液相色谱柱的应用 ppt课件.ppt

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1、液相色谱柱的应用,高效液相色谱培训系列,目 录,一、液相色谱分离原理,二、液相色谱柱的结构,三、液相色谱柱的选择,四、色谱柱的使用,五、 分析条件的影响,六、色谱柱的维护,一、 HPLC分离原理,样品组分在流动相和固定相之间进行分配，由于不同组分在流动相和固定相之间的交互作用能力(吸附.分配.离子交换.分子尺寸等)不同，使得不同组分在色谱柱上的移动速率不一样，从而产生色谱分离。(必要条件),分配过程,分配系数 - K,K=K= 常数 （T恒定） Cm =组分在流动相中的浓度Cs = 组分在固定相中的浓度,容量因子k,是指在一定条件下，组分在两相间达到分配平衡时的质量比。 在实际工作中，常应用另

2、一表征色谱分配平衡过程的重要参数容量因子(capacity factor)，也称分配比(partition ratio)，以 k 表示。 k = Ms / Mm Ms为组分在固定相中的质量， Mm为组分在流动相中的质量,由保留时间计算出容量因子，即可由实验测定容量因子k,色谱理论：塔板理论-柱分离效能指标,色谱理论：速率理论-影响柱效的因素,速率理论是荷兰学者范弟姆特于1956年提出的, 表述了影响柱效的因素及提高柱效的多种途径，其核心是速率方程（也称范弟姆特方程式）。 速率方程H = A + B/u +Cu H：理论塔板高度；u：流动相的线速度,色谱理论：速率理论-影响柱效的因素,H = A

3、 + B/u +Cu,色谱理论：分离度,分离度：两个相邻组分的保留值之差与其平均峰宽之比。 R=2（TR2-TR1）/（W2+W1）计算表明：1：R0.8时，两组分不能完全分离2：R=1时，两组分峰重叠约2%3：R=1.5时，两组分峰完全分离。R值越大分离越好，反之则峰重叠愈多。降低柱温、增加柱长可使R提高。,样品组分的分离,液相色谱的基本流程图,流动相,泵,色谱柱,检测器,泵输液,分离,检测,记录,进样阀,进样,HPG-3x00RS 泵在整个流速范围下保持800 bar高压最高流速达到5 ml/minWPS-3000RS 自动进样器进样周期15 秒进样阀耐压1000 bar TCC-3000

4、RS 柱温箱5-110 C 温度范围柱后冷却DAD-3000RS检测器全波长扫描范围数据采集速率100 HzAcclaim 2 m色谱柱耐压800 bar Chromeleon CMS软件及时获得结果,UltiMate 3000 RSLC 快速分离液相,12/07/2019,13,高性能UltiMate 3000 x2 三元梯度系统,有六通道脱气机的溶剂架,独特的双梯度泵：两个三元梯度泵封装在一个机箱内,带温控选项的自动进样器,独特的柱温箱可放置两个柱切换阀,可变波长或二极管矩阵紫外可见光检测器,液相色谱柱的应用,二、色谱柱的结构和安装,色谱柱的构造,.色谱柱管 常用内壁抛光的不锈钢管作色谱柱

5、的柱管以获得高柱效。使用前柱管先用氯仿、甲醇、水依次清洗，再用50%的HNO3对柱内壁作钝化处理。钝化时使用HNO3在柱管内至少滞留10min，以在内壁形成钝化的氧化物涂层。色谱柱规格 内径：常用4.6mm，2.1mm 柱长：常用50，100，150，250cm,色谱柱的构造,色谱柱管由柱接头、柱管及滤片组装而成。 柱接头采用低死体积结构，柱接头两端是螺纹组件连接，中间放置压环用于密封。为了尽量减少柱外死体积，在安装色谱柱时，用1.57mm连接管通过空心螺钉压环后要尽量插到底，然后再拧紧空心螺钉。,色谱柱子的构造,不同厂家和型号的柱子会有一定的差别,液相色谱柱的构造,在两端柱接头内，柱管两端各

6、放置一片不锈钢滤片(或滤网)，用于封堵柱填料不被流动相冲出柱外而流失。空柱各组件均为不锈钢材质，能耐受一般的溶剂作用。但由于含氯化物的溶剂对其有一定的腐蚀性，故使用时要注意，柱及连接管内不能长时间存留此类溶剂，以避免腐蚀。,色谱柱的构造,柱填料： 液相色谱柱的分离作用是在填料与流动相之间进行的，柱子的分类是依据填料类型而定。常用颗粒粒径在310 m的范围内。 正相柱：多以硅胶为柱填料。另一类正相填料是硅胶表面键合CN，-NH2等官能团即所谓的键合相硅胶。 反相柱：主要是以硅胶为基质，在其表面键合十八烷基官能团(ODS)的非极性填料。 常用的其他的反相填料还有键合C8、C4、C2、 -NH2、苯

7、基等。,液相色谱柱的安装,色谱柱的安装： 拆开柱包装盒，确认色谱柱的类型、尺寸、出厂日期以及柱内贮存的溶剂。,液相色谱柱的安装,按柱管上标示的流动相流向， (如条件允许，建议在柱前使用保护柱)；柱的出口与检测器连接。连接管是外径为1.57mm、内径为0.1-0.3mm的链接管。 连接管通过空心螺钉、压环后尽量用力插到底，然后顺时针拧紧空心螺钉，直到拧不动为止。 如色谱柱通过流动相加压后有漏液现象，请用扳手继续顺时针拧14圈，直至不漏液为止。,连接接管必须注意：,色谱连接注意事项,1.尽量减少死体积,连接管线与接头,0.12mm内径管线用于毛细管HPLC中2000,分子量 流动相固定相 - 极性

8、流动相(正己烷, 异丙醇)- 非极性极性物质后出峰,反相色谱 极性:固定相 BC,反向色谱法,固定相（非极性）C18 , C8 , C4 , 苯基流动相(极性)Water,MeOH,MeCN,THF弱酸，弱碱,溶剂极性,各种反相填料的使用比例,反向色谱法,高极性流动相中极性流动相,极性:ABC,A B C,A B C,流动相,1. 反相色谱最常用的流动相及其冲洗强度如下： H2O甲醇乙腈乙醇丙醇异丙醇四氢呋喃 最常用的流动相组成是：“甲醇H2O”和“乙腈H2O”，由于乙腈的毒性大，价格贵，通常优先考虑“甲醇H2O”流动相。2. 正相色谱常用的流动相及其冲洗强度的顺序是： 正己烷乙醚乙酸乙酯异丙

9、醇 最常用的是正已烷，,不同混合溶剂的粘度比较,柱填料基质,硅胶基质- pH 28 Al2O3 . nH2O - pH114 聚合物基质 - pH114,高pH下, 硅胶会溶解低pH下, 键合相会断裂,化学修饰困难,孔结构复杂, 孔径不均匀，导致柱效不够高, 有机溶剂可能导致聚合物基质溶涨而受损,色谱柱的性能参数,物理性质,硅胶纯度色谱柱尺寸颗粒形状粒径表面积孔径,键合类型碳覆盖率封端,化学性质,色谱柱的物理性质,硅胶纯度填料硅胶的纯度与残留金属离子浓度色谱柱尺寸色谱柱子的长度和内径颗粒形状球型或不规则型粒径平均颗粒直径, 通常3-10m表面积颗粒外表面和内部孔表面的总和, 以m2/g表示孔径

10、 颗粒的孔或腔的平均尺寸, 范围80-300,硅胶纯度,A类硅胶由于带负电荷的残留硅羟基和酸性表面上金属含量高 (硅羟基的pKa低), 导致碱性化合物发生拖尾,B类硅胶 (高纯)由于金属含量低, 硅羟基pKa高, 碱性化合物不易发生拖尾,一般金属浓度 2, 000, 选择 300 的孔径,比表面积的比较,比表面积与孔径的影响,大孔径填料适用于大分子分析,大孔径300 全多孔色谱柱 可用于分离蛋白质和多肽,色谱柱填料孔径必须适合待测物分子自由进出填料孔, 与孔内表面的键合相进行分离分配,300 孔径可改善蛋白质和多肽峰形,选择合适的填料孔径分析大分子可获得最佳峰形,300 孔径可改善大分子的峰形

11、,色谱柱: 4.6 x 150 mm, 5 mm 流动相: 60% MeOH: 40% 0.1% 三氟乙酸 流速: 0.75 mL/min 温度: RT 检测器: UV 282 nm,溶液中的分子尺寸决定适宜的色谱柱孔径 窄的峰宽表明待测分子进入填料孔没有受到阻碍,分子量虽小但 体积较大的分子,色谱柱化学性质,键合类型 单齿键合 - 键合相分子与基体单点相连 双齿键合 - 键合相分子与基体多点相连碳覆盖率 与基体物质相连的键合相的量封端 键合步骤之后, 用短链将裸露的硅羟基键合后封闭起来,键合类型,键合类型对色谱分离的影响 ：单齿键合：提高传质速率, 加快色谱柱平衡双齿键合：增加色谱柱稳定性,

12、 增加色谱柱的载样量,碳载量,碳载量是指固定相中碳的含量不同的键合相有不同的键合密度，并决定固定相的本质。一般C18、C18的碳载量为10%14%，高的可达18%20%,碳载量,碳载量- 对色谱分离的影响 高碳载量：保留强，提高分辨率,分析时间长低碳载量：保留弱，缩短运行时间,碳载量,封端技术,封端 - 对色谱分离的影响 封端：减轻待测组份与硅胶表面残留的酸性硅羟基反应而引起的色谱峰拖尾现象对于极性样品和碱性样品，未封端与经过封端处理的色谱柱在选择性上有明显差异,固定相键合二甲基硅烷,封端四甲基硅烷,Si,O,OH,O,O,CH,3,Si,R,CH,3,CH,3,Si,CH,3,CH,3,Si

13、,R,CH,3,R = C8,C18,etc,.,O,OH,OH,O,CH,3,Si,R,CH,3,CH,3,Si,R,CH,3,+,+,Cl,CH,3,Si,CH,3,CH,3,OH,OH,OH,OH,CH,3,Cl,R,CH,3,(,TMS),传统键合及封端技术,三基封端技术（酰胺基）,PG=极性酰胺基，R1=空间保护的异丙基，R=烷基链柱子稳定性更好，寿命更长,超临界封端技术,传统封端：固-液回流封端，封端试剂和催化剂溶于有机溶剂中（甲苯），与键合相在有机溶剂沸腾温度回流数小时至数天不等。硅胶小孔难到达。超临界封端：封端试剂和催化剂由CO2超或亚临界流体传递，封端试剂在超或亚临界流体状态

14、下扩散系数是固-液回流状态的1000倍，能充分扩散到硅胶表面和小孔内部，只需要数小时就可以最大限度封闭活性硅羟基。,碱灭活测试,色谱柱 Diamonsil（钻石）C18 5um，250 x 4.6mm流动相 CH3OH/ H2O (49:51)流速 1.0 mL/min检测 UV254nm 如果硅胶表面已经被完全化学改性，乙基苯胺的三个异构体将不会与硅胶发生非极性作用力，所以不会分离并共同洗脱出来。,封端技术比较,保留值与pH的关系,pH变化值0.1,RS变化值1.6,色谱柱： C18 4.6 X 250mm, 5um流动相：27%甲醇：73%磷酸pH 2.5 & 2.6温度：500C流速：

15、1.0mL/min.,保留值与pH的关系,色谱柱: XDB-C8 4.6 x 75 mm, 3.5 m流动相: 44% 25 mM磷酸, pH 7.00 : 56% 甲醇流速: 1.0 mL/min 温度: 25C 检测: UV 250 nm,可电离的组份的分离可能会随pH变化发生显著变化 甚至很小的 0.050.25 个pH变化单位.,样品: ketoprofen ethyl paraben Hydrocortisone fenoprofen propyl paraben Propranolol ibuprofen,0.25 个pH,pH值对保留时间的影响,碱性条件保留时间随PH变化明显，P

16、H变化0.2，保留时间变化1.2min。,保留时间随PH变化不明显,酸性条件保留时间随PH变化明显,保留值与pH的关系,复杂组分的流动相pH选择技巧,色谱柱: Extend-C184.6 x 150 mm, 5 mm 流动相: 30% 缓冲液: 70% MeOH pH 7 缓冲液20 mM Na2HPO4 pH 11缓冲液 20 mM TEA 流速: 1.0 mL/min 温度: RT检测器: UV 254 nm,0 5,1,2, 3,4,5,Time (min),7,6,C18pH 7,1. Maleate 马来酸盐 2. Scopolamine 东莨菪碱 pKa 7.6 3. Pseudo

17、Ephedrine 假麻黄碱 pKa 9.8 4. Doxylamine 抗敏安(多西拉敏) pKa 9.2 5. Chlorpheniramine 氯苯吡胺pKa 9.1 6. Triprol内径ine 苯丙烯啶pKa 6.5 7. Diphenhydramine 苯海拉明 pKa 9.0,C18pH 11,0 5 10,1,2,3,4,Time (min),6,5,7,高pH下, 碱性成分的保留增加,待测物pKa+1.5以外的流动相pH可保证方法的稳定性,液相色谱柱的应用,四、色谱柱的使用,色谱柱的评价,色谱柱的评价,溶剂前处理,过滤：0.45um或0.22um孔径滤膜 目的：除去流动相和

18、样品溶剂中的微小颗粒，避免堵塞色谱柱，尤其是使用无机盐配制的缓冲液。试剂纯度：采用“ HPLC ”级溶剂对试样有适宜的溶解度,溶剂前处理,脱气 目的：除去流动相中溶解或因混合而产生的 气泡 气泡对测定的影响： 1）柱流量不准 2）检测器基线波动,返回,基线问题分析,液相色谱柱的使用,平衡色谱柱反相色谱柱在经过出厂测试后是保存在甲醇（乙腈）的。由于色谱柱在储存或运输过程中可能会干掉。硅胶柱或极性色谱柱在经过出厂测试后是保存在正庚烷（正己烷）中的。如果需要使用含水的流动相，使用流动相之前用异丙醇过渡。,液相色谱柱的使用,新色谱柱的平衡方法： 首先用0.3ml/min的流速将色谱柱平衡过夜，然后将流

19、速逐步升高到1.0ml/min冲洗30分钟，以便将色谱柱的填料充分平衡至最佳状态，这样可以保证色谱柱的使用寿命，并且保证在以后的使用中，获得分析结果的重现性。,液相色谱柱的使用,日常平衡色谱柱反相色谱柱使用1020倍柱体积的甲醇或乙腈平衡色谱柱，用流动相平衡色谱柱直到获得稳定的基线，如果您所使用的流动相中含有缓冲盐，应注意用90%甲醇或乙腈过渡。 缓冲盐或离子对试剂度需要较长的时间来平衡。 正相色谱柱在使用1020倍柱体积有机溶剂后用流动相平衡直到基线平稳。如果需要使用含水的流动相，在使用流动相之前用异丙醇过渡,色谱柱柱内体积和平衡时间,单次样品运行时间 = 分析时间 + 色谱柱平衡时间色谱柱

20、平衡时间 = 10倍柱内体积 流速,液相色谱柱的使用,流动相流速的选择： 因柱效是柱中流动相线性流速的函数，使用不同的流速可得到不同的柱效。对于一根特定的色谱柱，要追求最佳柱效，最好使用最佳流速。对内径为4.6mm的色谱柱，流速一般选择1mlmin，对于内径为4.0mm柱，流速0.8mlmin为佳。 当选用最佳流速时，分析时间可能延长。可采用改变流动相的洗涤强度的方法以缩短分析时间(如使用反相柱时，可适当增加甲醇或乙腈的含量)。,USP 允许调节的色谱条件范围,色谱柱子长度：70%色谱柱子内径：25%粒径：可减少50%流速： 50%柱温： 10流动相比例：较小比例的成分30%缓冲盐的浓度： 1

21、0%流动相PH： 0.5检测波长：不允许改变,五、分析条件调整的影响,流动相调整的基本原则（等度）,（1）由强到弱： 一般先用90%的乙腈(或甲醇)/水(或缓冲溶液)进行试验， 这样可以很快地得到分离结果，然后根据出峰情况调整有机溶剂(乙腈或甲醇)的比例。（2）三倍规则 ：每减少10%的有机溶剂(甲醇或乙腈)的量，保留因子约增加3倍，此为三倍规则。调整的过程中，注意观察各个峰的分离情况。（3）微调比例：当分离达到一定程度，应将有机溶剂10%的改变量调整为5%，并据此规则逐渐降低调整率，直至各组分的分离情况不再改变。,样品溶剂溶解强度的影响,样品溶剂溶解能力强于流动相导致色谱峰峰形问题：裂分峰,

22、色谱柱: ZORBAX C18, 4.6 x 150 mm, 5 um 流动相: 82% H2O : 18% ACN检测波长: 215nm,A.样品溶剂100% 乙腈,0 10,Time (min),1,2,B.样品溶剂流动相,0 10,Time (min),1,2,样品: (安痛片)1. 咖啡因2. 水杨酰胺,样品溶剂溶解强度的影响,戴安Ultimate 3000色谱柱：Dionex acclaim C18，250*4.6mm流动相：磷酸二氢钠6.0g，加水1000ml，加 三乙胺1ml，用氢氧化钠溶液调PH 至7.0-甲醇（75：25）检测波长：254nm流速：1.0ml/min样品溶剂溶

23、解能力强于流动相导致色谱峰峰形问题：峰前伸和裂分峰,1.溶剂峰2. 4-N-去甲基安乃近3.安乃近,溶剂：100%甲醇,溶剂：80%甲醇,缓冲液对中性物质的影响,色谱柱: ZORBAX Eclipse XDB-C18, 4.6 x 75 mm, 3.5 m 流动相: 44% A : 56% 甲醇流速: 1.0 mL/min 温度: 25C 检测: UV 250 nm,含缓冲液的流动相可改善保留, 分离和色谱峰峰形.,A = 水,A = 水+25 mM 磷酸盐缓冲液,1酮 2泊金乙酯 3可的松 4诺洛芬 5泊金丙酯 6普萘洛尔 7布洛芬,增加缓冲液浓度减少拖尾,色谱柱: Eclipse XDB-

24、C84.6 x 150 mm, 5 um流动相:40% 磷酸盐缓冲液60% ACN流速:1.5 mL/min.温度:40C,USP Tf1.621.651.631.771.831.12,10 mM 磷酸盐pH 7.0,USP Tf1.411.501.331.391.361.00,25 mM 磷酸盐pH 7.0,在中等pH下, 离子强度较高, 能有效掩蔽硅羟基的二次作用减少拖尾,随缓冲盐浓度升高，Rt降低,流动相pH值的选择,酸性分析物：pHpKa-2碱性分析物：pHpKa+2,反相HPLC常用缓冲液,缓冲液pKapH范围磷酸盐pK12.11.13.1柠檬酸盐pK13.12.14.1甲酸盐3.8

25、2.8 4.8 柠檬酸盐pK24.73.75.7 乙酸盐4.83.85.8 柠檬酸盐pK35.44.46.4 磷酸盐pK27.26.28.2羟甲基甲胺8.37.39.3 氨9.28.210.2 硼酸盐9.28.210.2 甘氨酸9.88.810.8 1-甲基-哌啶10.39.311.3 四氢化吡咯10.59.511.5 二乙胺10.59.511.5 三乙胺10.79.711.7 磷酸盐pK312.311.313.3,缓冲液的一般有效缓冲范围为PK1pH。,三乙胺对碱性成分峰形的影响,0 2.5 5.0,Time (min),1,2,3,4,5,色谱柱: XDB-C8, 4.6 x 150 mm

26、, 5 mm 流动相: 85% 25 mM Na2HPO4 : 15% ACN 流速: 1.0 mL/min. 温度: 35C,USP TF 5%1. 1.292. 1.333. 1.634. 2.355. 1.57,No TEA,10 mM TEA,USP TF 5%1. 1.192. 1.183. 1.204. 1.265. 1.14,样品:1. 去甲麻黄碱 2. 麻黄素3. 苯丙胺 4. 脱氧麻黄碱5. 苯丁胺,酸对酸性组分的峰形的影响,色谱柱:ZORBAX StableBond SB-C18 4.6 x 150 mm, 5 mm流动相: 40% A: 60% ACN流速: 1.0 mL

27、/min.温度: 室温样品: 异丁苯丙酸， pKa 4.4,pH 35 mM NaH2PO4,Tf = 1.8,pH 35 mM NaH2PO41% 乙酸,pH 2.50.1% 三氟乙酸,Tf = 1.0,Tf = 1.09,A:,乙酸和三氟乙酸均能作为酸性调节剂加至流动相中,柱容量对峰型的影响,41.4 mmoverloaded,4.6 mmoverloaded,4.6 mm,液相色谱柱: ZORBAX Eclipse XDB-C18色谱柱尺寸: 4.6 x 250 mm 5mUV: 254 nm 流速: 1 mL/ min.,UracilButylparabenNaphthaleneDip

28、ropylphthalateAcenaphthene,尿嘧啶尼帕尔金丁酯萘二丙基邻苯二甲酸酯苊,刻度混合: 比例阀 A: 水 B: 甲醇, 用泵抽取50% B,体积比混合: V/V250 mL水 + 250 mL甲醇, 用泵抽取100%混合液,定容混合:250 mL甲醇, 用水定容至500 mL, 用泵抽取100%混合液,重量比混合: (w/w) 200 g甲醇 + 200 g水, 用泵抽取100%混合液,流动相配比的影响,等度和梯度的影响,色谱柱： Dionex acclaim C18，250*4.6mm ，柱温 ：25，波长 ：203nm流速 ： 1.0ml/min 样品：人参皂苷Rg1

29、1.等度：乙腈：水（22：78）为流动相2.梯度：乙腈：水为流动相 0min 20 : 80 20min 40 : 60,等度和梯度获得柱效不同,柱效2.1万,柱效6万,液相色谱柱的应用,六、色谱柱的维护,色谱柱的保存,色谱柱的保存,短期不用必须冲洗干净后保存.,长期不用每隔23个月冲洗一次,防止碰撞和强烈振动,色谱柱的维护保养,购买新柱后一定要仔细阅读说明书，确认柱的使用条件以及 清洗再生步骤，按照说明书条件测试色谱柱柱效，记录使用压力定期检测柱压和柱效不同流动相之间转换时应注意溶剂的互溶性确认样品不会在流动相中析出或带有固体不溶物，请使用 0.45um或0.22um的一次性滤膜过滤样品，或

30、者进行前处理。为了延长色谱柱使用寿命，请使用保护柱。定期用合适的溶剂清洗或再生色谱柱长期不用时，清洗干净后，使用柱子说明书中指明的溶剂保 存。柱子要从仪器上卸下并用堵头密封后保存。定期用合适的流动相清洗保存的柱子，避免干涸。,色谱柱易出现的问题,谱图分叉 柱头塌陷?,修补前后现象,1,3,2,1,3,2,样品问题,2,4,3,1,常见问题及解决方法,资料,色谱柱子污染对比,正常 污染后,色谱柱的修复,柱头塌陷修复办法,拧下柱头螺帽(最好在台虎钳上)用尖针轻轻除掉柱头表面的污染填料取少量与色谱柱相同的新填料,调成浆糊状(正相用正己烷,反相用甲醇)填实柱头(轻轻下压)更换柱头过滤板,将柱头螺帽拧紧,液相色谱柱再生,反相色谱柱用以下溶剂至少各25mL冲洗色谱柱(分析柱) 不含缓冲盐的流动相100%甲醇100%乙腈75%乙腈+25%异丙醇100%异丙醇100%二氯甲烷 100%正己烷100%异丙醇100%甲醇,冲洗色谱柱要用比流动相更强的溶剂,液相色谱柱再生,正相色谱柱用以下溶剂至少各50mL冲洗色谱柱(分析柱) 50%甲醇+50%三氯甲烷100%乙酸乙酯,Thank You !,