蛋白质分分离纯化和表征精选课件.ppt

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1、关于蛋白质分分离纯化和表征第一页，本课件共有41页一、蛋白质的酸碱性质一、蛋白质的酸碱性质 蛋白质分子中有很多酸性和碱性解离基团，是具蛋白质分子中有很多酸性和碱性解离基团，是具有有两性解离性质两性解离性质的化合物。各种解离基团的解离度的化合物。各种解离基团的解离度与溶液的与溶液的pH有关，有关，pH越低，碱性解离度越大，蛋白越低，碱性解离度越大，蛋白质分子带正电荷越多，负电荷越少；质分子带正电荷越多，负电荷越少；pH升高，则解升高，则解离情况相反。离情况相反。第二页，本课件共有41页等电点（等电点（pI）:在特定在特定pH条件下，某种蛋白质分子条件下，某种蛋白质分子所带正负电荷相等，静电荷为零

2、，这一所带正负电荷相等，静电荷为零，这一pH 称为该称为该蛋白质的等电点（蛋白质的等电点（pI）。）。几种蛋白质等电点几种蛋白质等电点第三页，本课件共有41页 等电等电pH并不是一个恒定的值，它会因溶液中盐的种类并不是一个恒定的值，它会因溶液中盐的种类和离子强度的影响而有所不同。和离子强度的影响而有所不同。等离子点等离子点(isoionic piont):蛋白质在纯水溶液中的带电蛋白质在纯水溶液中的带电状态则没有其他离子干扰，完全由状态则没有其他离子干扰，完全由H+的解离和结合来决的解离和结合来决定，这种条件下的等电点称为等离子点。等离子点是蛋白定，这种条件下的等电点称为等离子点。等离子点是蛋

3、白质的特征性常数。质的特征性常数。第四页，本课件共有41页二、蛋白质的分子大小与分子量的测定二、蛋白质的分子大小与分子量的测定蛋白质的分子量的范围：蛋白质的分子量的范围：6106103 31101106 6 Da Da。第五页，本课件共有41页（一）根据化学组成测定最低相对分子量（一）根据化学组成测定最低相对分子量 用化学分析方法测出蛋白质中某一微量元素的含用化学分析方法测出蛋白质中某一微量元素的含量。并假设蛋白质分子中含有一个被测元素的原子，量。并假设蛋白质分子中含有一个被测元素的原子，则可由此计算出蛋白质的最低分子量。则可由此计算出蛋白质的最低分子量。例：肌红蛋白和血红蛋白含铁量均为例：肌

4、红蛋白和血红蛋白含铁量均为0.335%,计计 算二者的相对分子质量。算二者的相对分子质量。最低相对分子量最低相对分子量 x 100 =铁的百分含量铁的百分含量 铁的原子量铁的原子量0.335 55.8x 100=16700测定蛋白质相对分子量的原理和方法测定蛋白质相对分子量的原理和方法也可以利用蛋白质中含量特少的也可以利用蛋白质中含量特少的aa，用同样的原，用同样的原理计算蛋白质的最低分子量。理计算蛋白质的最低分子量。第六页，本课件共有41页（二）渗透压法测定相对分子量（二）渗透压法测定相对分子量 渗透压法测定渗透压法测定Mr操作简单，操作简单，Mr在在10-100 kDa时较准，但不能区别时

5、较准，但不能区别蛋白质分子是否均一蛋白质分子是否均一。渗透压公式：渗透压公式：Mr=RTlimc0c(c=质量浓度，质量浓度，g/mol)第七页，本课件共有41页（三）沉降分析测定（三）沉降分析测定Mr 在强大的离心场中，如果蛋白质溶液的密度大于在强大的离心场中，如果蛋白质溶液的密度大于溶液密度，溶液中的蛋白质会发生沉降。溶液密度，溶液中的蛋白质会发生沉降。沉降速度决定于蛋白质的分子量、分子密度、沉降速度决定于蛋白质的分子量、分子密度、分子形状和溶剂的密度、粘度。分子形状和溶剂的密度、粘度。沉降系数（沉降系数（20,w）：单位离心场强度时的）：单位离心场强度时的沉降速度。定义沉降速度。定义11

6、0-13秒（斯维得贝格单位）秒（斯维得贝格单位）沉降速度法沉降速度法 沉降平衡法沉降平衡法第八页，本课件共有41页（四）凝胶过滤法测定（四）凝胶过滤法测定Mr 凝胶过滤（层析）可按照蛋白质分子量大小进行凝胶过滤（层析）可按照蛋白质分子量大小进行分离的技术分离的技术，同时可以测定蛋白质分子量。同时可以测定蛋白质分子量。蛋白质通过凝胶柱的速度即洗脱体积与其分子量有关蛋白质通过凝胶柱的速度即洗脱体积与其分子量有关:先测得几种标准蛋白质的先测得几种标准蛋白质的Ve Ve（VeVe为洗脱体积）为洗脱体积），并，并以其分子量对数对以其分子量对数对VeVe作图得作图得一直线，再测出待测样品的一直线，再测出待

7、测样品的VeVe，查标准曲线即可确定分，查标准曲线即可确定分子量，并以其分子量对数对子量，并以其分子量对数对VeVe作图得一直线，再测出待作图得一直线，再测出待测样品的测样品的VeVe，查标准曲线即，查标准曲线即可确定分子量。可确定分子量。LogMLogMA AB BC CLogMLogM测测V V测测第九页，本课件共有41页（五）（五）SDS-PAGE法测定法测定Mr 聚丙烯酰胺凝胶电泳具有较高分辨率，用它聚丙烯酰胺凝胶电泳具有较高分辨率，用它分离、检测蛋白质混合样品，主要是根据各蛋白分离、检测蛋白质混合样品，主要是根据各蛋白质各组分的电泳迁移率的不同。这种差异就蛋白质各组分的电泳迁移率的不

8、同。这种差异就蛋白质分子本身而言，主要与其所带净电荷以及分子质分子本身而言，主要与其所带净电荷以及分子量和形状有关。量和形状有关。当电泳体系中含有一定浓度的十二烷基硫酸钠当电泳体系中含有一定浓度的十二烷基硫酸钠（SDS）时，则得电泳迁移率的大小只取决于蛋）时，则得电泳迁移率的大小只取决于蛋白质的分子量，从而可直接由电泳迁移率推算出白质的分子量，从而可直接由电泳迁移率推算出蛋白质的分子量。蛋白质的分子量。第十页，本课件共有41页聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）0.5 1.0kD33022067603618.5kD9467433020.114.4Mol masskD3002

9、0010080605040302010Migration(Rf)Pharmacia:Molecular Markers for electrophoresis第十一页，本课件共有41页1蛋白质胶体溶液的稳定性蛋白质胶体溶液的稳定性 蛋白质颗粒大小属于胶体粒子的范围蛋白质颗粒大小属于胶体粒子的范围(1-100 nm)。又由于。又由于其分子表面有许多极性基团，亲水性极强，易溶于水成为稳定其分子表面有许多极性基团，亲水性极强，易溶于水成为稳定的亲水胶体溶液。的亲水胶体溶液。蛋白质亲水胶体的稳定性主要取决于两个因素：蛋白质亲水胶体的稳定性主要取决于两个因素：l 双电层双电层l 水化层水化层 a.丁达尔

10、效应丁达尔效应 b.布朗运动布朗运动 c.不能透过半透膜不能透过半透膜三、胶体性质与蛋白质的沉淀三、胶体性质与蛋白质的沉淀第十二页，本课件共有41页2蛋白质的沉淀蛋白质的沉淀 蛋白质胶体溶液的稳定性是有条件的，相对的。蛋白质胶体溶液的稳定性是有条件的，相对的。假若改变环境条件，破坏其水化膜和双电层，蛋白质假若改变环境条件，破坏其水化膜和双电层，蛋白质亲水胶体便失去稳定性，发生絮结沉淀现象，这既是亲水胶体便失去稳定性，发生絮结沉淀现象，这既是所谓的蛋白质沉淀作用。所谓的蛋白质沉淀作用。盐析法（盐析法（salting out）：中性盐（中性盐（NH4SO4，NaSO4，NaCl等）等）蛋白蛋白 质

11、脱去水化层。质脱去水化层。优点：不引起蛋白质变性。优点：不引起蛋白质变性。盐溶（盐溶（salting in）：稀盐溶液中蛋白质溶解度增）：稀盐溶液中蛋白质溶解度增 加的现象。加的现象。第十三页，本课件共有41页 有机溶剂沉淀法：有机溶剂沉淀法：极性有机溶剂（甲醇，乙醇，丙酮）极性有机溶剂（甲醇，乙醇，丙酮）脱去水脱去水 化层以及降低介电常数化层以及降低介电常数 而增加带电质点间的相而增加带电质点间的相 互作用。互作用。条件：低温操作，缩短时间。条件：低温操作，缩短时间。重金属盐沉淀法：重金属盐沉淀法：当溶液当溶液pHpI,蛋白质颗粒带负电荷蛋白质颗粒带负电荷,易与重金属离子易与重金属离子 (H

12、g2+,Pb2+,Cu2+,Ag+等等)生成沉淀。生成沉淀。生物碱试剂和某些酸类沉淀法：生物碱试剂和某些酸类沉淀法：生物碱试剂生物碱试剂能引起生物碱沉淀的一类试剂。能引起生物碱沉淀的一类试剂。当溶当溶 液液pHpI时时,蛋白质颗粒带正电荷蛋白质颗粒带正电荷 易与生物碱试剂易与生物碱试剂,酸根负离子反应酸根负离子反应沉淀沉淀 用途：临床除去体液中干扰测定的蛋白质用途：临床除去体液中干扰测定的蛋白质第十四页，本课件共有41页加热变性测定法加热变性测定法原因：加热变性使蛋白质天然结构解体，疏水基外原因：加热变性使蛋白质天然结构解体，疏水基外 露，损坏了水化层露，损坏了水化层 用途：制豆腐（加热用途：

13、制豆腐（加热+少量盐卤）少量盐卤）第十五页，本课件共有41页1.定义：定义：在某些物理或化学因素作用下，天然蛋白质严密的空在某些物理或化学因素作用下，天然蛋白质严密的空间结构被破坏，从而导致理化性质改变和生物学活性的丧间结构被破坏，从而导致理化性质改变和生物学活性的丧失（如酶失去催化活力，激素丧失活性），则称之为蛋白失（如酶失去催化活力，激素丧失活性），则称之为蛋白质变性作用质变性作用(denaturation)。有些蛋白质的变性是可逆的，通过适当的方法（如有些蛋白质的变性是可逆的，通过适当的方法（如透析）将变性剂除去后，蛋白质可以恢复其天然立体结透析）将变性剂除去后，蛋白质可以恢复其天然立体

14、结构，这个过程称为复性（构，这个过程称为复性（renaturation）。）。一般认为蛋白质变性本质是次级键的破坏，只有空间一般认为蛋白质变性本质是次级键的破坏，只有空间构象的改变，并不涉及一级结构（共价键）的变化。构象的改变，并不涉及一级结构（共价键）的变化。四、蛋白质的变性与复性四、蛋白质的变性与复性第十六页，本课件共有41页第十七页，本课件共有41页 化学因素：化学因素：强酸、强碱、有机溶剂、重金属盐、强酸、强碱、有机溶剂、重金属盐、生物碱试剂、尿素等生物碱试剂、尿素等 物理因素：加热、射线、超声波、剧烈震荡等物理因素：加热、射线、超声波、剧烈震荡等2.变性因素变性因素第十八页，本课件共

15、有41页l 旋光值改变旋光值改变l 特性粘度增加特性粘度增加l 溶解度降低溶解度降低l 扩散系数降低扩散系数降低l 结晶能力丧失结晶能力丧失l 易于沉淀，若加热还会凝固。但若远离等电点易于沉淀，若加热还会凝固。但若远离等电点 则不一定沉淀则不一定沉淀l 变性后蛋白质肽键暴露而更加易于消化变性后蛋白质肽键暴露而更加易于消化3.变性后蛋白质的表现变性后蛋白质的表现第十九页，本课件共有41页变性蛋白质为什么能复性？变性蛋白质为什么能复性？在一定的环境条件下，蛋白质的一级结构在一定的环境条件下，蛋白质的一级结构能够决定二、三、四级结构。变性蛋白质的二、能够决定二、三、四级结构。变性蛋白质的二、三、四级

16、结构虽然遭到破坏，但是一级结构仍三、四级结构虽然遭到破坏，但是一级结构仍然保持不变，因此除去变性剂后，在适当的环然保持不变，因此除去变性剂后，在适当的环境条件下，蛋白质能卷曲折叠成为能量最低的境条件下，蛋白质能卷曲折叠成为能量最低的构象，一般天然蛋白质正是具有这种能量最低构象，一般天然蛋白质正是具有这种能量最低的构象。的构象。第二十页，本课件共有41页五、蛋白质分离纯化的一般原则五、蛋白质分离纯化的一般原则l 根据分子量：如沉降速度法离心根据分子量：如沉降速度法离心l 根据密度：沉降平衡法离心根据密度：沉降平衡法离心l 根据电荷和分子量：聚丙烯酰胺凝胶电泳根据电荷和分子量：聚丙烯酰胺凝胶电泳l

17、 根据分子量和分子形状：凝胶过滤根据分子量和分子形状：凝胶过滤l 根据溶解度：硫酸铵分级沉淀、有机溶剂分级沉淀根据溶解度：硫酸铵分级沉淀、有机溶剂分级沉淀l 根据电荷：等电点沉淀根据电荷：等电点沉淀第二十一页，本课件共有41页六、蛋白质的分离纯化方法六、蛋白质的分离纯化方法 透析：利用半透膜的选择通透性来纯化象蛋白质这样透析：利用半透膜的选择通透性来纯化象蛋白质这样的大分子物质的过程叫透析。的大分子物质的过程叫透析。超过滤：是利用压力或离心力，强行使水和其他小分子超过滤：是利用压力或离心力，强行使水和其他小分子溶质通过半透膜，而蛋白质分子被截留在膜上，以达到浓溶质通过半透膜，而蛋白质分子被截留

18、在膜上，以达到浓缩和脱盐的目的，有时要用切向流过滤法。缩和脱盐的目的，有时要用切向流过滤法。（一）根据分子大小不同的分离纯化方法（一）根据分子大小不同的分离纯化方法第二十二页，本课件共有41页凝胶过滤法凝胶过滤法 凝胶过滤（层析）是按照蛋白质分子凝胶过滤（层析）是按照蛋白质分子量大小进行分离的技术，又称之凝胶过滤，量大小进行分离的技术，又称之凝胶过滤，分子筛层析或排阻层析。分子筛层析或排阻层析。凝胶颗粒内部具有多孔网状结构，被分离凝胶颗粒内部具有多孔网状结构，被分离的混合物流过层析柱时，比凝胶孔径大的分的混合物流过层析柱时，比凝胶孔径大的分子不能进入凝胶孔内，在凝胶颗粒之间的空子不能进入凝胶孔

19、内，在凝胶颗粒之间的空隙向下移动，并最先被洗脱出来；比网孔小隙向下移动，并最先被洗脱出来；比网孔小的分子能不同程度的自由出入凝胶孔内外，的分子能不同程度的自由出入凝胶孔内外，在柱内经过的路程较长移动速度较慢，最后在柱内经过的路程较长移动速度较慢，最后被洗脱出来。被洗脱出来。第二十三页，本课件共有41页第二十四页，本课件共有41页（二）利用溶解度差别的纯化方法（二）利用溶解度差别的纯化方法 影响蛋白质溶解度的外部因素很多，其中主要有：影响蛋白质溶解度的外部因素很多，其中主要有：溶液的溶液的pH、离子强度、介电常数和温度。溶解度归根、离子强度、介电常数和温度。溶解度归根结底取决于他们本身的分子结构

20、。结底取决于他们本身的分子结构。等电点沉淀技术：在等电点等电点沉淀技术：在等电点pH条件下，蛋白质为电中条件下，蛋白质为电中性，其物理性质如导电性、溶解度、黏度、渗透压等性，其物理性质如导电性、溶解度、黏度、渗透压等都表现为最低值，易发生絮结沉淀。因此，等电点性都表现为最低值，易发生絮结沉淀。因此，等电点性质常被用于蛋白质的分离制备，被称为等电点沉淀技质常被用于蛋白质的分离制备，被称为等电点沉淀技术。术。第二十五页，本课件共有41页 盐析：当离子强度增加到足够高时，例如饱盐析：当离子强度增加到足够高时，例如饱和或半饱和的程度，很多蛋白质可以从水溶和或半饱和的程度，很多蛋白质可以从水溶液中沉淀出

21、来，这种现象称为盐析。液中沉淀出来，这种现象称为盐析。有机溶剂分级分离法：引起蛋白质沉淀的主有机溶剂分级分离法：引起蛋白质沉淀的主要原因是改变了介质的介电常数。要原因是改变了介质的介电常数。温度对蛋白质溶解度的影响：温度对蛋白质溶解度的影响：0-40之间，之间，大部分球状蛋白质的溶解度随温度的升高而大部分球状蛋白质的溶解度随温度的升高而增加。增加。第二十六页，本课件共有41页（三）根据电荷不同的纯化方法（三）根据电荷不同的纯化方法 电泳电泳：在外电场的作用下，带电颗粒向着与其电性在外电场的作用下，带电颗粒向着与其电性相反的电极移动，这种现象称为电泳。相反的电极移动，这种现象称为电泳。原则上按电

22、泳的原理来分，可分为：原则上按电泳的原理来分，可分为：l自由界面电自由界面电l区带电泳区带电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳（聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）三种物理效应：样品的浓缩效应、分子筛效应和电荷三种物理效应：样品的浓缩效应、分子筛效应和电荷效应。效应。第二十七页，本课件共有41页CH2=CHC=ONH2丙烯酰胺丙烯酰胺N,N-甲叉甲叉双丙烯酰胺双丙烯酰胺CH2=CH C=O NH CH2 NH C=O CH2=CH聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺CH2-CHC=ONH2CH2-CH C=O NH CH2 NH C=O CH2-CHCH2 CHC=ONH2CH2-CHC=ONH2CH2-CHCH2-CHCH2-

23、CHC=ONH2CH2-CHCH2-CH()n()n()m()m第二十八页，本课件共有41页Tris-Gly pH=8.3Tris-Gly pH=8.3Tris-HCl pH=6.8T=3%Tris-HCl pH=8.9T=7.5%第二十九页，本课件共有41页聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）0.5 1.0kD33022067603618.5kD9467433020.114.4Mol masskD30020010080605040302010Migration(Rf)Pharmacia:Molecular Markers for electrophoresis第三十页，本

24、课件共有41页第三十一页，本课件共有41页 此法是利用离子交换树脂作为柱层析支持物，将带此法是利用离子交换树脂作为柱层析支持物，将带有不同电荷的蛋白质进行分离的方法。有不同电荷的蛋白质进行分离的方法。若选择阳离子交换树脂，则带正电荷的物质与若选择阳离子交换树脂，则带正电荷的物质与H+发发生交换而结合在树脂上。生交换而结合在树脂上。若选择阴离子交换树脂，则带负电荷的物质可与若选择阴离子交换树脂，则带负电荷的物质可与OH-发生交换而结合在树脂上。发生交换而结合在树脂上。物质在树脂上结合的牢固程度即亲和力大小有差异，物质在树脂上结合的牢固程度即亲和力大小有差异，因此选用适当的洗脱液便可将混合物中的组

25、分逐个洗脱下因此选用适当的洗脱液便可将混合物中的组分逐个洗脱下来，达到分离纯化的目的。来，达到分离纯化的目的。离子交换：离子交换：第三十二页，本课件共有41页第三十三页，本课件共有41页（六）（六）亲和层析亲和层析 亲和层析法就是利用化学方法将可与待分离物亲和层析法就是利用化学方法将可与待分离物质可逆性特异结合的化合物（称配体）连接到某种质可逆性特异结合的化合物（称配体）连接到某种固相载体上，并将载有配体的固相载体装柱，当待固相载体上，并将载有配体的固相载体装柱，当待提纯的生物大分子通过此层析柱时，此生物大分子提纯的生物大分子通过此层析柱时，此生物大分子便与载体上的配体特异的结合而留在柱上，其

26、他物便与载体上的配体特异的结合而留在柱上，其他物质则被冲洗出去。然后再用适当方法使这种生物大质则被冲洗出去。然后再用适当方法使这种生物大分子从配体上分离并洗脱下来，从而达到分离提纯分子从配体上分离并洗脱下来，从而达到分离提纯的目的的目的。抗原和抗体抗原和抗体 激素和受体蛋白激素和受体蛋白 凝集素和糖蛋白凝集素和糖蛋白第三十四页，本课件共有41页配体配体蛋白质蛋白质蛋白质和配体蛋白质和配体复合物复合物交联试剂交联试剂载体载体配体配体载体与配体载体与配体交联体交联体杂质杂质杂质杂质游离配体游离配体第三十五页，本课件共有41页七、蛋白质的含量测定与纯度七、蛋白质的含量测定与纯度l 测定蛋白质的量是研

27、究蛋白质的最基本的一步。测定蛋白质的量是研究蛋白质的最基本的一步。l 溶液中蛋白质的浓度测定方法很多，最早的经典方法溶液中蛋白质的浓度测定方法很多，最早的经典方法是凯氏定氮法，稍后应用较广泛的方法是双缩脲法、福是凯氏定氮法，稍后应用较广泛的方法是双缩脲法、福林酚法和紫外吸收法，近年来大多数人用考马斯亮蓝林酚法和紫外吸收法，近年来大多数人用考马斯亮蓝法。法。（一）蛋白质的含量测定（一）蛋白质的含量测定第三十六页，本课件共有41页1.双缩脲法双缩脲法l双缩脲法是基于蛋白质分子中的肽键，凡具两双缩脲法是基于蛋白质分子中的肽键，凡具两个以上肽键的物质均会发生双缩脲反应。个以上肽键的物质均会发生双缩脲反

28、应。l在碱性溶液中蛋白质可以与在碱性溶液中蛋白质可以与Gu2形成紫红色形成紫红色络合物，其颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比，络合物，其颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比，而与蛋白质的分子量和氨基酸组成无关而与蛋白质的分子量和氨基酸组成无关。第三十七页，本课件共有41页2.福林酚法福林酚法l福林酚法主要基于蛋白质在碱性溶液中能与铜福林酚法主要基于蛋白质在碱性溶液中能与铜形成复合物，此复合物以及芳香族氛基酸残基可形成复合物，此复合物以及芳香族氛基酸残基可以还原酚试剂而产生蓝色，再与标准蛋白质以还原酚试剂而产生蓝色，再与标准蛋白质(通常通常采用牛血清白蛋内采用牛血清白蛋内)比色定量。比色定量。l福林福林酚

29、试剂法灵敏度高，但是如果样品和标准蛋白酚试剂法灵敏度高，但是如果样品和标准蛋白质的芳香族氨基酸差异较大时，会有较大的系统误差。质的芳香族氨基酸差异较大时，会有较大的系统误差。第三十八页，本课件共有41页3.紫外吸收法紫外吸收法 蛋白质组成中常含有酪氨酸等芳香族氨基酸，在蛋白质组成中常含有酪氨酸等芳香族氨基酸，在紫外光紫外光280nm波长处有最大吸收峰，故可用波长处有最大吸收峰，故可用280nm波长的光吸收即光密度的大小来测定一般蛋白波长的光吸收即光密度的大小来测定一般蛋白质的含量。质的含量。第三十九页，本课件共有41页4.考马氏亮蓝法考马氏亮蓝法l考马斯亮蓝考马斯亮蓝G-250是一种染料，在游离状态下呈红是一种染料，在游离状态下呈红色，与蛋白质结合则呈现蓝色。在一定范围内，溶色，与蛋白质结合则呈现蓝色。在一定范围内，溶液在液在595nm波长下的吸光度与蛋白质含量成正比，可波长下的吸光度与蛋白质含量成正比，可用比色法测定。用比色法测定。l本法试剂配制简单，操作简便，是一种常见的蛋白本法试剂配制简单，操作简便，是一种常见的蛋白质快速微量测定方法。质快速微量测定方法。第四十页，本课件共有41页感谢大家观看第四十一页，本课件共有41页