第11章 高效液相色谱法精.ppt

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1、第11章 高效液相色谱法第1页，本讲稿共53页2022/12/32022/12/311.1 11.1 高效液相色谱法概述高效液相色谱法概述 feature of HPLC 11.1.1 11.1.1 发展和特点：高压、高效、高速、高灵敏度发展和特点：高压、高效、高速、高灵敏度发展和特点：高压、高效、高速、高灵敏度发展和特点：高压、高效、高速、高灵敏度 高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。第2页，本讲稿共53页2022/12/3202

2、2/12/3（1）高压。液在现代液相色谱法中流动相的柱前压力可达150350105Pa，这对于输送高压液体的泵、色谱柱、色谱填料（色谱固定相）及整个流路系统的耐压指标都提出了很高的要求。（2）高速。流速一般可达110mLmin-1，使得高效液相色谱法所需的分析时间比经典液体柱色谱法少的多，一般都少于1h，而若采用经典色谱法，则往往需要十几个小时。（3）高效。约达3万块塔板/米，而气相色谱的分离效能则一般仅为2 000块塔板/米。（4）高灵敏度。采用高灵敏度的检测器，如荧光检测器的灵敏度可达10-11g，微升数量级的试样就足以进行分析，极大地减少了分析时所需试样量。第3页，本讲稿共53页2022

3、/12/32022/12/311.1.3 高效液相色谱与气相色谱法的比较高效液相色谱与气相色谱法的比较1.HPLC与与GC的共同点的共同点（1）气相色谱的理论基本上也适用于高效液相色谱。（2）定性、定量的原理和方法完全一样。（3）一样可与其他分析仪器联用.2.HPLC与与GC的不同点的不同点（1）分析对象。对于高沸点、热稳定性差、相对分子质量大、难气化的有机物），原则上都可用高效液相色谱法来进行分离、分析。对于要求柱效达10万块理论塔板数以上的、组成复杂的石油样品，受热易分解、变性的生物活性样品，只能应用高效液相色谱法进行分析，而不能使用气相色谱法进行分析。第4页，本讲稿共53页2022/12

4、/32022/12/3（2）流动相。气相色谱的流动相为气体，主要起携带组分流经色谱柱的作用，待分离组分几乎不与流动相发生相互作用。对于高效液相色谱而言，流动相的种类较多且选择余地广，组分与流动相有相互作用，流动相的极性、pH等的选择也会对分离起重要作用，可选用两种或两种以上液体作为流动相，从而为提高柱的选择性、改善分离度增加了可调控条件。（3）操作条件及仪器结构。气相色谱通常采用程序升温或者恒温加热的操作方式实现不同物质的分离，而高效液相色谱则通常在室温下采取高压高压的操作方式以克服液体流动相带来的高阻力。与之相适应，高效液相色谱仪的色谱柱通常不需用恒温箱，而且为了提高分离效果，常配有梯度洗脱

5、梯度洗脱装置。第5页，本讲稿共53页2022/12/32022/12/3一、一、影响分离的因素影响分离的因素factors influenced separation二、二、液相色谱的柱液相色谱的柱外展宽外展宽11.211.211.211.2影响液相色谱柱效能的影响液相色谱柱效能的影响液相色谱柱效能的影响液相色谱柱效能的因素因素因素因素 factors influenced separation and factors influenced separation and choice of operation conditionchoice of operation condition第6页，

6、本讲稿共53页2022/12/32022/12/3一、一、影响分离的因素影响分离的因素 factors influenced separation1.1.影响分离的因素与提高柱效的途径影响分离的因素与提高柱效的途径 在在高高效效液液相相色色谱谱中中,液液体体的的扩扩散散系系数数仅仅为为气气体体的的万万分分之之一一，则速率方程中的分子扩散项则速率方程中的分子扩散项B/UB/U较小，可以忽略不计，即：较小，可以忽略不计，即：H=A+C uH=A+C u 故液相色谱故液相色谱H-uH-u曲线与气相色谱的形状不同，如图所示。曲线与气相色谱的形状不同，如图所示。第7页，本讲稿共53页2022/12/32

7、022/12/3 液液体体的的黏黏度度比比气气体体大大一一百百倍倍，密密度度为为气气体体的的一一千千倍倍，故故降低传质阻力是提高柱效主要途径。降低传质阻力是提高柱效主要途径。由速率方程，降低固定相粒度可提高柱效。由速率方程，降低固定相粒度可提高柱效。液相色谱中，不可能通过液相色谱中，不可能通过增加柱温来改善传质。恒温增加柱温来改善传质。恒温 改变淋洗液组成、极性是改变淋洗液组成、极性是改善分离的最直接的因素。改善分离的最直接的因素。第8页，本讲稿共53页2022/12/32022/12/3讨论：与气相色谱法的速率方程式一致，只是影响柱效的主要因素是传质项，而纵向扩散项可忽略不计。要提高液相色谱

8、的分离效率，必须提高柱内填料装填的均匀性、减小粒度、使用低黏度的流动相或适当提高柱温以降低流动相黏度，从而加快传质速率，其中减小粒度是提高柱效的最有效途径。必须注意到，提高柱温将降低色谱峰分辨率，减小流动相的流速虽然可以降低传质阻力项的影响，但却会使纵向扩散增加并延长分析时间。色谱分析过程是一个复杂的过程，各种因素相互影响又互相制约。第9页，本讲稿共53页2022/12/32022/12/3 2.2.流速流速 流速大于流速大于0.5 0.5 cm/scm/s时时,H Hu u曲线是一段斜率不大的直线。曲线是一段斜率不大的直线。降低流速，柱效提高不是很大。降低流速，柱效提高不是很大。但在实际操作

9、中，流量仍是一但在实际操作中，流量仍是一个调整分离度和出峰时间的重个调整分离度和出峰时间的重要可选择参数。要可选择参数。3.3.3.3.固定相及分离柱固定相及分离柱固定相及分离柱固定相及分离柱 气相色谱中的固定液原则上都可以用于液相色谱，其气相色谱中的固定液原则上都可以用于液相色谱，其选用原则与气相色谱一样。但在高效液相色谱中，分离柱选用原则与气相色谱一样。但在高效液相色谱中，分离柱的制备是一项技术要求非常高的工作，一般很少自行制备。的制备是一项技术要求非常高的工作，一般很少自行制备。第10页，本讲稿共53页2022/12/32022/12/311.2.2 液相色谱的柱外展宽液相色谱的柱外展宽

10、柱外展宽是指色谱柱外各种因素引起的峰扩展。可分为柱前和柱后两种因素。柱前峰展宽主要由进样进样所引起。将试样注入到色谱柱顶端滤塞上或注入到进样器的液流中时，进样器的死体积，以及进样时液流扰动引起的扩展将造成色谱峰的不对称和展宽。若将试样直接注入到色谱柱顶端填料上的中心点，或注入到填料中心之内12mm处，则可减少试样在柱前的扩散，峰的不对称性得到改善，柱效显著提高。柱后展宽主要由接管、检测器流通池体积所引起。由于分子在液体中有较低的扩散系数，因此在液相色谱法中，这个因素要比在气相色谱中更为显著。为此，连接管的体积、检测器的死体积应尽可能地小。第11页，本讲稿共53页2022/12/32022/12

11、/311.3 高效液相色谱法高效液相色谱法主要主要类型与分离原理类型与分离原理一、液一、液-固吸附色谱固吸附色谱liquid-solid adsorption chromatograph二、液二、液-液分配色谱液分配色谱liquid-liquid partition chromatograph三、离子交换色谱三、离子交换色谱ion-exchange chromatograph四、离子色谱四、离子色谱ion chromatograph五、离子对色谱五、离子对色谱ion-pair chromatograph六、排阻色谱六、排阻色谱size-exclusion chromatograph七、亲和色谱

12、七、亲和色谱(AC)(AC)Affinity chromatograph第12页，本讲稿共53页2022/12/32022/12/3一、一、液液-固吸附色谱固吸附色谱liquid-solid adsorption chromatography 固固固固定定定定相相相相：固固体体吸吸附附剂剂为为，如如硅硅胶胶、氧氧化化铝铝等等，较较常常使使用的是用的是5 51010mm的硅胶吸附剂；的硅胶吸附剂；流动相流动相流动相流动相：各种不同极性的一元或多元溶剂。：各种不同极性的一元或多元溶剂。基本原理基本原理基本原理基本原理：组分在固定相吸附剂上的吸附与解吸；：组分在固定相吸附剂上的吸附与解吸；适适用用于

13、于分分离离相相对对分分子子质质量量中中等等的的油油溶溶性性试试样样，对对具具有有官能团的化合物和异构体有较高选择性；官能团的化合物和异构体有较高选择性；缺点缺点缺点缺点：非线形等温吸附常引起峰的拖尾；：非线形等温吸附常引起峰的拖尾；第13页，本讲稿共53页2022/12/32022/12/3二、二、液液-液分配色谱液分配色谱liquid-liquid partition chromatography 固定相与流动相均为液体（互不相溶）；固定相与流动相均为液体（互不相溶）；基本原理基本原理基本原理基本原理：组分在固定相和流动相上的分配；：组分在固定相和流动相上的分配；流流流流动动动动相相相相：对

14、对于于亲亲水水性性固固定定液液，采采用用疏疏水水性性流流动动相相，即即流流动动相相的的极极性性小小于于固固定定液液的的极极性性（正正正正相相相相 normal normal phasephase），反反之之，流流动动相相的的极极性性大大于于固固定定液液的的极极性性（反反反反相相相相 reverse reverse phasephase）。正正相与反相的出峰顺序相反；相与反相的出峰顺序相反；固定相固定相固定相固定相：早期涂渍固定液，固定液流失，较少采用；：早期涂渍固定液，固定液流失，较少采用；化化化化学学学学键键键键合合合合固固固固定定定定相相相相：（将将各各种种不不同同基基团团通通过过化化学学

15、反反应应键键合合到硅胶（担体）表面的游离羟基上。到硅胶（担体）表面的游离羟基上。C-18C-18柱（反相柱）。柱（反相柱）。第14页，本讲稿共53页2022/12/32022/12/3三、三、离子交换色谱离子交换色谱ion-exchange chromatography 固定相固定相固定相固定相：阴离子离子交换树脂或阳离子离子交换树脂；：阴离子离子交换树脂或阳离子离子交换树脂；流流流流动动动动相相相相：阴阴离离子子离离子子交交换换树树脂脂作作固固定定相相，采采用用酸酸性性水水溶溶液；阳离子离子交换树脂作固定相，采用碱性水溶液；液；阳离子离子交换树脂作固定相，采用碱性水溶液；基基基基本本本本原原

16、原原理理理理：组组分分在在固固定定相相上上发发生生的的反反复复离离子子交交换换反反应应；组组分分与与离离子子交交换换剂剂之之间间亲亲和和力力的的大大小小与与离离子子半半径径、电电荷荷、存存在形式等有关。亲和力大，保留时间长；在形式等有关。亲和力大，保留时间长；阳离子交换：阳离子交换：RSORSO3 3H +MH +M+=RSO =RSO3 3 M +H M +H+阴离子交换：阴离子交换：RNRRNR4 4OH +XOH +X-=RNR =RNR4 4 X+OHX+OH-应用应用应用应用：离子及可离解的化合物，氨基酸、核酸等。：离子及可离解的化合物，氨基酸、核酸等。第15页，本讲稿共53页202

17、2/12/32022/12/3四、四、离子色谱离子色谱ion chromatography 离离子子色色谱谱是是在在2020世世纪纪7070年年代代中中期期发发展展起起来来的的一一中中技技术术，其其与与离离子子交交换换色色谱谱的的区区别别是是其其采采用用了了特特制制的的、具具有有极极低低交交换换容容量量的的离离子子交交换换树树脂脂作作为为柱柱填填料料，并并采采用用淋淋洗洗液液抑抑制制技技术术和和电导检测器，是测定混合阴离子的有效方法。电导检测器，是测定混合阴离子的有效方法。第16页，本讲稿共53页2022/12/32022/12/3五、五、离子对色谱离子对色谱ion pair chromato

18、graphy 原原原原理理理理：将将一一种种（或或多多种种）与与溶溶质质离离子子电电荷荷相相反反的的离离子子（对对离离子子或或反反离离子子）加加到到流流动动相相中中使使其其与与溶溶质质离离子子结结合合形形成成疏水性离子对化合物，使其能够在两相之间进行分配；疏水性离子对化合物，使其能够在两相之间进行分配；阴阴阴阴离离离离子子子子分分分分离离离离：常常采采用用烷烷基基铵铵类类，如如氢氢氧氧化化四四丁丁基基铵铵或或氢氢氧化十六烷基三甲铵作为对离子；氧化十六烷基三甲铵作为对离子；阳阳阳阳离离离离子子子子分分分分离离离离：常常采采用用烷烷基基磺磺酸酸类类，如如己己烷烷磺磺酸酸钠钠作作为为对对离子；离子；

19、反反反反相相相相离离离离子子子子对对对对色色色色谱谱谱谱：非非极极性性的的疏疏水水固固定定相相(C-18C-18柱柱)，含含有有对对离离子子Y Y+的的甲甲醇醇-水水或或乙乙腈腈-水水作作为为流流动动相相，试试样样离离子子X X-进进入入流动相后，生成疏水性离子对流动相后，生成疏水性离子对Y Y+X X-后；在两相间分配。后；在两相间分配。第17页，本讲稿共53页2022/12/32022/12/3六、六、排阻色谱色谱排阻色谱色谱size-exclusion chromatography 固定相固定相固定相固定相：凝胶凝胶(具有一定大小孔隙分布具有一定大小孔隙分布)；原原原原理理理理：按按分分

20、子子大大小小分分离离。小小分分子子可可以以扩扩散散到到凝凝胶胶空空隙隙，由由其其中中通通过过，出出峰峰最最慢慢；中中等等分分子子只只能能通通过过部部分分凝凝胶胶空空隙隙，中中速速通通过过；而而大大分分子子被被排排斥斥在在外外，出出峰峰最最快快；溶溶剂剂分分子子小小，故在最后出峰。故在最后出峰。全部在死体积前出峰；全部在死体积前出峰；可可对对相相对对分分子子质质量量在在100-100-10105 5范围内的化合物按质量分离范围内的化合物按质量分离 第18页，本讲稿共53页2022/12/32022/12/3七、七、亲和色谱亲和色谱(AC)Affinity chromatograph 原原原原理理

21、理理：利利用用生生物物大大分分子子和和固固定定相相表表面面存存在在的的某某种种特特异异性性亲和力，进行选择性分离。亲和力，进行选择性分离。先先在在载载体体表表面面键键合合上上一一种种具具有有一一般般反反应应性性能能的的所所谓谓间间隔隔臂臂(环环氧氧、联联胺胺等等)，再再连连接接上上配配基基(酶酶、抗抗原原等等)，这这种种固固载载化化的的配配基基将将只只能能和和具具有有亲亲和和力力特特性性吸吸附附的的生生物物大大分分子子作作用用而而被被保留。改变淋洗液后洗脱。保留。改变淋洗液后洗脱。第19页，本讲稿共53页2022/12/32022/12/3一、一、液相色谱固定相液相色谱固定相stationar

22、y phase of HPLC二、液相色谱流动相二、液相色谱流动相 mobile phase of HPLC11.411.411.411.4液相色谱的固定相与流液相色谱的固定相与流液相色谱的固定相与流液相色谱的固定相与流动相动相动相动相stationary phase and stationary phase and mobile phase of HPLCmobile phase of HPLC第20页，本讲稿共53页2022/12/32022/12/3一、液相色谱固定相一、液相色谱固定相 stationary phases of LC 1.1.1.1.液液液液-液分配及离子对分离固定相液分

23、配及离子对分离固定相液分配及离子对分离固定相液分配及离子对分离固定相 （1 1）全多孔型担体）全多孔型担体）全多孔型担体）全多孔型担体 由由氧氧化化硅硅、氧氧化化铝铝、硅硅藻藻土土等等制制成成的的多多孔孔球球体体；早早期期采采用用100100mm的大颗粒，表面涂渍固定液，性能不佳已不多见；的大颗粒，表面涂渍固定液，性能不佳已不多见；现采用现采用1010mm以下的小颗粒，化学键合制备柱填料；以下的小颗粒，化学键合制备柱填料；（2 2）表面多孔型担体）表面多孔型担体）表面多孔型担体）表面多孔型担体 （薄壳型微珠担体）（薄壳型微珠担体）30304040mm的的玻玻璃璃微微球球，表表面面附附着着一一层

24、层厚厚度度为为1 1 22mm的多孔硅胶。的多孔硅胶。表面积小，柱容量低；表面积小，柱容量低；第21页，本讲稿共53页2022/12/32022/12/3（3）化学键合固定相）化学键合固定相 化学键合固定相化学键合固定相:目前应用最广、性能最佳的固定相；目前应用最广、性能最佳的固定相；a.a.硅氧碳键型：硅氧碳键型：硅氧碳键型：硅氧碳键型：SiSiOOC C b.b.硅氧硅碳键型：硅氧硅碳键型：硅氧硅碳键型：硅氧硅碳键型：SiSiOOSi Si C C 稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用最广稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用最广稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用最广稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂

25、，应用最广；c.c.硅碳键型：硅碳键型：硅碳键型：硅碳键型：SiSiC C d.d.硅氮键型：硅氮键型：硅氮键型：硅氮键型：SiSiN N第22页，本讲稿共53页2022/12/32022/12/3化学键合固定相的特点化学键合固定相的特点（1 1）传质快传质快传质快传质快，表面无深凹陷，比一般液体固定相传质快；表面无深凹陷，比一般液体固定相传质快；（2 2）寿命长寿命长寿命长寿命长，化学键合，无固定液流失，耐流动相冲击；化学键合，无固定液流失，耐流动相冲击；耐水、耐光、耐有机溶剂，耐水、耐光、耐有机溶剂，稳定稳定；（4 4）选择性好选择性好选择性好选择性好，可键合不同官能团，提高选择性；可键合

26、不同官能团，提高选择性；（5 5）有利于梯度洗脱；有利于梯度洗脱；有利于梯度洗脱；有利于梯度洗脱；存在着存在着存在着存在着双重分离机制双重分离机制双重分离机制双重分离机制：(键合基团的覆盖率决定分离机理键合基团的覆盖率决定分离机理)高覆盖率：分配为主；高覆盖率：分配为主；低覆盖率：吸附为主；低覆盖率：吸附为主；第23页，本讲稿共53页2022/12/32022/12/3 2.2.液液-固吸附分离固定相固吸附分离固定相 种类：硅胶、氧化铝、分子筛、聚酰胺等；种类：硅胶、氧化铝、分子筛、聚酰胺等；种类：硅胶、氧化铝、分子筛、聚酰胺等；种类：硅胶、氧化铝、分子筛、聚酰胺等；结构类型：全多孔型和薄壳型

27、；结构类型：全多孔型和薄壳型；结构类型：全多孔型和薄壳型；结构类型：全多孔型和薄壳型；粒度：粒度：粒度：粒度：5 510 10 mm；第24页，本讲稿共53页2022/12/32022/12/33.3.离子交换色谱分离固定相离子交换色谱分离固定相 结构类别：结构类别：结构类别：结构类别：（1 1）薄壳型离子交换树脂）薄壳型离子交换树脂）薄壳型离子交换树脂）薄壳型离子交换树脂 薄薄壳壳玻玻璃璃珠珠为为担担体体，表表面涂约面涂约1%1%的离子交换树脂；的离子交换树脂；（2 2）离子交换键合固定相）离子交换键合固定相）离子交换键合固定相）离子交换键合固定相 薄薄壳壳键键合合型型；微微粒粒硅硅胶胶键合

28、型（键合离子交换基团）键合型（键合离子交换基团）树脂类别：树脂类别：树脂类别：树脂类别：（1 1）阳阳阳阳离离离离子子子子交交交交换换换换树树树树脂脂脂脂（强强强强酸酸酸酸性、弱酸性）性、弱酸性）性、弱酸性）性、弱酸性）（2 2）阴阴阴阴离离离离子子子子交交交交换换换换树树树树脂脂脂脂（强强强强碱碱碱碱性、弱碱性）性、弱碱性）性、弱碱性）性、弱碱性）第25页，本讲稿共53页2022/12/32022/12/3 4.4.空间排阻分离固定相空间排阻分离固定相（1 1）软质凝胶）软质凝胶）软质凝胶）软质凝胶 葡聚糖凝胶、琼脂凝胶等。多孔网状结构；葡聚糖凝胶、琼脂凝胶等。多孔网状结构；水为流动相。适用

29、于常压排阻分离。水为流动相。适用于常压排阻分离。（2 2）半硬质凝胶）半硬质凝胶）半硬质凝胶）半硬质凝胶 苯乙烯苯乙烯-二乙烯基苯交联共聚物，有机凝胶；二乙烯基苯交联共聚物，有机凝胶；非极性有机溶剂为流动相，不能用丙酮、乙醇等极性溶剂非极性有机溶剂为流动相，不能用丙酮、乙醇等极性溶剂（3 3）硬质凝胶）硬质凝胶）硬质凝胶）硬质凝胶 多孔硅胶、多孔玻珠等；多孔硅胶、多孔玻珠等；化化学学稳稳定定性性、热热稳稳定定性性好好、机机械械强强度度大大，流流动动相相性性质质影影响响小，可在较高流速下使用。小，可在较高流速下使用。可控孔径玻璃微球，具有恒定孔径和窄粒度分布。可控孔径玻璃微球，具有恒定孔径和窄粒

30、度分布。第26页，本讲稿共53页2022/12/32022/12/3二、液相色谱的流动相二、液相色谱的流动相 mobile phases of LC 1.1.流动相特性流动相特性 （1 1）液液相相色色谱谱的的流流动动相相又又称称为为：淋淋洗洗液液，洗洗脱脱剂剂。流流动动相组成改变，极性改变，可显著改变组分分离状况；相组成改变，极性改变，可显著改变组分分离状况；（2 2）亲亲水水性性固固定定液液常常采采用用疏疏水水性性流流动动相相，即即流流动动相相的的极极性性小小于于固固定定相相的的极极性性，称称为为正正相相液液液液色色谱谱法法，极极性性柱柱也也称称正正相柱。相柱。（3 3）若若流流动动相相的

31、的极极性性大大于于固固定定液液的的极极性性，则则称称为为反反相相液液液液色色谱谱，非非极极性性柱柱也也称称为为反反相相柱柱。组组分分在在两两种种类类型型分分离离柱柱上上的出峰顺序相反。的出峰顺序相反。第27页，本讲稿共53页2022/12/32022/12/32.2.流动相类别流动相类别 按流动相组成分按流动相组成分按流动相组成分按流动相组成分：单组分和多组分；：单组分和多组分；按极性分按极性分按极性分按极性分：极性、弱极性、非极性；：极性、弱极性、非极性；按使用方式分按使用方式分按使用方式分按使用方式分：固定组成淋洗和梯度淋洗。：固定组成淋洗和梯度淋洗。常常常常用用用用溶溶溶溶剂剂剂剂：己己

32、烷烷、四四氯氯化化碳碳、甲甲苯苯、乙乙酸酸乙乙酯酯、乙乙醇醇、乙腈、水。乙腈、水。采采用用二二元元或或多多元元组组合合溶溶剂剂作作为为流流动动相相可可以以灵灵活活调调节节流流动动相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。第28页，本讲稿共53页2022/12/32022/12/33.3.流动相选择流动相选择 在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据。在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据。在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据。在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据。采用正相液采用正相液-液分配分离时：首先选择中等极性溶剂，液分配分离

33、时：首先选择中等极性溶剂，若组分的保留时间太短，降低溶剂极性，反之增加。若组分的保留时间太短，降低溶剂极性，反之增加。也可在低极性溶剂中，逐渐增加其中的极性溶剂，使也可在低极性溶剂中，逐渐增加其中的极性溶剂，使保留时间缩短。保留时间缩短。常用溶剂的极性顺序常用溶剂的极性顺序常用溶剂的极性顺序常用溶剂的极性顺序：水水(最大最大)甲酰胺甲酰胺 乙腈乙腈 甲醇甲醇 乙醇乙醇 丙醇丙醇 丙酮丙酮 二氧六环二氧六环 四氢呋喃四氢呋喃 甲乙酮甲乙酮 正丁醇正丁醇 乙酸乙酯乙酸乙酯 乙醚乙醚 异丙醚异丙醚 二氯甲烷二氯甲烷 氯仿氯仿 溴乙烷溴乙烷 苯苯 四氯化碳四氯化碳 二硫化碳二硫化碳 环己烷环己烷 己烷

34、己烷 煤油煤油(最小最小)第29页，本讲稿共53页2022/12/32022/12/34.4.选择流动相时应注意的几个问题选择流动相时应注意的几个问题（1 1）尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累）尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。（2 2）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧化铝固定柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧化铝固定相等。相等。（3 3）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉）试样在流动相中应有适

35、宜的溶解度，防止产生沉淀并在柱中沉积。淀并在柱中沉积。（4 4）流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外）流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外检测器时，流动相不应有紫外吸收。检测器时，流动相不应有紫外吸收。第30页，本讲稿共53页2022/12/32022/12/311.5 高效液相色谱仪高效液相色谱仪 high performance liquid chromatograph第31页，本讲稿共53页2022/12/32022/12/3液相色谱仪（液相色谱仪（2）第32页，本讲稿共53页2022/12/32022/12/3液相色谱仪（液相色谱仪（3）第33页，本讲稿共53页2022/1

36、2/32022/12/3液相色谱仪（液相色谱仪（4）第34页，本讲稿共53页2022/12/32022/12/3流程及主要部件流程及主要部件 process and main assembly of HPLC流程流程四个主要部分：四个主要部分：四个主要部分：四个主要部分：液体输送系统液体输送系统液体输送系统液体输送系统进样系统进样系统进样系统进样系统分离系统分离系统分离系统分离系统检测系统检测系统检测系统检测系统第35页，本讲稿共53页2022/12/32022/12/311.5.1 液体输送系统液体输送系统高效液相色谱仪器的输液系统包括贮液瓶、高压泵、梯度洗脱装置等。1.贮液瓶贮液瓶（1）对

37、贮液瓶的要求。贮液瓶又称溶剂贮存器，主要用来供给足够数量的符合要求的流动相以便完成分析工作。对于溶剂贮存器的要求是：必须有足够的容积，以备重复分析时保证供液；脱气方便；能耐一定的压力；所选用的材质对所使用的溶剂都是惰性的。第36页，本讲稿共53页2022/12/32022/12/3（2）脱气方法。贮液瓶常用的脱气方法有：低压脱气法。电磁搅拌、水泵抽真空。不适于二元以上冲洗剂组成的流动相脱气。吹氦脱气法。此法简单方便，适用于所有冲洗剂脱气。超声波脱气法。将冲洗剂瓶置于超声波清洗槽中，以水为介质超声脱气。方便，不影响溶剂组成，并适用于各种溶剂，目前国内使用较为普遍。使用此法时应注意避免将溶剂瓶与超

38、声波清洗槽底或壁的接触，以免瓶子破裂。第37页，本讲稿共53页2022/12/32022/12/32.高压输液泵高压输液泵主要部件之一，压力：主要部件之一，压力：15015035010350105 5 PaPa。为为了了获获得得高高柱柱效效而而使使用用粒粒度度很很小小的的固固定定相相（1010mm），液液体体的的流流动动相相高高速速通通过过时时，将将产产生生很很高高的的压压力力，因因此此高高压压、高高速是高效液相色谱的特点之一。速是高效液相色谱的特点之一。应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性（动画）（动画）（动画）（动画）第38页

39、，本讲稿共53页2022/12/32022/12/33.梯度淋洗装置梯度淋洗装置高压梯度高压梯度高压梯度高压梯度:利用两台高压输液利用两台高压输液泵，将两种不同极性的泵，将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混合后进梯度混合室，混合后进入色谱柱。入色谱柱。低压梯度低压梯度低压梯度低压梯度:一台高压泵一台高压泵,通过通过比例调节阀比例调节阀,将两种或将两种或多种不同极性的溶剂多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入高按一定的比例抽入高压泵中混合。压泵中混合。第39页，本讲稿共53页2022/12/32022/12/311.5.2 进样系统进样系统 流路中为高压力工作状态，

40、流路中为高压力工作状态，通常使用耐高压的六通阀进样装置，通常使用耐高压的六通阀进样装置，其结构如图所示：其结构如图所示：第40页，本讲稿共53页2022/12/32022/12/311.5.3 分离系统分离系统 柱体为直型不锈钢管，内径柱体为直型不锈钢管，内径柱体为直型不锈钢管，内径柱体为直型不锈钢管，内径1 16 6 mmmm，柱长柱长柱长柱长5 540 40 cmcm。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。第41页，本讲稿共53页2022/12/32022/12/311

41、.5.4 检测系统检测系统 a.a.紫外检测器紫外检测器紫外检测器紫外检测器 应用最广，对大部分有机化合物有响应。应用最广，对大部分有机化合物有响应。应用最广，对大部分有机化合物有响应。应用最广，对大部分有机化合物有响应。特点：特点：特点：特点：灵敏度高；灵敏度高；线形范围高；线形范围高；流通池可做的很小（流通池可做的很小（1 1mm 10mm mm 10mm，容积容积 8 8LL）；）；对流动相的流速和温度变化不敏感；对流动相的流速和温度变化不敏感；波长可选，易于操作；波长可选，易于操作；可用于梯度洗脱。可用于梯度洗脱。第42页，本讲稿共53页2022/12/32022/12/3b.b.光电

42、二极管阵列检测器光电二极管阵列检测器 紫外检测器的重要进展；紫外检测器的重要进展；紫外检测器的重要进展；紫外检测器的重要进展；光光光光电电电电二二二二极极极极管管管管阵阵阵阵列列列列检检检检测测测测器器器器：10241024个个二二极极管管阵阵列列，各各检检测测特特定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。第43页，本讲稿共53页2022/12/32022/12/3第44页，本讲稿共53页2022/12/32022/12/3光电二极管阵列检测器光电二极管阵列检测器第45页，本讲稿共53页2022/12/32022/12/3c.示差折光检测器

43、示差折光检测器（differential refractive index detector）除紫外检测器之外应用最多的检测器；除紫外检测器之外应用最多的检测器；可可连连续续检检测测参参比比池池和和样样品品池池中中流流动动相相之之间间的的折折光光指指数数差差值。差值与浓度呈正比；值。差值与浓度呈正比；通通用用型型检检测测器器（每每种种物物质质具具有有不不同同的折光指数）；的折光指数）；灵灵敏敏度度低低、对对温温度度敏敏感感、不不能能用用于于梯梯度洗脱；度洗脱；偏偏转转式式、反反射射式式和干涉型三种；和干涉型三种；第46页，本讲稿共53页2022/12/32022/12/3示差折光检测器示差折光

44、检测器第47页，本讲稿共53页2022/12/32022/12/3d.荧光检测器荧光检测器（fluorescence detector）高灵敏度、高选择性；高灵敏度、高选择性；对对多多环环芳芳烃烃，维维生生素素B B、黄黄曲曲霉霉素素、卟卟啉啉类类化化合合物物、农农药药、药药物物、氨氨基基酸酸、甾甾类类化合物等有响应；化合物等有响应；第48页，本讲稿共53页2022/12/32022/12/311.6 HPLC的的应用应用 application of HPLC 1.1.环境中有机氯农药残留量分析环境中有机氯农药残留量分析 固定相固定相：薄壳型硅胶薄壳型硅胶(37(37 5050 m)m)流动

45、相：正己烷流动相：正己烷 流流 速：速：1.5 1.5 mL/minmL/min 色谱柱：色谱柱：5050cmcm 2.5mm(2.5mm(内径内径)检测器：差示折光检测器检测器：差示折光检测器 可对水果、蔬菜中的农药可对水果、蔬菜中的农药残留量进行分析。残留量进行分析。第49页，本讲稿共53页2022/12/32022/12/32.2.稠环芳烃的分析稠环芳烃的分析 稠环芳烃多为致癌物质。稠环芳烃多为致癌物质。固定相固定相：十八烷基硅烷化键合相十八烷基硅烷化键合相 流动相：流动相：20%20%甲醇甲醇-水水 100%100%甲醇甲醇 线性梯度淋洗，线性梯度淋洗，2%/2%/minmin 流流

46、速：速：1 1mL/minmL/min 柱柱 温：温：5050 C C 柱柱 压：压：70 70 10104 4 PaPa 检测器：紫外检测器检测器：紫外检测器第50页，本讲稿共53页2022/12/32022/12/311.7、制备型液相色谱、制备型液相色谱 preparative liquid chromatography 获得高纯物质（色谱纯）的有效方法。获得高纯物质（色谱纯）的有效方法。半制备柱（内径半制备柱（内径8 8mmmm，长度长度15 15 30 30cmcm），），一次制备量一次制备量.1.1mgmg；1.1.1.1.色谱柱的柱容量（柱负荷）色谱柱的柱容量（柱负荷）色谱柱的柱

47、容量（柱负荷）色谱柱的柱容量（柱负荷）对分析柱：对分析柱：对分析柱：对分析柱：不影响柱效时的最大进样量；不影响柱效时的最大进样量；对制备柱：对制备柱：对制备柱：对制备柱：不影响收集物纯度时的最大进样量；不影响收集物纯度时的最大进样量；超载：超载：超载：超载：进样量超过柱容量。柱效迅速下降，峰变宽。进样量超过柱容量。柱效迅速下降，峰变宽。超载可提高制备效率，以柱效下降一半或容量因子超载可提高制备效率，以柱效下降一半或容量因子超载可提高制备效率，以柱效下降一半或容量因子超载可提高制备效率，以柱效下降一半或容量因子k k降降降降低低低低10%10%为宜。为宜。为宜。为宜。第51页，本讲稿共53页20

48、22/12/32022/12/32.2.液相制备色谱的方法液相制备色谱的方法收集组分时，通常有以下情况：收集组分时，通常有以下情况：（1 1）可获得良好分离，主峰）可获得良好分离，主峰 使用制备柱，超载提高效率；使用制备柱，超载提高效率；（2 2）两主成分之间的小组分；）两主成分之间的小组分；超载，分离切分使待分离组分成超载，分离切分使待分离组分成为主成分（富集）后，再次分离为主成分（富集）后，再次分离制备。制备。第52页，本讲稿共53页2022/12/32022/12/33.3.制备型液相色谱制备型液相色谱 制备型液相色谱制备型液相色谱制备型液相色谱制备型液相色谱：结构与分析型一样，但泵流量大、进：结构与分析型一样，但泵流量大、进样量大、采用制备柱；柱后馏分收集器。样量大、采用制备柱；柱后馏分收集器。制备柱制备柱制备柱制备柱：内径：内径20205050mmmm，柱长柱长5050cmcm。第53页，本讲稿共53页2022/12/32022/12/3