氨基酸多肽和蛋白质类药品检验优秀PPT.ppt

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1、氨基酸多肽和蛋白质类药品检验氨基酸多肽和蛋白质类药品检验你现在浏览的是第一页，共151页第九章第九章 抗生素类药物分析与生物检抗生素类药物分析与生物检定法定法基本要求：基本要求：掌握氨基酸定性鉴别的方法，熟悉氨基酸特殊杂质及掌握氨基酸定性鉴别的方法，熟悉氨基酸特殊杂质及安全性检查，掌握氨基酸含量测定方法，掌握多肽因安全性检查，掌握氨基酸含量测定方法，掌握多肽因子类药物的定性鉴别方法，熟悉多肽因子类药物的检子类药物的定性鉴别方法，熟悉多肽因子类药物的检查方法，掌握多肽因子类药物生物效价的测定方法，查方法，掌握多肽因子类药物生物效价的测定方法，掌握蛋白质类药物的鉴别和检查方法，掌握蛋白质含掌握蛋白

2、质类药物的鉴别和检查方法，掌握蛋白质含量测定和效价测定方法，了解几种氨基酸、多肽因子量测定和效价测定方法，了解几种氨基酸、多肽因子和蛋白质药物的质量分析过程。和蛋白质药物的质量分析过程。你现在浏览的是第二页，共151页第九章第九章 抗生素类药物分析与生物检抗生素类药物分析与生物检定法定法基本内容基本内容第一节第一节 氨基酸类药品检验氨基酸类药品检验第二节第二节 多肽因子类和蛋白质类药品检验多肽因子类和蛋白质类药品检验第三节第三节 几种氨基酸、多肽因子和蛋白质药物的质量分析几种氨基酸、多肽因子和蛋白质药物的质量分析你现在浏览的是第三页，共151页第一节第一节 氨基酸类药品检验氨基酸类药品检验氨基

3、酸是氨基酸是治疗蛋白质代谢紊乱治疗蛋白质代谢紊乱、蛋白质缺损蛋白质缺损所引起的所引起的一系列疾病的重要生化药物，也是具有高度营养价值一系列疾病的重要生化药物，也是具有高度营养价值的蛋白质补充剂，有着广泛的生化作用和临床疗效的蛋白质补充剂，有着广泛的生化作用和临床疗效。目前氨基酸及其衍生物临床应用不断发展和扩大，创目前氨基酸及其衍生物临床应用不断发展和扩大，创制了一些新的生化药物制了一些新的生化药物。如如甲基酪氨酸甲基酪氨酸治疗治疗嗜铬细胞瘤嗜铬细胞瘤氧苯丙氨酸氧苯丙氨酸用于用于类癌瘤综合征类癌瘤综合征偶氮丝氨酸偶氮丝氨酸治疗治疗白血病白血病乙酰羟脯氨酸乙酰羟脯氨酸用于用于治疗类风湿关节炎治疗类

4、风湿关节炎你现在浏览的是第四页，共151页第一节第一节 氨基酸类药品检验氨基酸类药品检验氨基酸为氨基酸为白色晶状体白色晶状体，熔点很高，多在熔融时分解，熔点很高，多在熔融时分解，都能溶解在强酸强碱中都能溶解在强酸强碱中，形成的盐多能溶于水。，形成的盐多能溶于水。氨基酸在氨基酸在等电点等电点（pIpI）时）时溶解度最小溶解度最小，最稳定。，最稳定。中性中性pIpI值在值在5 56.36.3左右。左右。酸性酸性pIpI值在值在2.82.83.23.2左右。左右。碱性氨基酸的碱性氨基酸的pIpI值在值在7.67.610.810.8左右。左右。你现在浏览的是第五页，共151页第一节第一节 氨基酸类药品

5、检验氨基酸类药品检验一、氨基酸的定性鉴别一、氨基酸的定性鉴别旋光度、熔点、溶解度、纸层析、氨基酸自动化分析、旋光度、熔点、溶解度、纸层析、氨基酸自动化分析、气相色谱等均可作为氨基酸鉴别的依据。气相色谱等均可作为氨基酸鉴别的依据。1 1、化学鉴别法、化学鉴别法氨基酸的氨基酸的鉴别最常用的方法鉴别最常用的方法是根据所有氨基酸均能与是根据所有氨基酸均能与茚三酮茚三酮显蓝紫色显蓝紫色。采用茚三酮显色法，中国药典（采用茚三酮显色法，中国药典（20102010年）二部对所收年）二部对所收载的氨基酸类药物大多采用此方法进行鉴别。载的氨基酸类药物大多采用此方法进行鉴别。如要对某种氨基酸加以鉴别，可借助于一些如

6、要对某种氨基酸加以鉴别，可借助于一些特定的显特定的显色反应色反应。你现在浏览的是第六页，共151页第一节第一节 氨基酸类药品检验氨基酸类药品检验（1 1）茚三酮反应茚三酮反应 茚三酮在酸性溶液中与茚三酮在酸性溶液中与-氨基酸共氨基酸共热，引起氨基酸氧化脱氢、脱羧反应，最后生成紫色热，引起氨基酸氧化脱氢、脱羧反应，最后生成紫色物质。物质。你现在浏览的是第七页，共151页第一节第一节 氨基酸类药品检验氨基酸类药品检验（2 2）在室温下）在室温下氨基酸与亚硝酸氨基酸与亚硝酸反应，生成反应，生成氮气氮气。在标在标准条件下测定生成氮气体积，即可计算氨基酸的量。准条件下测定生成氮气体积，即可计算氨基酸的量

7、。注：注：生成的氮气只有生成的氮气只有一半来自氨基酸一半来自氨基酸。你现在浏览的是第八页，共151页第一节第一节 氨基酸类药品检验氨基酸类药品检验（3 3）你现在浏览的是第九页，共151页第一节第一节 氨基酸类药品检验氨基酸类药品检验（4 4）你现在浏览的是第十页，共151页第一节第一节 氨基酸类药品检验氨基酸类药品检验（5 5）你现在浏览的是第十一页，共151页第一节第一节 氨基酸类药品检验氨基酸类药品检验（6 6）你现在浏览的是第十二页，共151页第一节第一节 氨基酸类药品检验氨基酸类药品检验（7 7）你现在浏览的是第十三页，共151页第一节第一节 氨基酸类药品检验氨基酸类药品检验（8 8

8、）乙醛蒸气接触亚硝基铁氰化钠和二乙胺时蓝紫色乙醛蒸气接触亚硝基铁氰化钠和二乙胺时蓝紫色你现在浏览的是第十四页，共151页第一节第一节 氨基酸类药品检验氨基酸类药品检验（9 9）组氨酸的）组氨酸的侧链咪唑基侧链咪唑基也能与也能与重氮苯磺酸重氮苯磺酸反应形成反应形成与与PaulyPauly反应相似的化合物，呈棕红色。反应相似的化合物，呈棕红色。你现在浏览的是第十五页，共151页第一节第一节 氨基酸类药品检验氨基酸类药品检验（1010）借助这些特定的显色反应可以对氨基酸进行鉴别。借助这些特定的显色反应可以对氨基酸进行鉴别。你现在浏览的是第十六页，共151页第一节第一节 氨基酸类药品检验氨基酸类药品检

9、验2 2、光谱鉴别法、光谱鉴别法（1 1）紫紫外外吸吸收收光光谱谱法法 在在2020种种天天然然氨氨基基酸酸中中，只只有有酪酪氨氨酸酸、色色氨氨酸酸和和苯苯丙丙氨氨酸酸在紫外区有最大吸收在紫外区有最大吸收。酪酪 氨氨 酸酸的的 max275nm 275=1.4x103苯苯 丙丙 氨氨 酸酸 的的 max257nm 257=2.0 x102色色 氨氨 酸酸 的的 max 280nm 280=5.6x103你现在浏览的是第十七页，共151页1 1：酪氨酸：酪氨酸2 2：色氨酸：色氨酸3 3：苯丙氨酸。：苯丙氨酸。第一节第一节 氨基酸类药品检验氨基酸类药品检验这这三三种种氨氨基基酸酸可可以以通通过过

10、紫紫外外吸收光谱吸收光谱加以鉴别。加以鉴别。精精密密称称取取酪酪氨氨酸酸、色色氨氨酸酸、苯丙氢酸各适量苯丙氢酸各适量。用用水水制制成成每每1mL1mL含含20g20g（色色氨氨酸酸）、40g40g（酪酪氨氨酸酸）、200g200g（苯丙氨酸）（苯丙氨酸）。在在波波长长230230300nm300nm测测定定各各氨氨基酸的吸收光谱基酸的吸收光谱，如右图。，如右图。你现在浏览的是第十八页，共151页第一节第一节 氨基酸类药品检验氨基酸类药品检验（2 2）红红外外吸吸收收光光谱谱图图 氨氨基基酸酸在在红红外外区区都都有有特特性性图图谱谱，可可以以通通过过与与标标准准氨氨基基酸酸图图谱谱比比较较作作为

11、为氨氨基基酸酸的的鉴鉴别别依依据。据。用用红红外外分分光光光光度度法法进进行行氨氨基基酸酸鉴鉴别别时时，除除另另有有规规定定外外，通通常常固固体体供供试试品品均均采采用用溴溴化化钾钾片片法法，在在400400667cm667cm-1-1范围范围内测定其吸收图谱。内测定其吸收图谱。所所得得的的吸吸收收图图谱谱各各主主要要吸吸收收峰峰波波长长和和各各吸吸收收峰峰间间的的相相互强度关系互强度关系均应与对照的图谱一致。均应与对照的图谱一致。你现在浏览的是第十九页，共151页第一节第一节 氨基酸类药品检验氨基酸类药品检验3 3、薄层色谱鉴别法、薄层色谱鉴别法在薄层板上点样，通过与标准氨基酸对照而鉴别氨基

12、在薄层板上点样，通过与标准氨基酸对照而鉴别氨基酸。酸。（1 1）薄层板的制备薄层板的制备你现在浏览的是第二十页，共151页第一节第一节 氨基酸类药品检验氨基酸类药品检验（2 2）十十一一种种氨氨基基酸酸混混合合液液（色色、蛋蛋、亮亮、异异亮亮、甘甘、赖、苏、缬、苯丙、组、精）与赖、苏、缬、苯丙、组、精）与对照液对照液的的制备制备。你现在浏览的是第二十一页，共151页第一节第一节 氨基酸类药品检验氨基酸类药品检验（3 3）点点样样、展展开开和和显显色色 吸吸取取混混合合液液和和对对照照液液各各3L3L，分别点于同一薄层板上，分别点于同一薄层板上。以以正正丁丁醇醇-水水-异异丁丁酸酸-醋醋酸酸（5

13、05050505 57 7）之之上上层层作作展展开开剂剂，进进行行单单向向三三次次展展开开，展展开开约约15cm15cm，每每次次必必须须待溶剂挥发尽待溶剂挥发尽后，再进行下一次展开后，再进行下一次展开。喷喷以以显显色色剂剂（吲吲哚哚醌醌1g1g，溶溶于于100mL100mL无无水水乙乙醇醇和和10mL10mL冰醋酸中）置冰醋酸中）置100100干燥干燥5 510min10min至显色完全为止至显色完全为止。你现在浏览的是第二十二页，共151页第一节第一节 氨基酸类药品检验氨基酸类药品检验本本层层析析系系统统中中，由由于于分分离离的的程程度度与与各各种种氨氨基基酸酸显显出出不不同同的的颜颜色色

14、，可可以以区别十一种氨基酸。区别十一种氨基酸。用用茚茚三三酮酮-硝硝酸酸钠钠试试剂剂亦亦能能显显出出不不同同颜颜色色的的色色斑，且灵敏度较高斑，且灵敏度较高。用用E.MerckE.Merck规规格格微微晶晶纤纤维维素素比比其其他他规规格格的的微微晶晶纤纤维维素素的的分分离离效效果果和和重重现性较好。现性较好。你现在浏览的是第二十三页，共151页第一节第一节 氨基酸类药品检验氨基酸类药品检验（3 3）点点样样、展展开开和和显显色色 吸吸取取混混合合液液和和对对照照液液各各3L3L，分别点于同一薄层板上，分别点于同一薄层板上。以以正正丁丁醇醇-水水-异异丁丁酸酸-醋醋酸酸（505050505 57

15、 7）之之上上层层作作展展开开剂剂，进进行行单单向向三三次次展展开开，展展开开约约15cm15cm，每每次次必必须须待溶剂挥发尽待溶剂挥发尽后，再进行下一次展开后，再进行下一次展开。喷喷以以显显色色剂剂（吲吲哚哚醌醌1g1g，溶溶于于100mL100mL无无水水乙乙醇醇和和10mL10mL冰醋酸中）置冰醋酸中）置100100干燥干燥5 510min10min至显色完全为止至显色完全为止。你现在浏览的是第二十四页，共151页第一节第一节 氨基酸类药品检验氨基酸类药品检验二、氨基酸特殊杂质及安全性检查二、氨基酸特殊杂质及安全性检查1 1、特殊杂质检查、特殊杂质检查氨基酸原料药所含有的特殊杂质一般为

16、一些其他种类氨基酸原料药所含有的特殊杂质一般为一些其他种类的氨基酸的氨基酸。用用薄层色谱法薄层色谱法进行限量检查：将样品配成一定浓度的进行限量检查：将样品配成一定浓度的供试品液，取一定量供试品液稀释后作为对照液，在供试品液，取一定量供试品液稀释后作为对照液，在同一硅胶同一硅胶G G薄板上，一般用薄板上，一般用正丁醇水冰醋酸正丁醇水冰醋酸（3 31 11 1）展开晾干后，喷）展开晾干后，喷茚三酮茚三酮的的丙酮溶液丙酮溶液显色，规定显色，规定供试品所显杂质斑点的颜色不得深于对照液主斑点供试品所显杂质斑点的颜色不得深于对照液主斑点，以此限制其他氨基酸的含量。以此限制其他氨基酸的含量。你现在浏览的是第

17、二十五页，共151页第一节第一节 氨基酸类药品检验氨基酸类药品检验氨基酸和有些小分子多肽药物是经过氨基酸和有些小分子多肽药物是经过酶解酶解或或化学方法化学方法裂解大分子蛋白裂解大分子蛋白后经层析或超滤等方法得到的小分子后经层析或超滤等方法得到的小分子物质物质，因此检查是否存在大分子蛋白质非常重要。因此检查是否存在大分子蛋白质非常重要。方法方法：取取适宜浓度适宜浓度的样品溶液，加的样品溶液，加等体积等体积的的2020磺基磺基水杨酸水杨酸溶液，溶液不发生浑浊则判定无蛋白质。溶液，溶液不发生浑浊则判定无蛋白质。你现在浏览的是第二十六页，共151页第一节第一节 氨基酸类药品检验氨基酸类药品检验2 2、

18、安全性检查、安全性检查影响氨基酸安全用药的因素除其中的一般杂质，主要影响氨基酸安全用药的因素除其中的一般杂质，主要为热原的含量。为热原的含量。中国药典所收载的氨基酸基本上都规定了热原检查。中国药典所收载的氨基酸基本上都规定了热原检查。采用采用家兔法家兔法，将一定剂量的供试品，静脉注入家兔体，将一定剂量的供试品，静脉注入家兔体内，在规定时间内观察内，在规定时间内观察家兔体温升高家兔体温升高的情况，以判定的情况，以判定供试品中所含热原的限度是否符合规定。供试品中所含热原的限度是否符合规定。你现在浏览的是第二十七页，共151页第一节第一节 氨基酸类药品检验氨基酸类药品检验三、氨基酸含量测定三、氨基酸

19、含量测定1 1、茚三酮法、茚三酮法茚三酮法是氨基酸定量测定应用最广泛的方法之一。茚三酮法是氨基酸定量测定应用最广泛的方法之一。当当茚三酮茚三酮在在酸性条件酸性条件下和氨基酸反应时，氨基酸被氧下和氨基酸反应时，氨基酸被氧化分解生成醛，放出氨和二氧化碳，水合茚三酮则成化分解生成醛，放出氨和二氧化碳，水合茚三酮则成还原型水合茚三酮。然后还原型茚三酮与氨，另一分还原型水合茚三酮。然后还原型茚三酮与氨，另一分子茚三酮进一步缩合生成子茚三酮进一步缩合生成蓝紫色物蓝紫色物，最大吸收值的波，最大吸收值的波长为长为570nm570nm。你现在浏览的是第二十八页，共151页第一节第一节 氨基酸类药品检验氨基酸类药

20、品检验茚三酮反应为一切茚三酮反应为一切-氨基酸氨基酸所共有，反应灵敏，根所共有，反应灵敏，根据反应所生成的蓝紫色深浅，可以测定氨基酸含量。据反应所生成的蓝紫色深浅，可以测定氨基酸含量。本法可允许的测定范围是本法可允许的测定范围是0.50.550g50g氨基酸氨基酸。该法又分为该法又分为YemmYemm法法、RosenRosen法法和和HydrindantinHydrindantin法法。你现在浏览的是第二十九页，共151页第一节第一节 氨基酸类药品检验氨基酸类药品检验（1 1）YemmYemm法法 取取样样品品1.0mL1.0mL（含含0.020.020.5mol/L0.5mol/L氨氨基基酸

21、酸），加加枸枸橼橼酸酸缓缓冲冲液液（枸枸橼橼酸酸21g21g溶溶于于100ml100ml水水中中，加加 1.0mol/L1.0mol/L氢氢 氧氧 化化 钠钠 溶溶 液液 200mL200mL，加加 水水 至至500mL500mL）0.5mL0.5mL，茚茚三三酮酮溶溶液液（茚茚三三酮酮2.5g2.5g溶溶于于50mL50mL甲甲基基溶溶纤纤剂剂中中）0.2mL0.2mL，氰氰化化钾钾溶溶液液（0.01mol/L0.01mol/L氰氰化化钾钾溶溶液液5mL5mL与与25mL25mL甲甲基基溶溶纤纤剂剂混混合合）1.0mL1.0mL，充充分分混混匀匀，沸水浴加热沸水浴加热15min15min，冷

22、却。，冷却。加入加入稀释剂稀释剂3 35mL5mL，于，于570nm570nm波长处测定。波长处测定。按标准曲线计算出含氨基酸的量。按标准曲线计算出含氨基酸的量。如所测氨基酸种类不明时如所测氨基酸种类不明时，可用可用亮氨酸亮氨酸作标准曲线。作标准曲线。你现在浏览的是第三十页，共151页第一节第一节 氨基酸类药品检验氨基酸类药品检验（2 2）RosenRosen法法 该法是该法是YemmYemm法的改良。法的改良。取取样样品品1.0mL1.0mL，加加茚茚三三酮酮溶溶液液（茚茚三三酮酮3g3g溶溶于于100mL100mL甲甲基基溶溶纤纤剂剂中中）及及氰氰化化钠钠溶溶液液（氰氰化化钠钠490mg4

23、90mg溶溶于于1L1L水水中中，取取该该溶溶液液20mL20mL，加加醋醋酸酸缓缓冲冲液液至至1L1L）各各0.5mL0.5mL，充充分分混混匀匀，沸沸水水浴浴加加热热15min15min，立立即即加加5050（V/VV/V）异异丙醇丙醇，充分搅拌，放冷，比色，计算。，充分搅拌，放冷，比色，计算。（3 3）HydrindantinHydrindantin法法 取取 茚茚 三三 酮酮 20g20g及及 茚茚 烷烷 酮酮（HydrindantinHydrindantin）3g3g溶溶于于750mL750mL甲甲基基溶溶纤纤剂剂及及4mol/L4mol/L醋醋酸酸缓缓冲冲液液（醋醋酸酸钠钠272g

24、272g溶溶于于适适量量水水中中，加加冰冰醋醋酸酸50mL50mL，加加水水至至500mL500mL）250mL250mL中中，混混合合作作为为显显色色指指示示剂剂。取样品取样品1 12mL2mL，加等量显色指示剂，以下操作同上法。加等量显色指示剂，以下操作同上法。你现在浏览的是第三十一页，共151页第一节第一节 氨基酸类药品检验氨基酸类药品检验2 2、三硝基苯磺酸（、三硝基苯磺酸（TNBSTNBS）法）法三硝基苯磺酸（三硝基苯磺酸（TNBSTNBS）是定量测定氨基酸的重要试剂）是定量测定氨基酸的重要试剂之一。之一。TNBSTNBS在在偏碱性偏碱性的条件下与氨基酸反应，先形成的条件下与氨基酸反

25、应，先形成中间络中间络合物合物（带有等摩尔（带有等摩尔 ），如下式。），如下式。你现在浏览的是第三十二页，共151页第一节第一节 氨基酸类药品检验氨基酸类药品检验中间络合物在光谱下有两个吸收值相近的高峰，分别中间络合物在光谱下有两个吸收值相近的高峰，分别位于位于355nm355nm和和420nm420nm附近。附近。溶液一旦酸化溶液一旦酸化，中间络合物转化成三硝基苯氨基酸，中间络合物转化成三硝基苯氨基酸（TNPTNP氨基酸），氨基酸），420nm420nm处的吸收值显著下降，而处的吸收值显著下降，而350nm350nm附近的吸收峰则移至附近的吸收峰则移至340nm340nm处处。你现在浏览的是

26、第三十三页，共151页第一节第一节 氨基酸类药品检验氨基酸类药品检验利用利用TNBSTNBS与氨基酸反应的这一特性，可在与氨基酸反应的这一特性，可在420nm420nm处处（偏碱性偏碱性溶液中）或在溶液中）或在340nm340nm（偏酸性偏酸性溶液中）对氨溶液中）对氨基酸进行定量测定。基酸进行定量测定。本法允许的测定范围是本法允许的测定范围是0.050.050.4mol0.4mol氨基酸氨基酸。你现在浏览的是第三十四页，共151页第一节第一节 氨基酸类药品检验氨基酸类药品检验3 3、铜复合物紫外吸收法、铜复合物紫外吸收法在合适的在合适的pHpH值条件下，值条件下，2mol-2mol-氨基酸与氨

27、基酸与1mol1mol铜离子铜离子形成氨基酸形成氨基酸-铜复合物：铜复合物：你现在浏览的是第三十五页，共151页第一节第一节 氨基酸类药品检验氨基酸类药品检验此复合物呈此复合物呈蓝色蓝色，除了在，除了在620nm620nm有吸收峰外，在有吸收峰外，在230nm230nm有最大吸收，其摩尔吸收系数在有最大吸收，其摩尔吸收系数在230nm230nm处为处为620nm620nm处的处的100100倍左右倍左右，因此利用氨基酸，因此利用氨基酸-铜复合物的紫外吸收以铜复合物的紫外吸收以进行氨基酸的微量测定。进行氨基酸的微量测定。本法可允许测定范围是本法可允许测定范围是5050500mol/mL500mo

28、l/mL的氨基酸。的氨基酸。适用于蛋白质水解速率和水解程度的测定。适用于蛋白质水解速率和水解程度的测定。你现在浏览的是第三十六页，共151页第一节第一节 氨基酸类药品检验氨基酸类药品检验4 4、甲醛滴定法、甲醛滴定法氨基酸的氨基酸的NHNH3 3+基的基的pKpK值常在值常在9.09.0以上以上，不能用一般指示，不能用一般指示剂作酸碱滴定测定。剂作酸碱滴定测定。但但甲醛甲醛可与氨基酸中不带电荷的氨基相互作用，可与氨基酸中不带电荷的氨基相互作用，促使促使NHNH3 3+上的氢离子释放上的氢离子释放。你现在浏览的是第三十七页，共151页第一节第一节 氨基酸类药品检验氨基酸类药品检验在在pHpH值中

29、性和常温条件下，甲醛迅速与氨基酸上的氨值中性和常温条件下，甲醛迅速与氨基酸上的氨基（或亚氨基）结合，使下述平衡向右移动，促进氢基（或亚氨基）结合，使下述平衡向右移动，促进氢离子释放，使溶液酸度增加。离子释放，使溶液酸度增加。即可即可用用酚酞酚酞作指示剂，以作指示剂，以氢氧化钠氢氧化钠来滴定。来滴定。每释放出每释放出一个氢离子一个氢离子，就相当有，就相当有一个氨基氮一个氨基氮，从滴定，从滴定所用氢氧化钠量可以计算样品中氨基氮含量所用氢氧化钠量可以计算样品中氨基氮含量以及以及氨基氨基酸含量。酸含量。你现在浏览的是第三十八页，共151页第一节第一节 氨基酸类药品检验氨基酸类药品检验5 5、非水溶液滴

30、定法、非水溶液滴定法中国药典、美国药典和英国药典对所收载氨基酸类药中国药典、美国药典和英国药典对所收载氨基酸类药物，除物，除谷氨酸谷氨酸用用氢氧化钠氢氧化钠为标准溶液的酸碱滴定法，为标准溶液的酸碱滴定法，其余均根据其结构特性，采用了其余均根据其结构特性，采用了非水酸碱滴定法非水酸碱滴定法。用用冰醋酸作溶剂冰醋酸作溶剂，高氯酸高氯酸作作标准溶液滴定，电位法或标准溶液滴定，电位法或指示剂法确定终点。指示剂法确定终点。适用于适用于常量氨基酸常量氨基酸的含量测定。的含量测定。你现在浏览的是第三十九页，共151页第一节第一节 氨基酸类药品检验氨基酸类药品检验你现在浏览的是第四十页，共151页第一节第一节

31、 氨基酸类药品检验氨基酸类药品检验（1 1）直接滴定法直接滴定法 适用于能适用于能溶于冰醋酸溶于冰醋酸的氨基酸。的氨基酸。精精密密称称定定氨氨基基酸酸样样品品约约50mg50mg，溶溶于于20ml20ml冰冰醋醋酸酸中中，加加2 2滴甲基紫指示剂，用高氯酸标准液滴定。滴甲基紫指示剂，用高氯酸标准液滴定。终点为紫色消失，终点为紫色消失，呈现蓝色呈现蓝色，计算，即得。，计算，即得。用用直直接接法法测测定定的的氨氨基基酸酸有有丙丙氨氨酸酸、精精氨氨酸酸、组组氨氨酸酸、亮亮氨氨酸酸、甲甲硫硫氨氨酸酸、苯苯丙丙氨氨酸酸、色色氨氨酸酸、缬缬氨氨酸酸、异异亮氨酸、苏氨酸等。亮氨酸、苏氨酸等。谷谷氨氨酸酸和和

32、门门冬冬氨氨酸酸在在高高氯氯酸酸中中不不溶溶解解，可可将将样样品品溶溶于于2mL2mL甲甲酸酸中中，再再加加20mL20mL冰冰醋醋酸酸，直直接接用用标标准准高高氯氯酸酸溶溶液滴定。液滴定。你现在浏览的是第四十一页，共151页第一节第一节 氨基酸类药品检验氨基酸类药品检验（2 2）回滴法回滴法 适用于适用于不易溶于冰醋酸不易溶于冰醋酸而能溶于高氯酸而能溶于高氯酸的氨基酸。的氨基酸。精密称定氨基酸样品约精密称定氨基酸样品约30-40mg30-40mg，溶于，溶于5mL5mL高氯酸标准高氯酸标准液中，加液中，加2 2滴甲基紫指示剂，用醋酸钠溶液滴定剩余滴甲基紫指示剂，用醋酸钠溶液滴定剩余的酸，颜色

33、的酸，颜色由黄至绿至蓝至初次呈现不褪色的紫色由黄至绿至蓝至初次呈现不褪色的紫色为为终点，计算，即得。终点，计算，即得。用用回滴法回滴法测定的氨基酸有赖氨酸、丝氨酸、半胱氨酸测定的氨基酸有赖氨酸、丝氨酸、半胱氨酸等。等。你现在浏览的是第四十二页，共151页第一节第一节 氨基酸类药品检验氨基酸类药品检验6 6、双波长分光度法、双波长分光度法双双波波长长分分光光光光度度法法的的理理论论基基础础是是差差吸吸光光度度和和等等吸吸收收波波长长。它它采采用用测测量量波波长长（主主波波长长p p,Primary Primary WavelengthWavelength）和和参参比比波波长长（次次波波长长s s

34、,Second Second WavelengthWavelength）两两个个不不同同波波长长同同时时测测定定一一个个样样品品溶溶液液，可可以以克克服服单单波波长长测测定的缺点，提高了测定结果的精密度和准确度。定的缺点，提高了测定结果的精密度和准确度。待待测测溶溶液液在在p p与与s s两两个个波波长长处处测测定定的的差差吸吸光光度度AA与与试样中试样中待测物质的浓度待测物质的浓度C C成成正比正比。你现在浏览的是第四十三页，共151页第一节第一节 氨基酸类药品检验氨基酸类药品检验复复方方氨氨基基酸酸注注射射液液中中，采采用用双双波波长长分分光光光光度度法法测测定定氨氨基基酸酸的的含含量量，

35、可可消消除除共共存存组组分分干干扰扰原原理理，不不经经分分离离直直接接测测定，操作简便、准确。定，操作简便、准确。色色氨氨酸酸测测定定波波长长280nm280nm，酪酪氨氨酸等吸收波长酸等吸收波长303nm303nm。酪酪氨氨酸酸测测定定波波长长240nm240nm，色色氨氨酸等吸收波长酸等吸收波长292nm292nm。你现在浏览的是第四十四页，共151页第一节第一节 氨基酸类药品检验氨基酸类药品检验7 7、导数分光光度法、导数分光光度法在一定条件下，溶液组分在一定条件下，溶液组分的吸光度对波长的吸光度对波长的的微分值微分值与组分浓度仍保持线性关与组分浓度仍保持线性关系系，利用利用吸光度导数光

36、谱吸光度导数光谱可以可以定量测定组分定量测定组分含量含量，称为导数分光光度法。称为导数分光光度法。导数光谱数值测定有三种导数光谱数值测定有三种方法：方法：切线法切线法，峰谷法峰谷法，峰零法峰零法。你现在浏览的是第四十五页，共151页第一节第一节 氨基酸类药品检验氨基酸类药品检验根根据据紫紫外外吸吸收收光光谱谱选选定定导导数数光光谱谱波波长长范范围围（应应包包含含被被测组分的最大吸收波长）测组分的最大吸收波长）。按按导导数数分分光光光光度度法法测测定定被被测测混混合合组组分分的的一一阶阶、二二阶阶和和三阶三阶导数光谱导数光谱。选取选取其中能其中能排除干扰排除干扰组分干扰的组分干扰的导数光谱导数光

37、谱。在在被被测测组组分分的的最最大大吸吸收收波波长长处处用用切切线线法法（或或峰峰谷谷法法、峰零法）量得的峰零法）量得的振幅值振幅值D D与与标准品浓度标准品浓度做做标准曲线标准曲线。测测定定样样品品在在最最大大吸吸收收波波长长下下的的振振幅幅值值D D，代代入入回回归归方方程，计算样品浓度。程，计算样品浓度。你现在浏览的是第四十六页，共151页第一节第一节 氨基酸类药品检验氨基酸类药品检验用用二二阶阶导导数数光光谱谱法法测测定定复复方方氨氨基基酸酸中中色色氨氨酸酸含含量量，浓浓度度范范围围在在9-45gml9-45gml-1-1时时,呈呈良良好好线线性性。平平均均回回收率收率100.43%,

38、RSD 100.43%,RSD 为为0.44%0.44%。你现在浏览的是第四十七页，共151页第一节第一节 氨基酸类药品检验氨基酸类药品检验8 8、酰胺氮测定法、酰胺氮测定法双羧基氨基酸双羧基氨基酸（谷氨酰胺、天（门）冬酰胺）的侧链（谷氨酰胺、天（门）冬酰胺）的侧链上含有酰胺基。上含有酰胺基。酰胺基上的氮酰胺基上的氮比较容易释放，在较温比较容易释放，在较温和或短时间的水解条件下，即可释放完全。和或短时间的水解条件下，即可释放完全。RCONHRCONH2 2+2H+2H2 2O RCOOH+NHO RCOOH+NH4 4OHOH氨被释放氨被释放出来，经过弥散，出来，经过弥散，吸收于吸收于中央室含

39、有指示剂中央室含有指示剂的的酸溶液酸溶液中。中。反应完全后，直接在中央室用反应完全后，直接在中央室用标定过的盐酸滴定标定过的盐酸滴定，即，即可标出可标出酰胺氮酰胺氮的含量，间接可求出氨基酸的含量。的含量，间接可求出氨基酸的含量。你现在浏览的是第四十八页，共151页第一节第一节 氨基酸类药品检验氨基酸类药品检验9 9、酸碱滴定法、酸碱滴定法赖氨酸（赖氨酸（lysinelysine）片中赖氨酸的测定）片中赖氨酸的测定取取本本品品2020片片，精精密密称称定定，研研细细，精精密密称称取取适适量量（约约相相当当于于赖赖氨氨酸酸0.15g0.15g）置置烧烧杯杯中中，加加水水25mL25mL，滴滴加加氢

40、氢氧氧化化钠钠滴滴定定液液（0.1mol/L0.1mol/L），用用酸酸度度计计调调节节至至pHpH值值为为7.07.0，加加入入预预先先调调节节至至pHpH值值9.09.0的的甲甲醛醛溶溶液液15mL15mL，搅搅匀匀，再再用用氢氢氧氧化化钠钠滴滴定定液液（0.1mol/L0.1mol/L）滴滴定定至至pHpH值值为为9.09.0，并持续，并持续30s30s。按按加加入入甲甲醛醛液液后后所所耗耗用用氢氢氧氧化化钠钠滴滴定定液液（0.1mol/L0.1mol/L）体体积积计计算算，每每毫毫升升氢氢氧氧化化钠钠滴滴定定液液（0.1mol/L0.1mol/L）相相当当于于9.132mg9.132m

41、g的的C C6 6H H1414N N2 2O O2 2HClHCl。你现在浏览的是第四十九页，共151页第一节第一节 氨基酸类药品检验氨基酸类药品检验1010、HPLCHPLC对于各种复方氨基酸制剂中氨基酸的含量测定，目前对于各种复方氨基酸制剂中氨基酸的含量测定，目前较多地采用了高效液相色谱法（较多地采用了高效液相色谱法（HPLCHPLC）。）。因大多数氨基酸因大多数氨基酸没有紫外吸收没有紫外吸收，不能用紫外检测器测，不能用紫外检测器测定。为改善被测物的检测特性，提高检测灵敏度，需定。为改善被测物的检测特性，提高检测灵敏度，需进行进行化学衍生化化学衍生化。衍生方式包括衍生方式包括柱后衍生法柱

42、后衍生法和和柱前衍生法柱前衍生法。柱后衍生法是将样品经离子交换柱分离后进行衍生柱后衍生法是将样品经离子交换柱分离后进行衍生；柱前衍生法是将样品制成适当的衍生物再进行柱前衍生法是将样品制成适当的衍生物再进行HPLCHPLC分分离离。你现在浏览的是第五十页，共151页第一节第一节 氨基酸类药品检验氨基酸类药品检验衍生衍生可可改善被测物的检测特性改善被测物的检测特性，且且可可改变分离选择特改变分离选择特性，经衍生化的氨基酸可用性，经衍生化的氨基酸可用紫外紫外或或荧光检测器荧光检测器检测。检测。据文献报道，用据文献报道，用邻苯二甲醛邻苯二甲醛柱前衍生和荧光检测的反柱前衍生和荧光检测的反相高效液相色谱法

43、测定复方氨基酸注射剂中氨基酸含相高效液相色谱法测定复方氨基酸注射剂中氨基酸含量，量，检测限检测限为为pgpg水平水平。用用异硫氰酸苯酯异硫氰酸苯酯柱前衍生紫外检测反相柱前衍生紫外检测反相HPLCHPLC定量测定定量测定植物中氨基酸含量，检测限植物中氨基酸含量，检测限8.11-13.3pmol/L8.11-13.3pmol/L。用用亚硝酸亚硝酸衍生化，紫外检测的反相衍生化，紫外检测的反相HPLCHPLC定量测定人体定量测定人体内的内的乙酰半胱氨酸乙酰半胱氨酸，检测限为，检测限为170nmol170nmol。用用N-N-芘基马来酰亚胺修饰芘基马来酰亚胺修饰N-N-乙酰半胱氨酸乙酰半胱氨酸，用荧光检

44、，用荧光检测的反相测的反相HPLCHPLC测定，定量限为测定，定量限为32nmol32nmol。你现在浏览的是第五十一页，共151页第一节第一节 氨基酸类药品检验氨基酸类药品检验1111、其他仪器分析方法、其他仪器分析方法其他一些仪器分析方法也可用于氨基酸的含量测定。其他一些仪器分析方法也可用于氨基酸的含量测定。如杜鸣等在荧光计上附加如杜鸣等在荧光计上附加互相垂直的偏振片互相垂直的偏振片消除溶剂消除溶剂散射光的影响和苯丙氨酸的干扰，用散射光的影响和苯丙氨酸的干扰，用偏振荧光光度法偏振荧光光度法同时测定氨基酸注射液及动植物浸出液中酪氨酸和色同时测定氨基酸注射液及动植物浸出液中酪氨酸和色氨酸的含量

45、。氨酸的含量。你现在浏览的是第五十二页，共151页第二节第二节 多肽因子类和蛋白质类药品检多肽因子类和蛋白质类药品检验验蛋白质和多肽因子是生物体内广泛存在的生化物质，具蛋白质和多肽因子是生物体内广泛存在的生化物质，具多种生理功能，是一大类非常重要的生化药物。多种生理功能，是一大类非常重要的生化药物。蛋白质蛋白质是呈两性解离的电解质，其离子基因除末端氨基是呈两性解离的电解质，其离子基因除末端氨基和末端羧基外，还有侧链上的酸性或碱性基团，各种蛋和末端羧基外，还有侧链上的酸性或碱性基团，各种蛋白质分子有各自的白质分子有各自的等电点等电点，在等电点时蛋白质的溶解度，在等电点时蛋白质的溶解度最小，稳定性

46、差，易从溶液中沉淀析出。最小，稳定性差，易从溶液中沉淀析出。蛋白质对水亲和力很大，在可水溶液中形成亲水胶体。蛋白质对水亲和力很大，在可水溶液中形成亲水胶体。蛋白质分子构象受热、超声波、紫外光照射等物理因素蛋白质分子构象受热、超声波、紫外光照射等物理因素和酸、碱、重金属、有机溶剂等因素的影响而变化和酸、碱、重金属、有机溶剂等因素的影响而变化。蛋白质蛋白质变性变性后后失去生物活性和结晶能力失去生物活性和结晶能力，同时黏度、溶，同时黏度、溶解度、沉降系数和扩散系数也会发生变化。解度、沉降系数和扩散系数也会发生变化。你现在浏览的是第五十三页，共151页第二节第二节 多肽因子类和蛋白质类药品多肽因子类和

47、蛋白质类药品检验检验多肽因子类药物多肽因子类药物指分子量不算太大的，在体内含量极指分子量不算太大的，在体内含量极微，但却发挥极大生理作用的一类生物活性物质。微，但却发挥极大生理作用的一类生物活性物质。其中包括天然动物体内提取的药物如干扰素、白细胞其中包括天然动物体内提取的药物如干扰素、白细胞介素、胸腺肽、转移因子等和通过现代基因工程技术介素、胸腺肽、转移因子等和通过现代基因工程技术生产的药品如重组人干扰素、重组白细胞介素、重组生产的药品如重组人干扰素、重组白细胞介素、重组乙肝疫苗等。乙肝疫苗等。天然来源天然来源的多肽因子药物（如胸腺肽、转移因子等）的多肽因子药物（如胸腺肽、转移因子等）其分析方

48、法与蛋白质类药物的分析方法基本相同其分析方法与蛋白质类药物的分析方法基本相同。以以基因工程重组技术生产基因工程重组技术生产的多肽因子类药物分析方法的多肽因子类药物分析方法与蛋白质类药物的分析方法差异较大。与蛋白质类药物的分析方法差异较大。你现在浏览的是第五十四页，共151页第二节第二节 多肽因子类和蛋白质类药品多肽因子类和蛋白质类药品检验检验一、多肽因子类药物的定性鉴别一、多肽因子类药物的定性鉴别基因重组多肽因子类药物的基因重组多肽因子类药物的鉴别鉴别主要采用主要采用SDS-PAGESDS-PAGE法法和和免疫印迹法免疫印迹法。1 1、SDS-PAGESDS-PAGE法法用用SDS-PAGES

49、DS-PAGE鉴别生物样品必须是该品有鉴别生物样品必须是该品有极纯的标准对极纯的标准对照品照品，通过电泳结果的对比，确定所测样品是否与标，通过电泳结果的对比，确定所测样品是否与标准品有准品有相同的迁移率相同的迁移率，从而鉴别该品。，从而鉴别该品。缺点缺点：必须有标准品；：必须有标准品；凝胶中多肽凝胶中多肽需需保留生物活性，保留生物活性，或能或能够复性够复性，或电泳前可将检测配基，或电泳前可将检测配基与待与待测多肽共价测多肽共价交联交联。你现在浏览的是第五十五页，共151页第二节第二节 多肽因子类和蛋白质类药品多肽因子类和蛋白质类药品检验检验2 2、蛋白质蛋白质免疫印迹免疫印迹电泳电泳法（转移电

50、泳、法（转移电泳、western blotwestern blot）原原理理：借借助助聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶技技术术，将将生生物物活活性性物物质质高高效效分分离离，分分离离后后的的样样品品可可以以原原位位、定定量量驱驱动动或或吸吸印印在在另另一一种种固固相相载载体体（通通常常用用醋醋酸酸纤纤维维素素薄薄膜膜，简简称称NCNC膜膜）上上，能能保保持持原原有有的的生生物物活活性性，可可以以进进行行各各种种生生物物检检测测、免疫识别、扫描、积分和保存。免疫识别、扫描、积分和保存。你现在浏览的是第五十六页，共151页第二节第二节 多肽因子类和蛋白质类药品多肽因子类和蛋白质类药品检验检验（1 1）