分子生物学实验精.ppt

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1、分子生物学实验第1页，本讲稿共14页基因基因基因基因组组DNADNA的提取通常用于构建基因的提取通常用于构建基因的提取通常用于构建基因的提取通常用于构建基因组组文文文文库库、SouthernSouthern杂杂交交交交(包括包括包括包括RFLP)RFLP)及及及及PCRPCR分离基因等。分离基因等。分离基因等。分离基因等。利用基因利用基因利用基因利用基因组组DNADNA较长较长的特性的特性的特性的特性,可以将其与可以将其与可以将其与可以将其与细细胞器或胞器或胞器或胞器或质质粒等小分粒等小分粒等小分粒等小分子子子子DNADNA分离。加入一定量的异丙醇或乙醇，基因分离。加入一定量的异丙醇或乙醇，基

2、因分离。加入一定量的异丙醇或乙醇，基因分离。加入一定量的异丙醇或乙醇，基因组组的大分子的大分子的大分子的大分子DNADNA即沉即沉即沉即沉淀形成淀形成淀形成淀形成纤维纤维状絮状絮状絮状絮团飘团飘浮其中浮其中浮其中浮其中,可用玻棒将其取出，而小分子可用玻棒将其取出，而小分子可用玻棒将其取出，而小分子可用玻棒将其取出，而小分子DNADNA则则只只只只形成形成形成形成颗颗粒状沉淀附于壁上及底部粒状沉淀附于壁上及底部粒状沉淀附于壁上及底部粒状沉淀附于壁上及底部,从而达到提取的目的。从而达到提取的目的。从而达到提取的目的。从而达到提取的目的。在提取在提取在提取在提取过过程中程中程中程中,染色体会染色体会

3、染色体会染色体会发发生机械断裂生机械断裂生机械断裂生机械断裂,产产生大小不同的片段生大小不同的片段生大小不同的片段生大小不同的片段,因此分离基因因此分离基因因此分离基因因此分离基因组组DNADNA时应时应尽量在温和的条件下操作尽量在温和的条件下操作尽量在温和的条件下操作尽量在温和的条件下操作,如尽量减少酚如尽量减少酚如尽量减少酚如尽量减少酚/氯氯仿抽提、混匀仿抽提、混匀仿抽提、混匀仿抽提、混匀过过程要程要程要程要轻缓轻缓,以保以保以保以保证证得到得到得到得到较长较长的的的的DNADNA。一般来。一般来。一般来。一般来说说,构建基因构建基因构建基因构建基因组组文文文文库库,初始初始初始初始DNA

4、DNA长长度必度必度必度必须须在在在在100kb100kb以上以上以上以上,否否否否则酶则酶切后切后切后切后两两两两边边都都都都带带合适末端的有效片段很少。而合适末端的有效片段很少。而合适末端的有效片段很少。而合适末端的有效片段很少。而进进行行行行RFLPRFLP和和和和PCRPCR分析分析分析分析,DNADNA长长度可短至度可短至度可短至度可短至50kb,50kb,在在在在该长该长度以上度以上度以上度以上,可保可保可保可保证酶证酶切后切后切后切后产产生生生生RFLPRFLP片片片片段段段段(20kb(20kb以下以下以下以下),),并可保并可保并可保并可保证证包含包含包含包含PCRPCR所所

5、所所扩扩增的片段增的片段增的片段增的片段(一般一般一般一般2kb2kb以下以下以下以下)。第2页，本讲稿共14页不同生物（植物、不同生物（植物、动物、微生物）的基因物、微生物）的基因组DNA的提取方法有的提取方法有所不同所不同;不同种不同种类或同一种或同一种类的不同的不同组织因其因其细胞胞结构及所含的成构及所含的成分不同，分离方法也有差异。在提取某种特殊分不同，分离方法也有差异。在提取某种特殊组织的的DNA时必必须参照文献和参照文献和经验建立相建立相应的提取方法的提取方法,以以获得可用的得可用的DNA大分子。大分子。尤其是尤其是组织中的多糖和中的多糖和酶类物物质对随后的随后的酶切、切、PCR反

6、反应等有等有较强的抑制作用的抑制作用,因此用富含因此用富含这类物物质的材料提取基因的材料提取基因组DNA时时,应考考虑除去多糖和酚除去多糖和酚类物物质。本本实验以以动物肝物肝脏为材料材料,学学习基因基因组DNA提取的一般方法。提取的一般方法。第3页，本讲稿共14页提提提提纯纯的思路的思路的思路的思路1.1.1.1.基因基因基因基因组组DNADNA的特性：分子量的特性：分子量的特性：分子量的特性：分子量较较大、易断（如何保大、易断（如何保大、易断（如何保大、易断（如何保证证DNADNA分子的完整性？）分子的完整性？）分子的完整性？）分子的完整性？）2.2.组织组织和和和和细细胞的破碎胞的破碎胞的

7、破碎胞的破碎3.3.要去除的物要去除的物要去除的物要去除的物质质：蛋白、多糖、脂蛋白、多糖、脂蛋白、多糖、脂蛋白、多糖、脂类类、RNARNA和小分子物和小分子物和小分子物和小分子物质质第4页，本讲稿共14页一、材料一、材料 哺乳哺乳动物新物新鲜组织。二、二、设备 移液管移液管高速冷高速冷冻离心机离心机台式离心机台式离心机水浴水浴锅。第5页，本讲稿共14页三、三、试剂：1.组织匀匀浆液液200 mL 灭菌菌备用用10mmol/L Tris-HCl pH 8.0 25mmol/L EDTA 100mmol/L NaCl2.酶解液解液100 mL（灭菌后再加蛋白菌后再加蛋白酶K K和和SDS)20m

8、mol/L Tris-HCl pH 8.0 50mmol/L EDTA 200mmol/L NaCl 200ug/mL蛋白蛋白酶K 1SDS 第6页，本讲稿共14页3.生理生理盐水水(0.7%)1000 mL 灭菌菌备用用4.3mol/L NaAc pH5.2 100 mL 灭菌菌备用用先用先用50mL水溶解固体水溶解固体NaAc 再用再用3mol/L乙酸乙酸调pH至至5.2，最后定，最后定容容同同时灭菌菌备用：用：枪头：1mL、200uL 各一盒各一盒小指管小指管:2.0、0.5mL各各20个个研磨棒研磨棒:20支支无菌水：无菌水：250ml X 2瓶瓶第7页，本讲稿共14页四、实验步骤四、

9、实验步骤基因基因基因基因组组DNADNA的提取：的提取：的提取：的提取：0.2g0.2g鼠肝，冰冷生理鼠肝，冰冷生理鼠肝，冰冷生理鼠肝，冰冷生理盐盐水洗水洗水洗水洗3 3 3 3次，剪碎次，剪碎次，剪碎次，剪碎加入液氮，研磨碎鼠肝成粉末，加入加入液氮，研磨碎鼠肝成粉末，加入加入液氮，研磨碎鼠肝成粉末，加入加入液氮，研磨碎鼠肝成粉末，加入2mL2mL匀匀匀匀浆浆液混匀液混匀液混匀液混匀匀匀匀匀浆浆液液液液转转入入入入2mL2mL小指管，小指管，小指管，小指管，4 4 4 40 0 0 0C,5000rpmC,5000rpm离心离心离心离心2min,2min,沉淀加沉淀加沉淀加沉淀加0.4mL0.

10、4mL无菌水，无菌水，无菌水，无菌水，吹散吹散吹散吹散，再，再，再，再加加加加0.4mL0.4mL酶酶解液，解液，解液，解液，慢慢慢慢慢慢慢慢颠颠倒倒倒倒混匀混匀混匀混匀55550 0 0 0C C 水浴水浴水浴水浴酶酶解解解解过过夜或夜或夜或夜或2 2 2 2小小小小时时以上，以上，以上，以上，4 4 4 40 0 0 0C C C C存放存放存放存放第8页，本讲稿共14页（加（加（加（加RNase,RNase,终浓终浓度度度度200ug/mL200ug/mL，37370 0 0 0C C C C保温保温保温保温60min60min）加等体加等体加等体加等体积积酚酚酚酚/氯氯仿仿仿仿/异戊醇

11、，异戊醇，异戊醇，异戊醇，慢慢慢慢慢慢慢慢颠颠倒倒倒倒混匀，冰上混匀，冰上混匀，冰上混匀，冰上平倒静置平倒静置平倒静置平倒静置10-10-20min20min4 4 4 40 0 0 0C C C C，10000rpm10000rpm离心离心离心离心10min10min，用，用，用，用扩扩口口口口枪头枪头取出上清取出上清取出上清取出上清上清加等体上清加等体上清加等体上清加等体积氯积氯仿仿仿仿/异戊醇，异戊醇，异戊醇，异戊醇，慢慢慢慢慢慢慢慢颠颠倒倒倒倒混匀混匀混匀混匀4 4 4 40 0 0 0C,10000rpmC,10000rpm，用，用，用，用扩扩口口口口枪头枪头取上清取上清取上清取上清

12、第9页，本讲稿共14页上清加上清加1/10体体积的的NaAc和加和加2 2倍体倍体积的无水乙醇的无水乙醇慢慢混匀沉淀慢慢混匀沉淀DNA，-200 0C C静置静置30min，DNA沉淀形成白色絮状物。沉淀形成白色絮状物。12000rpm离心离心15min，弃上清，弃上清沉淀用沉淀用1mL 75%冷乙醇洗两次，每次冷乙醇洗两次，每次12000rpm离心离心10min，弃上清，弃上清超超净台中干燥加台中干燥加 50uL TE,40 0C C溶解溶解过夜，夜，-200 0C C保存保存第10页，本讲稿共14页基因基因组DNA的的检测 前述方法得到的前述方法得到的前述方法得到的前述方法得到的DNADN

13、ADNADNA一般可以用作一般可以用作一般可以用作一般可以用作Southern,RFLPSouthern,RFLPSouthern,RFLPSouthern,RFLP、PCRPCRPCRPCR等分等分等分等分析。由于所用材料的不同析。由于所用材料的不同析。由于所用材料的不同析。由于所用材料的不同,得到的得到的得到的得到的DNADNADNADNA产量及质量均不同产量及质量均不同产量及质量均不同产量及质量均不同,有有有有时时时时DNADNADNADNA中含有酚类和多糖类物质中含有酚类和多糖类物质中含有酚类和多糖类物质中含有酚类和多糖类物质,会影响酶切和会影响酶切和会影响酶切和会影响酶切和PCRPC

14、RPCRPCR的效果。的效果。的效果。的效果。所以获得基因组所以获得基因组所以获得基因组所以获得基因组DNADNADNADNA后后后后,均需检测均需检测均需检测均需检测DNADNADNADNA的产量和质量。的产量和质量。的产量和质量。的产量和质量。1.DNA1.DNA1.DNA1.DNA溶液稀释溶液稀释溶液稀释溶液稀释20-3020-3020-3020-30倍后倍后倍后倍后,测定测定测定测定OD260/OD280 OD260/OD280 OD260/OD280 OD260/OD280 比值比值比值比值,明确明确明确明确DNADNADNADNA的含量和质量。的含量和质量。的含量和质量。的含量和质

15、量。()2.2.2.2.取取取取2-5l 2-5l 2-5l 2-5l 在在在在0.7%agarose0.7%agarose0.7%agarose0.7%agarose胶上胶上胶上胶上80V80V80V80V电泳电泳电泳电泳,检测检测检测检测DNADNADNADNA的分子的分子的分子的分子大小。大小。大小。大小。()3.3.3.3.取取取取2g DNA,2g DNA,2g DNA,2g DNA,用用用用10101010单位单位单位单位(U)Hind(U)Hind(U)Hind(U)Hind酶切过夜酶切过夜酶切过夜酶切过夜,0.7%,0.7%,0.7%,0.7%agaroseagaroseaga

16、roseagarose胶上电泳胶上电泳胶上电泳胶上电泳,检测能否完全酶解检测能否完全酶解检测能否完全酶解检测能否完全酶解(做做做做RFLP,DNARFLP,DNARFLP,DNARFLP,DNA必须完全必须完全必须完全必须完全酶解酶解酶解酶解)。第11页，本讲稿共14页如果如果如果如果DNADNA中所含中所含中所含中所含杂质杂质多多多多,不能完全不能完全不能完全不能完全酶酶切切切切,或小分或小分或小分或小分子子子子DNADNA多多多多,影响接影响接影响接影响接续续的分析和操作的分析和操作的分析和操作的分析和操作,可以用下列方法可以用下列方法可以用下列方法可以用下列方法处处理：理：理：理：（1

17、1 1 1）选选用幼嫩植物用幼嫩植物用幼嫩植物用幼嫩植物组织组织，可减少淀粉，可减少淀粉，可减少淀粉，可减少淀粉类类的含量。的含量。的含量。的含量。（2 2 2 2）酚）酚）酚）酚:氯氯仿抽提仿抽提仿抽提仿抽提,去除蛋白去除蛋白去除蛋白去除蛋白质质和多糖。和多糖。和多糖。和多糖。（3 3 3 3）SepharoseSepharose柱柱柱柱过滤过滤,去除酚去除酚去除酚去除酚类类、多糖和小分子、多糖和小分子、多糖和小分子、多糖和小分子DNADNA。（4 4 4 4）CsClCsCl梯度离心梯度离心梯度离心梯度离心,去除去除去除去除杂质杂质,分离大片段分离大片段分离大片段分离大片段DNA(DNA(

18、可用可用可用可用作文作文作文作文库库构建构建构建构建)。第12页，本讲稿共14页可能的结果：可能的结果：由于基因由于基因组DNA比比较难溶、且容易被降解，溶、且容易被降解，电泳泳时经常会出常会出现弥弥散的或不均一的条散的或不均一的条带（如左（如左图）。所以）。所以实验时一定要注意机械力一定要注意机械力对大分子大分子DNA的破坏作用，如避免振的破坏作用，如避免振荡、使用、使用扩口口枪头等。另外等。另外要适当的延要适当的延长溶解溶解时间。第13页，本讲稿共14页n n实验的常的常见问题、关、关键问题及及难点：点：基因基因组DNA的断裂、的断裂、蛋白和色素去除不干蛋白和色素去除不干净基因基因组DNA难溶、溶、电泳泳时凝胶易碎凝胶易碎第14页，本讲稿共14页