现代分析测试技术分子发光分析法精.ppt

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1、现代分析测试技术分子发光分析法第1页，本讲稿共66页16.1 分子发光分析概述分子发光分析概述16.2 荧光和磷光分析基本原理荧光和磷光分析基本原理16.3 荧光和磷光分析法的特点与应用荧光和磷光分析法的特点与应用16.4 化学发光分析化学发光分析本章目录本章目录2第2页，本讲稿共66页 基态分子吸收一定能量后，跃迁至激发态，当基态分子吸收一定能量后，跃迁至激发态，当激发态激发态分子以分子以辐射辐射跃迁形式将其能量释放返回跃迁形式将其能量释放返回基态基态时，便产生时，便产生分子发光分子发光（Molecular Luminescence）。）。在此基础上建立起来的分析方法为在此基础上建立起来的分

2、析方法为在此基础上建立起来的分析方法为在此基础上建立起来的分析方法为分子发光分析法分子发光分析法分子发光分析法分子发光分析法。光致发光：以光致发光：以光源光源来激发而发光来激发而发光 热致发光热致发光:电致发光：以电致发光：以电能电能来激发而发光来激发而发光原子发射光谱法原子发射光谱法 生物发光：以生物发光：以生物体生物体释放的能量激发而发光释放的能量激发而发光 化学发光：以化学发光：以化学反应能化学反应能激发而发光激发而发光化学发光分析法化学发光分析法荧光荧光荧光分析法荧光分析法磷光磷光磷光分析法磷光分析法3第3页，本讲稿共66页16.2 荧光和磷光分析基本原理荧光和磷光分析基本原理一、背景

3、知识一、背景知识大多数分子含有偶数电子，根据Pauli 不相容原理不相容原理，每个轨道上最多容纳2个自旋方向相反的电子，即ms=+1/2或1/2，同一轨道上两电子自旋量子数的代数和S为零。电子激发态的多重度：M=2S+1：当S0时，即M=2S11，称为单重态当S1时，即M=2S13，称为三重态大多数基态分子处于单重态，表示为S0（基态单重态）S1、S2、S3分别代表第一、二、三激发单重态T1、T2、T3分别表示第一、二、三激发三重态4第4页，本讲稿共66页激发态激发态基态基态基态单重态S0激发单重态S1激发三重态T1注：注：1、由基态激发单重态，电子自旋方向没有改变，净自旋=0，单重态有抗磁性

4、；2、由基态激发三重态，电子自旋方向发生改变，净自旋0，三重态有顺磁性。这种S0T1的跃迁为禁阻跃迁。3、多数分子含有偶数电子，分子的电子基态多为单重态；没有基态三重态。4、E(S1)E(T1)。当物质受光照射时，基态分子吸收光能产生电子能级跃迁：自旋平行自旋平行5第5页，本讲稿共66页二、荧光与磷光的产生二、荧光与磷光的产生电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐射跃迁(发光)和无辐射跃迁等方式失去能量：无辐射跃迁传递途径传递途径辐射跃迁荧光F磷光P体系间窜跃isc内转移ic振动弛豫VR6第6页，本讲稿共66页S2S0S1T1211、振动弛豫、振动弛豫(Vibrational Rela

5、xation,VR)：同一电子能级内以热能量交换形式由高振动能级至低相邻振动能级间的跃迁。发生振动弛豫的时间10-12-10-14s。7第7页，本讲稿共66页2、内转移、内转移(Internal Conversion,IC)：相同多重态的两个电子能级之间（如S2S1,S1S0）的非辐射跃迁非辐射跃迁。S2S0S1T1218第8页，本讲稿共66页 内转移内转移的特点的特点（1）无辐射；）无辐射；（2）内转化的速率取决于能级差：内转化的速率取决于能级差：（3）分子无论被激发到哪一个电子激发态，在）分子无论被激发到哪一个电子激发态，在10-1310-11 s内经内经内转移和内转移和振动弛豫振动弛豫都

6、会跃迁到都会跃迁到第一第一（最低）最低）电子激发态的最低振动能级电子激发态的最低振动能级；9相邻单重激发态能级接近，其振动能级常重叠，内转化的速率快；S1S0因能量差大，内转化的速率慢，寿命长。第9页，本讲稿共66页S2S0S1T121 3 3荧光发射荧光发射3、荧荧光光(Fluorescence)：处于第一激发单重态的最低振动能级的分子以辐射跃迁的形式返回基态各振动能级(S1S0跃迁)时，产生荧光。10第10页，本讲稿共66页荧光荧光的特点：的特点：（1）无论开始电子被激发至什么高能级，它都经过无辐射跃迁到S1的最低振动能级，发射荧光，荧光波长比激发光波长长。荧荧 激激（2）荧光是相同多重态

7、间的允许跃迁，产生速度快，10-910-6s，又叫快速荧光或瞬时荧光，外部光源停止照射，荧光马上熄灭。11第11页，本讲稿共66页4S2系间窜跃S0S1T1214、系间窜跃、系间窜跃(Intersystem Conversion,ISC)：不同多重态，有重叠的转动能级间的非辐射跃迁S1（最低振动能级）T1（较高振动能级）跃迁。经振动弛豫，跃迁至第一电子激发态的最低振动能级。12第12页，本讲稿共66页磷光发射磷光发射5、磷光发射、磷光发射(Phosphorescence)：当受激电子降到S1的最低振动能级后，未发射荧光，而是经过系间窜跃到T1振动能级，经振动驰豫到T1最低振动能级，从T1最低振

8、动能级回到基态能级所发射的光叫磷光（T1S0跃迁）。134S2S0S1T121ISC第13页，本讲稿共66页磷光特点磷光特点：（1）由于改变电子自旋属禁阻跃迁，因而跃跃迁迁速速率率慢慢，持续时间长10-410s；光照停止后，可持续一段时间。（2）从T1也有回到S1，然后S1到S0发出荧光，叫延迟荧光。14S0S1T121S2延迟荧光延迟荧光 3 3第14页，本讲稿共66页6、外外转转移移(External Conversion,EC)：指受激分子与溶剂或其它分子的相互作用及能量转移，使荧光或磷光强度减弱或消失的过程（熄灭或淬灭quenching）。15第15页，本讲稿共66页辐射能量传递过程荧

9、光:第一激发单重态S1基态S0磷光:第一激发三重态T1基态S016非辐射能量传递过程振动弛豫内转换外转换系间窜越1）T1的能量低于S1，因此磷光辐射的波长比荧光更长。2）三重态T1向基态S0的跃迁属于自旋禁阻，跃迁速率小，使之稳定性大，因而磷光（寿命10-610-9s），比荧光（寿命10-410s）有长得多的寿命。3）激发态停留时间短、返回速度快的途径，发生的几率大，发光强度相对大，因此荧光比磷光发光强度相对大。荧光和磷光的比较：荧光和磷光的比较：第16页，本讲稿共66页S2S1S0T1吸吸收收发发射射荧荧光光发发射射磷磷光光系间窜越内转换振动弛豫能量 2 1 4外转换 3T2内转换振动弛豫1

10、7第17页，本讲稿共66页三、荧光效率及其影响因素三、荧光效率及其影响因素1、荧光效率：、荧光效率：物质吸收了紫外可见光后，跃迁至激发态，激发态分子是以辐射跃迁还是以非辐射跃迁，决定了物质能否发荧光。定义：发荧光的分子数目与激发态分子总数的比值。即：以各种跃迁的速率常数表示：kf荧光发射过程的速率常数；主要取决于分子结构ki非辐射跃迁过程的速率常数之和，主要取决于化学环境，也与化学结，也与化学结构有关。构有关。f f 是一个物质荧光特性的重要参数，反映了荧光物质发射荧光的能力，是一个物质荧光特性的重要参数，反映了荧光物质发射荧光的能力，是一个物质荧光特性的重要参数，反映了荧光物质发射荧光的能力

11、，是一个物质荧光特性的重要参数，反映了荧光物质发射荧光的能力，f f 越大，荧光越强，在越大，荧光越强，在越大，荧光越强，在越大，荧光越强，在0101之间。之间。之间。之间。发荧光的分子数激发态分子总数荧光效率荧光效率f=18第18页，本讲稿共66页 分子产生荧光必须具备两个条件：分子必须具有与所照射的辐射频率相适应的结构,才能吸收激发光；吸收了与其本身特征频率相同的能量之后，必须具有一定的荧光量子产率。19第19页，本讲稿共66页2、荧（磷）光与分子结构的关系、荧（磷）光与分子结构的关系(1)跃迁类型跃迁类型大多数荧光物质首先吸收紫外可见光，产生*，n*跃迁激发，经过非辐射跃迁，再发生*，*

12、n跃迁产生荧光。*与n*跃迁相比，摩尔吸收系数大102103倍，寿命短。*跃迁常产生较强的荧光跃迁常产生较强的荧光，n*跃迁产生的荧光弱，但可产生系间窜跃，产生更强的磷光。20第20页，本讲稿共66页(2)共轭双键体系共轭双键体系有较强的荧光有较强的荧光 分子中必须含有共轭双键；共共轭轭体体系系越越大大，p电电子子的的离离域域性性越越强强，越越易易被被激激发发而而生生荧荧光光（荧荧光光效效率率高高）且且荧荧光光峰峰向向长长波波方方向向移移动动。芳香族化合物易产生荧光，注意：能够发荧光的脂肪族和脂环族化合物极少。Ff:0.29；f：310nmFf:0.46；f：400nm21第21页，本讲稿共6

13、6页再如：再如：Ff:0.28Ff:0.68共轭体系增加，荧光效率增大！22第22页，本讲稿共66页(3)荧荧光光物物质质的的刚刚性性和和共共平平面面性性增增加加，可使分子与溶剂或其它溶质分子的相互作用减小（即外转移能量损失减小），有利于荧光发射。例例1：Ff:0.20Ff:1.0Fluorene（芴）23第23页，本讲稿共66页24荧光素：氧桥把两个环固定在一荧光素：氧桥把两个环固定在一个平面上，具有平面结构，强荧个平面上，具有平面结构，强荧光物质光物质酚酞：无氧桥把两个环固定，酚酞：无氧桥把两个环固定，不能很好的共平面，为非荧光不能很好的共平面，为非荧光物质物质例例2第24页，本讲稿共66

14、页红色荧光红色荧光滂铬滂铬BBR，无荧光，无荧光例例3：25第25页，本讲稿共66页立体异构现象立体异构现象反式：平面构型反式：平面构型 强荧光体强荧光体顺式：非平面构型顺式：非平面构型 非荧光体非荧光体26第26页，本讲稿共66页27(4)取代基效应取代基效应取代基对物质的荧光特征和强度也有很大影响。分成三类：取代基对物质的荧光特征和强度也有很大影响。分成三类：a.增强荧光的取代基增强荧光的取代基 有-OH、-OR、-NH2、-NHR、-NR2等给给电子基团电子基团。由于基团的n电子（孤对电子）的电子云与苯环上的轨道平行，共享了共轭电子，扩大了共轭体系，使荧光波长长移，荧光强度增强。第27页

15、，本讲稿共66页28b.减弱荧光的取代基减弱荧光的取代基-COOH、-NO2、-COOR、-NO、-SH吸电子基团吸电子基团，使荧光波长短移，荧光强度减弱 芳环上被F、Cl、Br、I 取代后，使系间窜跃加强，磷光增强，荧光减弱。其荧光强度随卤素原子量增加而减弱，磷光相应增强，这种效应为重原子效应重原子效应。c.影响不明显的取代基影响不明显的取代基 -NH3+、-R、SO3H等d.取代基的空间位阻取代基的空间位阻对荧光也有影响，荧光减弱。第28页，本讲稿共66页29(5)金属螯合物的荧光金属螯合物的荧光大多数无机盐类金属离子，不能产生荧光，但某些螯合物都能产生很强的荧光，可用于痕量金属离子的测定

16、。不少有机配体是弱荧光体或不发荧光，但与Mn+形成螯合物后变为平面构型，就会使荧光加强或产生荧光。例：8-羟基喹啉为弱荧光体，与Mn+Al3+、Mg2+形成螯合物后，能形成刚性结构，荧光加强第29页，本讲稿共66页3、环境因素对荧光的影响、环境因素对荧光的影响(1)溶溶剂剂的的极极性性：电子激发态比基态的极性大，溶剂的极性增强，对激发态会产生更大稳定作用，使荧光强度增大，荧光波长红移。溶剂相对介电常数荧光峰/nm荧光效率乙腈38.84100.064丙酮21.54050.055氯仿5.23980.041四氯化碳2.243900.002巯基喹啉在不同溶剂中的荧光峰和荧光效率巯基喹啉在不同溶剂中的荧

17、光峰和荧光效率30第30页，本讲稿共66页(2)温温度度：温度升高，辐射跃迁的速率常数Kf基本不变，但非辐射跃迁的速率常数增大，故荧光效率降低。对磷光影响更大。(3)pH值值：含酸性或碱性取代基的化合物荧光性质受pH的影响。如：如：无荧光无荧光蓝色荧光蓝色荧光31pH的影响也体现为对发光体的电子构型的影响。第31页，本讲稿共66页再如：再如：无荧光无荧光蓝色荧光蓝色荧光32第32页，本讲稿共66页(4)表表面面活活性性剂剂：使荧光物质处于更有序的胶束微环境中，对处于激发单重态的荧光物质分子起保护作用，减小非辐射跃迁几率，提高荧光效率。(5)O2的的存存在在：O2为顺磁性分子，溶液中溶解氧的存在

18、，使激发单重态分子向三重态的系间窜跃速率加大，导致荧光效率降低，甚至熄灭。其它顺磁性物质也有这种作用。33第33页，本讲稿共66页4、磷光强度影响因素、磷光强度影响因素(1)随着温度的降低分子热运动速率减慢，磷光逐渐增强随着温度的降低分子热运动速率减慢，磷光逐渐增强(2)重原子效应可以提高磷光物质的磷光强度重原子效应可以提高磷光物质的磷光强度(3)室温磷光当向溶液中加入适当的表面活性剂时，由于形成了表面活性剂胶束，改变了磷光物质的微环境，增强了定向约束力，从而减少了磷光分子与溶剂分子的碰撞概率，增加了三重态的稳定性，导致磷光强度显著增大，称此为胶束增稳室温磷光。当磷光物质吸附于某些固体表面时，

19、分子的刚性增加，三重态的碰撞去活化概率大大减小，也可在室温下产生较强的磷光，由此又产生了固体表面室温磷光分析法。34第34页，本讲稿共66页四、荧光（磷光）强度与溶液浓度的关系四、荧光（磷光）强度与溶液浓度的关系相应的吸光分数为：相应的吸光分数为：荧光强度（荧光强度（IF）与相应的吸光分数成正比：）与相应的吸光分数成正比：按照级数展开式：按照级数展开式：35吸收光强度吸收光强度 Ia=第35页，本讲稿共66页对于对于稀溶液稀溶液，当，当 bc0.05（磷光（磷光 bc C*+D C*+E E*+C E*E+h 例例第51页，本讲稿共66页四、化学发光效率和发光强度四、化学发光效率和发光强度激发

20、态分子的化激发态分子的化学反应效率：学反应效率：激发态分子的发激发态分子的发光效率：光效率：化学发光效率：化学发光效率：52比一般的荧光发光效率多一项：激发态分析的化学反应效率比一般的荧光发光效率多一项：激发态分析的化学反应效率第52页，本讲稿共66页由于化学发光强度随着时间和反应物消耗的变化逐渐减小，对于一级动力学反应：Icl(t)与该时刻分析浓度c成正比。化学发光分析中常用发光总强度进行定量分析发光总强度进行定量分析，将上式积分：即发光总强度与被测物分析浓度成正比即发光总强度与被测物分析浓度成正比定量分析依据定量分析依据化学发光强度Icl与反应速率有如下关系：（dc/dt：分析物参加反应的

21、速率）53第53页，本讲稿共66页六、化学发光反应的类型六、化学发光反应的类型按反应体系的状态分类，如化学发光反应在气相中进行称为气相化学发光；在液相或固相中进行称为液相或固相化学发光；在两个不同相中进行则称为异相化学发光。1、气相化学发光、气相化学发光主要有O3、NO、S的化学发光反应，可用于监测空气中的可用于监测空气中的O3、NO、SO2、H2S、CO、NO2等等。例如：NOO3NO2*O2NO2*NO2hv（600nm)COOCO2*CO2*CO2hv（=300-500nm，灵敏度可测至1ppb)灵敏度可达1ngmL-1测定范围0.0110000gmL-154第54页，本讲稿共66页2、

22、液相化学发光、液相化学发光 用于此类化学发光分析的发光物质有鲁米诺（luminol)、光泽精、没食子酸、洛粉碱、过氧草酸盐等。鲁米诺（3氨基苯二甲酰环肼）是最常用的发光试剂，它可以测定它可以测定Cl2、I2、HOCl、OCl-、H2O2、O2和和NO2，产生化学发光反应时量子效率为0.010.05。鲁米诺在碱性溶液中和H2O2等氧化剂反应生成最大波长为425nm的光辐射。反应产生的化学能被产物氨基邻苯二甲酸根吸收，处于激发状态，返回基态时发射荧光可检测低至10-9molL-1的H2O255第55页，本讲稿共66页max=425nm氧化剂:H2O2O2KMnO4NaClOI2Fe(CN)63-.

23、与过氧化氢的反应可被催化:过氧化酶氧化血红素过渡金属离子(Co2+、Cu2+、Fe3+、Ni、Cr、Ag、Mn、Hg、Os、Ru、Ir、Rh、Vetc.)利用luminol与过氧化氢的反应可测酶促反应的底物，如葡萄糖等。56第56页，本讲稿共66页光泽精光泽精(lucigenin)max=440 nm(绿色绿色)氧化剂氧化剂:H2O2 57第57页，本讲稿共66页四、化学发光分析的仪器（自学）四、化学发光分析的仪器（自学）分立式化学发光分析仪：静态方式具有简单，灵敏度高的特点；但手工进样重复性差，测量精密度不高;难于实现自动化，分离效率也低；试样量小。流动注射式仪器：用蠕动泵分别将试剂连续送入

24、混合器，用进样阀注射样品，定时通过测量室，连续发光，测定光强度；试样量大。装置流程：发光反应室发光反应室光检测器光检测器信号放大器信号放大器显示与记录显示与记录58第58页，本讲稿共66页五、化学发光分析的应用五、化学发光分析的应用气相化学发光已广泛的应用于大气中广泛的应用于大气中O2、NO、NO2、H2S、SO2、CO等组分的监测等组分的监测，目前已有各种专用的监测仪器。鲁米诺-H2O2化学发光反应能被许多过渡金属离子所催化，利用这一性质，已建立许多金属离子的化学发光分析法金属离子的化学发光分析法。鲁米诺-H2O2体系也用于化学发光法测定许多生化物质。59第59页，本讲稿共66页1.分子荧光

25、光谱中，发射光谱与激发波长的关系无关，激发光谱方法的形状_与吸收光谱的形状相似_,并与发射光谱互为_。（北师大2002年）2.物质分子在吸收光辐射后产生磷光，经历内部转换，_和 三个过程。（南开大学2002年）考研真题考研真题60镜像对称 系间窜越 振动弛豫 第60页，本讲稿共66页3.分子荧光与化学发光均为第一激发态的最低振动能级跃迁至基态中各振动能级产生的光辐射，它们的主要区别在于（）A分子的电子层不同B无辐射弛豫的途径不同C产生的光辐射的能源不同D跃迁至基态中的振动能级不同（南开大学2002年）4.下列那种化合物的荧光量子产率可能最大：（）(A)(B)(C)(D)（郑州大学2002年）6

26、1第61页，本讲稿共66页5.下列说法中错误的是()A荧光和磷光都是发射光谱B磷光发射发生在三重态C磷光强度IP与浓度C的关系与荧光一致D磷光光谱与最低激发三重态的吸收带之间存在着镜像关系626.分子荧光分析中，含重原子（如Br和I）的分子易发生：()A振动弛豫B内部转换C体系间窜跃D荧光发射重原子效应，磷光增强 第62页，本讲稿共66页7.下列说法正确的是()A分子的刚性平面有利于荧光的产生B磷光辐射的波长比荧光短C磷光比荧光的寿命短D荧光猝灭是指荧光完全消失638.用能级图的形式表示分子荧光、分子磷光产生的历程。（南开大学2003年）第63页，本讲稿共66页作业作业 1、解释名词：、解释名

27、词：振动弛豫、内转换、外转换、系间窜越、猝灭效应、重原子振动弛豫、内转换、外转换、系间窜越、猝灭效应、重原子效应效应2、简述影响荧光效率的因素。、简述影响荧光效率的因素。3、荧光激发光谱、荧光发射光谱？它们的关系？、荧光激发光谱、荧光发射光谱？它们的关系？4、试从原理和仪器两方面比较荧光、磷光和化学发光分析法。、试从原理和仪器两方面比较荧光、磷光和化学发光分析法。5、化学发光要满足哪些条件？、化学发光要满足哪些条件？64第64页，本讲稿共66页End!End!65第65页，本讲稿共66页分子发光分析法思考题分子发光分析法思考题1、解释名词：振动弛豫、内转换、外转换、系间窜越、猝、解释名词：振动

28、弛豫、内转换、外转换、系间窜越、猝灭效应、重原子效应、荧光激发光谱、荧光发射光谱灭效应、重原子效应、荧光激发光谱、荧光发射光谱2、荧光与磷光的比较。、荧光与磷光的比较。3、简述影响荧光效率的因素。、简述影响荧光效率的因素。4、采取哪些措施可使室温下有较大的磷光效率？、采取哪些措施可使室温下有较大的磷光效率？5、试从原理和仪器两方面比较吸光光度法和荧光分析法的、试从原理和仪器两方面比较吸光光度法和荧光分析法的异同。异同。6、试从原理和仪器两方面比较荧光、磷光和化学发光、试从原理和仪器两方面比较荧光、磷光和化学发光分析法。分析法。7、化学发光要满足那些条件？、化学发光要满足那些条件？66第66页，本讲稿共66页