核酸含量测定定磷法优秀课件.ppt

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1、核酸含量测定定磷法1 1第1页，本讲稿共14页核酸定量测定常见的方法 1.1.定磷法：将核酸消化，测定其无机磷量，由此计算出核酸含量，定磷法：将核酸消化，测定其无机磷量，由此计算出核酸含量，定磷法：将核酸消化，测定其无机磷量，由此计算出核酸含量，定磷法：将核酸消化，测定其无机磷量，由此计算出核酸含量，反应灵敏。反应灵敏。反应灵敏。反应灵敏。2.2.紫外吸收法：利用核酸在紫外吸收法：利用核酸在紫外吸收法：利用核酸在紫外吸收法：利用核酸在260nm260nm处有吸收高峰，操作简便，受处有吸收高峰，操作简便，受处有吸收高峰，操作简便，受处有吸收高峰，操作简便，受蛋白质和核苷酸的干扰影响。蛋白质和核苷

2、酸的干扰影响。蛋白质和核苷酸的干扰影响。蛋白质和核苷酸的干扰影响。3.3.地衣酚法：用于测定地衣酚法：用于测定地衣酚法：用于测定地衣酚法：用于测定RNARNA的含量，的含量，的含量，的含量，RNARNA与浓盐酸共热，降解形成与浓盐酸共热，降解形成与浓盐酸共热，降解形成与浓盐酸共热，降解形成的核糖转变为糠醛，利用地衣酚反应来测定，特异性差，戊糖均的核糖转变为糠醛，利用地衣酚反应来测定，特异性差，戊糖均的核糖转变为糠醛，利用地衣酚反应来测定，特异性差，戊糖均的核糖转变为糠醛，利用地衣酚反应来测定，特异性差，戊糖均有此反应。有此反应。有此反应。有此反应。4.4.二苯胺法：二苯胺法：二苯胺法：二苯胺法

3、：DNADNA中的脱氧核糖在酸性溶液中转化为中的脱氧核糖在酸性溶液中转化为中的脱氧核糖在酸性溶液中转化为中的脱氧核糖在酸性溶液中转化为-羟羟羟羟-酮酮酮酮基戊醛，利用二苯胺试剂反应，除脱氧木糖和阿拉伯糖外其他基戊醛，利用二苯胺试剂反应，除脱氧木糖和阿拉伯糖外其他基戊醛，利用二苯胺试剂反应，除脱氧木糖和阿拉伯糖外其他基戊醛，利用二苯胺试剂反应，除脱氧木糖和阿拉伯糖外其他糖类无此反应。糖类无此反应。糖类无此反应。糖类无此反应。2 2第2页，本讲稿共14页定磷法的原理首先将核酸样品用硫酸消化成无机磷，利用定磷试剂测首先将核酸样品用硫酸消化成无机磷，利用定磷试剂测首先将核酸样品用硫酸消化成无机磷，利用

4、定磷试剂测首先将核酸样品用硫酸消化成无机磷，利用定磷试剂测定无机磷量。反应式为：定无机磷量。反应式为：定无机磷量。反应式为：定无机磷量。反应式为：(NHNH4 4)MoO)MoO4 4+H+H2 2SOSO4 4HH2 2MoOMoO4 4+(NH+(NH4 4)2 2SOSO4 4 HH3 3POPO4 4+12H+12H2 2MoOMoO44H H3 3P(MoP(Mo3 3OO1010)4 4+12H+12H2 2OO HH3 3P(MoP(Mo3 3OO1010)44MoMo2 2OO33 MoOMoO3 3（钼蓝）钼蓝）钼蓝）钼蓝）Vit C3 3第3页，本讲稿共14页 还原产物钼蓝

5、在波长还原产物钼蓝在波长660nm测定吸测定吸光值，当无机磷含量在光值，当无机磷含量在125g 范围内，范围内，光吸收和含磷量成正比。光吸收和含磷量成正比。RNA的含磷量为的含磷量为9.5%，即，即1g RNA磷相当于磷相当于10.5 g RNA。DNA的含的含磷量平均为磷量平均为9.9%。4 4第4页，本讲稿共14页试剂 酵母酵母酵母酵母RNARNA样品溶液：样品溶液：样品溶液：样品溶液：20002000 g/mLg/mL 标标准磷原液：含磷量准磷原液：含磷量准磷原液：含磷量准磷原液：含磷量为为10001000 g/mLg/mL 标标准磷溶液：含磷量准磷溶液：含磷量准磷溶液：含磷量准磷溶液：

6、含磷量为为1010 g/mLg/mL，每，每，每，每组组用干用干用干用干试试管取管取管取管取15mL15mL 定磷定磷定磷定磷试剂试剂：含硫酸、：含硫酸、：含硫酸、：含硫酸、钼钼酸酸酸酸铵铵、Vit.CVit.C，浅黄色，如果，浅黄色，如果，浅黄色，如果，浅黄色，如果变绿变绿则则不能使用不能使用不能使用不能使用,每每每每组组用用用用100mL100mL烧烧杯取杯取杯取杯取70mL70mL5 5第5页，本讲稿共14页实验步骤1.核酸样品用硫酸消化，将有机磷转化成无核酸样品用硫酸消化，将有机磷转化成无机磷；机磷；2.制定定磷标准曲线；制定定磷标准曲线；3.测定回收率和样品总磷量。测定回收率和样品总

7、磷量。6 6第6页，本讲稿共14页1.样品消化（每两组或三组做一份）（每两组或三组做一份）消化管消化管消化管消化管1 12 23 3RNA/mLRNA/mL0 01 10 0标准磷原液标准磷原液标准磷原液标准磷原液/mLmL0 00 01 1dHdH2 2O/mLO/mL1 10 00 05 5mol/LHmol/LH2 2SOSO4 4/mL/mL2 22 22 2消煮炉中消化消煮炉中消化消煮炉中消化消煮炉中消化26h26h至溶液无色透明，冷却至溶液无色透明，冷却至溶液无色透明，冷却至溶液无色透明，冷却dHdH2 2O/mLO/mL1 11 11 1沸水浴中加热沸水浴中加热沸水浴中加热沸水浴

8、中加热1010minmin（分解焦磷酸），冷却分解焦磷酸），冷却分解焦磷酸），冷却分解焦磷酸），冷却用用用用dHdH2 2OO定容定容定容定容/mLmL505050505050混匀混匀混匀混匀7 7第7页，本讲稿共14页2.定磷标准曲线的制定（每人做一份）（每人做一份）每人取每人取1818支试管，按照下表平行操作：支试管，按照下表平行操作：1122334 45566标准磷溶液标准磷溶液标准磷溶液标准磷溶液/mLmL0 00.10.10.20.20.30.30.40.40.50.5dHdH2 2O/mLO/mL1.51.51.41.41.31.31.21.21.11.11.01.0定磷试剂定磷试

9、剂定磷试剂定磷试剂/mLmL1.51.51.51.51.51.51.51.51.51.51.51.5用漩涡混合器混匀，用漩涡混合器混匀，用漩涡混合器混匀，用漩涡混合器混匀，4545恒温水浴保温恒温水浴保温恒温水浴保温恒温水浴保温2525分钟分钟分钟分钟 用去离子水作为空白，用去离子水作为空白，用去离子水作为空白，用去离子水作为空白，660nm660nm测定吸光值测定吸光值测定吸光值测定吸光值A A660660(1)(1)A A660660(2)(2)A A660660平均值平均值平均值平均值 A A660660平均值平均值平均值平均值空白空白空白空白 0 08 8第8页，本讲稿共14页 3.测

10、定总磷量和回收率（与（与2 2同时进行）同时进行）7 7（空白）（空白）（空白）（空白）88（样品）（样品）（样品）（样品）9 9（标准）（标准）（标准）（标准）定容溶液定容溶液定容溶液定容溶液/mLmL1.51.51.51.50.150.15dHdH2 2O/mLO/mL0 00 01.351.35定磷试剂定磷试剂定磷试剂定磷试剂/mLmL1.51.51.51.51.51.5用漩涡混合器混匀，用漩涡混合器混匀，用漩涡混合器混匀，用漩涡混合器混匀，4545恒温水浴保温恒温水浴保温恒温水浴保温恒温水浴保温2525分钟分钟分钟分钟 A A660660(1)(1)A A660660(2)(2)A A

11、660660平均值平均值平均值平均值 A A660660平均值平均值平均值平均值空白空白空白空白 0 09 9第9页，本讲稿共14页数据处理 关于空白：关于空白：关于空白：关于空白：1616号管用于绘制定磷标准曲线，号管用于绘制定磷标准曲线，号管用于绘制定磷标准曲线，号管用于绘制定磷标准曲线，1 1号管作为空白。号管作为空白。号管作为空白。号管作为空白。7979号管用于样品及回收率的测定，号管用于样品及回收率的测定，号管用于样品及回收率的测定，号管用于样品及回收率的测定，7 7号管作为号管作为号管作为号管作为空白。空白。空白。空白。以每管以每管以每管以每管含磷量含磷量含磷量含磷量(g)(g)为

12、横坐标，吸光值为纵坐标画标为横坐标，吸光值为纵坐标画标为横坐标，吸光值为纵坐标画标为横坐标，吸光值为纵坐标画标准曲线，直线应过原点。准曲线，直线应过原点。准曲线，直线应过原点。准曲线，直线应过原点。在标准曲线上查出样品在标准曲线上查出样品在标准曲线上查出样品在标准曲线上查出样品(x)x)和标准磷和标准磷和标准磷和标准磷(y)y)的含磷量的含磷量的含磷量的含磷量(g)(g)。1010第10页，本讲稿共14页(1)计算回收率：计算回收率：(2)计算样品总磷量：计算样品总磷量：(3)计算计算RNA量：量：(4)样品样品RNA含量：含量：1111第11页，本讲稿共14页操作注意事项1.1.每人每人每人

13、每人独立独立独立独立操作，不允许两人穿插取样；操作，不允许两人穿插取样；操作，不允许两人穿插取样；操作，不允许两人穿插取样；2.2.要求试剂及所有器皿清洁，不含磷；要求试剂及所有器皿清洁，不含磷；要求试剂及所有器皿清洁，不含磷；要求试剂及所有器皿清洁，不含磷；3.3.每管加样和测定均要求平行操作；每管加样和测定均要求平行操作；每管加样和测定均要求平行操作；每管加样和测定均要求平行操作；4.4.消化溶液定容后务必消化溶液定容后务必消化溶液定容后务必消化溶液定容后务必上下颠倒混匀上下颠倒混匀上下颠倒混匀上下颠倒混匀后再取样；后再取样；后再取样；后再取样；5.5.各各各各种种种种试试试试剂剂剂剂必必

14、必必须须须须用用用用移移移移液液液液管管管管按按按按顺顺顺顺序序序序准准准准确确确确量量量量取取取取，移移移移液液液液管管管管口口口口用用用用吸吸吸吸水水水水纸纸纸纸擦擦擦擦净净净净，溶液尽量加到试管下部，标准溶液要求用溶液尽量加到试管下部，标准溶液要求用溶液尽量加到试管下部，标准溶液要求用溶液尽量加到试管下部，标准溶液要求用差量法差量法差量法差量法。6.6.漩涡混合器的使用：用点动档，试管竖直或稍倾斜漩涡混合器的使用：用点动档，试管竖直或稍倾斜漩涡混合器的使用：用点动档，试管竖直或稍倾斜漩涡混合器的使用：用点动档，试管竖直或稍倾斜垂直向下垂直向下垂直向下垂直向下用力。用力。用力。用力。7.7

15、.测测测测定定定定吸吸吸吸光光光光值值值值时时时时，用用用用一一一一个个个个比比比比色色色色杯杯杯杯装装装装去去去去离离离离子子子子水水水水调调调调节节节节分分分分光光光光光光光光度度度度计计计计零零零零点点点点，另另另另一一一一个个个个比比比比色色色色杯杯杯杯按按按按照照照照从从从从低低低低浓浓浓浓度度度度到到到到高高高高浓浓浓浓度度度度的的的的顺顺顺顺序序序序测测测测定定定定，不不不不用用用用润润润润洗洗洗洗，切忌甩比色杯，将蓝色溶液撒在仪器和地面上。切忌甩比色杯，将蓝色溶液撒在仪器和地面上。切忌甩比色杯，将蓝色溶液撒在仪器和地面上。切忌甩比色杯，将蓝色溶液撒在仪器和地面上。1212第12页，本讲稿共14页思考题1.回收率的意义；回收率的意义；2.实验所用的水质、试剂质量、定磷试剂的实验所用的水质、试剂质量、定磷试剂的酸度对测定结果的影响。酸度对测定结果的影响。1313第13页，本讲稿共14页实验结束将试管洗净，斜插在试管架上，放在台将试管洗净，斜插在试管架上，放在台面上。面上。将消化管和橡皮塞洗净，放回原处。将消化管和橡皮塞洗净，放回原处。将比色杯洗净，放在实验台上的小平皿将比色杯洗净，放在实验台上的小平皿中。中。将实验台面擦干净。将实验台面擦干净。1414第14页，本讲稿共14页