZ 基因基因 ()半乳糖苷酶的氨基端半乳糖苷酶的氨基端第20页,本讲稿共55页第21页,本讲稿共55页pUCpUC质粒载体的特点质粒载体的特点:1.1.具有更小的分子量具有更小的分子量 pUC8/pUC9 2750bp pUC8/pUC9 2750bp pUC/18 pUC19 2686bp pUC/18 pUC19 2686bp 2.2.利用组织化学法筛选重组体利用组织化学法筛选重组体 3.3.具有多克隆位点具有多克隆位点 4.4.具有更高的拷贝数具有更高的拷贝数第22页,本讲稿共5
12、5页(二)表达质粒载体 表达质粒载体是指专用于在宿主细胞中高水平表达外源表达质粒载体是指专用于在宿主细胞中高水平表达外源蛋白质的质粒载体。蛋白质的质粒载体。据所表达的蛋白是否分泌到细胞外可分为:据所表达的蛋白是否分泌到细胞外可分为:非分泌型表达载体(胞内表达载体)非分泌型表达载体(胞内表达载体)分泌型表达载体分泌型表达载体 据所用的受体细胞不同:据所用的受体细胞不同:原核细胞表达载体原核细胞表达载体 真核细胞表达载体真核细胞表达载体第23页,本讲稿共55页(二)表达质粒载体表达质粒载体与克隆质粒载体的区别在于表达载体必须含有:1.强启动子,2.2.在启动子下游区和起始密码子上游区有一个好的S-
13、D序列3.在插入序列的下游区要有一个强转录终止序列,在插入序列的下游区要有一个强转录终止序列,第24页,本讲稿共55页三三种种表表达达型型载载体体结结构构图图第25页,本讲稿共55页(三)穿梭质粒载体 所谓穿梭质粒载体是指一类由人工构建的具有两种不同复制起点和选择标记,因而右在两种不同的宿主细胞中存活和复制的质粒载体。常见的穿梭质粒有大肠杆菌-土壤农杆菌穿梭质粒载体、大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒载体、大肠杆菌-酿酒酵母穿梭质粒载体。第26页,本讲稿共55页大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌-酿酒酵母穿梭载体酿酒酵母穿梭载体酿酒酵母穿梭载体酿酒酵母穿梭载体第27页,本讲稿共55页第28页,本讲稿
14、共55页(四)多功能质粒载体 这类载体具有多种功能,它可以根据需这类载体具有多种功能,它可以根据需要进行体外转录、克隆、测序、基因表达等要进行体外转录、克隆、测序、基因表达等方面的基因操作。方面的基因操作。pGEMpGEM系列质粒载体就是系列质粒载体就是一类多功能载体,如一类多功能载体,如pGEM-3pGEM-3、pGEM-4pGEM-4、pGEM-3Z pGEM-3Z、pGEM-4zpGEM-4z、pGEM 3zfpGEM 3zf等。都等。都是由是由pUCpUC系列质粒载体派生而来的。系列质粒载体派生而来的。第29页,本讲稿共55页第二节 噬菌体载体 细菌质粒载体为基因克隆提供了快速、简便的
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