实验聚丙烯酰胺.pptx

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1、 实验实验 聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白电泳分离血清蛋白1111级医学检验四小组级医学检验四小组实验目的u掌握盘状聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原理掌握盘状聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原理u熟悉盘状聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作技术熟悉盘状聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作技术实验原理以聚丙烯酰胺凝胶做支持物的电泳技术以聚丙烯酰胺凝胶做支持物的电泳技术是聚丙烯酰胺凝胶电泳（是聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGEPAGE）。）。聚丙烯酰胺凝胶是聚丙烯酰胺凝胶是单体聚丙烯酰胺单体聚丙烯酰胺（Acr)Acr)和和交联剂甲叉双丙烯酰胺交联剂甲叉双丙烯酰胺(Bis)(Bis)交联而成的，催化剂为交联而成的，催化剂为过硫酸

2、铵过硫酸铵(AP)(AP)，加速剂为四甲基乙二胺加速剂为四甲基乙二胺TEMEDTEMED,形成形成三三维网状凝胶。维网状凝胶。聚丙烯酰胺凝胶（聚丙烯酰胺凝胶（PAGPAG）的的聚合聚合反应：反应：由单体聚丙烯酰胺由单体聚丙烯酰胺(Acr)(Acr)和甲叉双丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺(Bis)(Bis)交联而交联而成的三维网状结构凝胶。成的三维网状结构凝胶。Bis Bis：交联剂：交联剂 过硫酸铵过硫酸铵(AP)(AP)：引发剂，提供自由基，：引发剂，提供自由基，引发聚合反应引发聚合反应 四甲基乙二胺四甲基乙二胺(TEMED)(TEMED)：催化剂：催化剂,加快引发加快引发 释放自由基的速度释放自

3、由基的速度三大效应聚丙烯酰胺凝胶电泳采用不连续系统（即缓聚丙烯酰胺凝胶电泳采用不连续系统（即缓冲液成分、冲液成分、pHpH及凝胶孔径不连续）聚丙烯酰及凝胶孔径不连续）聚丙烯酰胺凝胶电泳，通过胺凝胶电泳，通过浓缩效应、分子筛效应、浓缩效应、分子筛效应、电荷效应电荷效应，将血清中各蛋白质成份依其分子，将血清中各蛋白质成份依其分子大小、电荷多少不同而进行高效分离。大小、电荷多少不同而进行高效分离。1.1.浓缩效应浓缩效应 分离机制：分离机制：凝胶层孔径不连续：凝胶层孔径不连续：浓缩胶大孔径，分离胶小孔浓缩胶大孔径，分离胶小孔径径缓冲液离子不连续：缓冲液离子不连续：电泳液中电泳液中Gly-(慢离子慢离

4、子)；凝胶中凝胶中 Cl-(快离子快离子)；Pr-介于二者之间介于二者之间pH值不连续：值不连续：电泳缓冲液电泳缓冲液pH=8.3；浓缩胶；浓缩胶pH=6.7；分离胶分离胶pH=8.9电位梯度不连续电位梯度不连续 缓冲液离子成分、缓冲液离子成分、PHPH的不连续性的不连续性：电极缓冲液通常为电极缓冲液通常为pH8.3 Tris-pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液，样品及凝胶中缓冲液为甘氨酸缓冲液，样品及凝胶中缓冲液为pH6.7 Tris-HCLpH6.7 Tris-HCL缓冲液。电极缓冲缓冲液。电极缓冲液的液的pH=8.3pH=8.3，甘氨酸的电离小，有效迁移率小，称为慢离子；浓缩胶中的，甘氨

5、酸的电离小，有效迁移率小，称为慢离子；浓缩胶中的氯离子完全电离，有效迁移率大，称为快离子；蛋白质在浓缩胶中介于二氯离子完全电离，有效迁移率大，称为快离子；蛋白质在浓缩胶中介于二者之间者之间。电位梯度的不连续性电位梯度的不连续性：电电泳开始后，氯离子跑得最快，留下一段低电泳开始后，氯离子跑得最快，留下一段低电导区，产生高电位梯度（电位与电导率成反比），使甘氨酸离子追赶氯离导区，产生高电位梯度（电位与电导率成反比），使甘氨酸离子追赶氯离子，蛋白质夹在中间而被压缩。子，蛋白质夹在中间而被压缩。1cm1cm厚样品层可以压缩厚样品层可以压缩0.250.25m m的厚度。的厚度。成分成分pH值值孔径孔径电

6、泳缓冲液电泳缓冲液甘氨酸甘氨酸(慢离子慢离子)8.3样品样品蛋白质蛋白质6.7浓缩胶浓缩胶Cl-(快离子快离子)6.7大大分离胶分离胶Cl-(快离子快离子)8.9小小有效迁移率有效迁移率=迁移率迁移率 解离度解离度2.2.分子筛效应分子筛效应分子量或分子大小和形状不同的蛋白质通过一定孔分子量或分子大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径分离胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁径分离胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率，这就是分子筛效应。移率，这就是分子筛效应。当样品进入分离胶，凝当样品进入分离胶，凝胶孔径变小，胶孔径变小，分子量小，阻力小，移动快；分子量分子量小，阻力小，移动快；分子量大，阻

7、力大，移动慢。大，阻力大，移动慢。3.3.电荷效电荷效应应电荷量不同，迁移率不同。电荷量不同，迁移率不同。实验仪器电泳装置电泳装置稳压电源稳压电源盘状电泳槽盘状电泳槽 毛细滴毛细滴管管 刻度吸量管刻度吸量管 玻璃管和橡胶帽玻璃管和橡胶帽 微量移液器微量移液器 注射器和长针头注射器和长针头脱色摇床脱色摇床试剂AcrAcr和和BisBis：棕色瓶保存：棕色瓶保存TEMED-TEMED-四甲基乙二胺，避光保存。四甲基乙二胺，避光保存。过硫酸铵过硫酸铵(新鲜配制新鲜配制)染色液：染色液：0.10.1溴酚兰液溴酚兰液 洗脱液：洗脱液：7 7醋酸醋酸 其他试剂：见下表贮存液的配制。其他试剂：见下表贮存液的

8、配制。贮存液贮存液100ml溶液中的含量溶液中的含量pH工作溶液配制的体积比工作溶液配制的体积比11N HCl 48.Oml；Tris 36.6克克TEMED 0.23ml8.9分离胶制备：分离胶制备：1份份1号，号，2份份2号，号，1份份水；抽气后加入水；抽气后加入4份份3号号；凝胶浓度凝胶浓度 7；pH=8.92Acr 28.0克克；Bis 0.725克克3过硫酸铵过硫酸铵 0.14克克41N HCl 48.Oml；Tris 5.98克克TEMED 0.46ml6.7浓缩胶制备：浓缩胶制备：1份份4号，号，2份份5号号；抽气抽气后加入后加入4份份6号号；凝胶浓凝胶浓度度 2.5；pH=6.

9、75Acr 10.0克克；Bis 2.5克克6蔗糖蔗糖 40.0克克7电泳槽缓冲液：电泳槽缓冲液：Tris 0.60克克甘氨酸甘氨酸 2.88克克8.3用时可稀释用时可稀释10倍倍500ml可供可供12根电泳管根电泳管1 1准备准备每人取电泳管每人取电泳管1 1支，支，并在距电泳管下端并在距电泳管下端7cm和和7.5cm处画横处画横线做标记，线做标记，加加1-21-2滴滴4040蔗糖于橡胶帽内堵住电泳管底部，蔗糖于橡胶帽内堵住电泳管底部，塞紧。塞紧。实验步骤试剂试剂分离胶溶液分离胶溶液（ml）浓缩胶溶液浓缩胶溶液（ml）分离胶缓冲溶液（分离胶缓冲溶液（pH8.9）1.25浓缩胶缓冲溶液浓缩胶缓

10、冲溶液（pH6.7）1.25单体交联剂单体交联剂2.51.0DDW6.197.65催化剂（催化剂（10%AP）0.100.10TEMED0.020.02成胶时间成胶时间30min15min浓度浓度7.5%(孔小孔小)3%（孔大）（孔大）2制胶制胶(取取小烧杯小烧杯2 2个个,按按表加表加液液)按上述操作混匀分离胶溶液，缓慢注入玻璃管按上述操作混匀分离胶溶液，缓慢注入玻璃管7cm处，滴加一滴蒸馏水，然后在室温下聚合，聚合处，滴加一滴蒸馏水，然后在室温下聚合，聚合20-30min；待分离胶成胶后，用滤纸条吸干上层水分，灌浓缩待分离胶成胶后，用滤纸条吸干上层水分，灌浓缩胶至胶至7.5cm处，再滴加蒸

11、馏水一滴，静置处，再滴加蒸馏水一滴，静置15min左右。左右。浓缩胶凝胶后，吸取上层水，拔掉橡胶帽浓缩胶凝胶后，吸取上层水，拔掉橡胶帽吸去下层蔗糖吸去下层蔗糖溶液。将电泳管套在橡皮塞中，装入电泳槽，然后加入溶液。将电泳管套在橡皮塞中，装入电泳槽，然后加入下槽缓冲液，排净管底空气下槽缓冲液，排净管底空气使用。使用。3灌柱4 4样品液制备：样品液制备：血清血清:0.1ml40%蔗糖蔗糖:0.1ml 0.05%溴酚兰溴酚兰:0.1ml添加于一个小试管中混匀备用添加于一个小试管中混匀备用5 5装电泳管和上样装电泳管和上样将凝胶管插入电泳槽槽底橡胶塞孔中，加入电极缓冲将凝胶管插入电泳槽槽底橡胶塞孔中，加

12、入电极缓冲液与下电泳槽，随后放入凝胶管及上槽，除气泡液与下电泳槽，随后放入凝胶管及上槽，除气泡,然然后在上层添加缓冲溶液覆盖凝胶管上端，除气泡。后在上层添加缓冲溶液覆盖凝胶管上端，除气泡。加样品液加样品液10l10l至浓缩胶面。至浓缩胶面。6 6电泳电泳 上槽负极（黑）下槽正极（红）电流：先浓缩胶:1.5mA/管 然后分离胶:3.0mA/管 7 7剥胶剥胶电泳完成后取下玻管，用一长针头注射器吸满蒸馏水为电泳完成后取下玻管，用一长针头注射器吸满蒸馏水为润滑剂，将针头插入玻管内壁和凝胶柱表面之间，缓缓润滑剂，将针头插入玻管内壁和凝胶柱表面之间，缓缓旋转玻管，一边注水一边使针头呈螺旋式推进。最后可旋

13、转玻管，一边注水一边使针头呈螺旋式推进。最后可用洗耳球在玻管浓缩胶端轻加压力，就可将凝胶柱压出用洗耳球在玻管浓缩胶端轻加压力，就可将凝胶柱压出玻管。玻管。8 固定和染色：固定和染色：先用固定液固定先用固定液固定5分钟，再在培养皿中装分钟，再在培养皿中装0.用洗脱液漂洗用洗脱液漂洗脱色。脱色。1%溴酚蓝碱性染液染色溴酚蓝碱性染液染色10mim（染液回收）。（染液回收）。9脱色脱色加洗脱液（加洗脱液（7%冰醋酸）摇床脱色，三次，每次冰醋酸）摇床脱色，三次，每次23min，一周之后观察结果。一周之后观察结果。实验结果实验结果+1 1丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺是神经毒性试剂，丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺是神

14、经毒性试剂，对皮肤有刺激作用，注意避免直接接触。对皮肤有刺激作用，注意避免直接接触。2 2制胶时，要充分摇匀，加速剂制胶时，要充分摇匀，加速剂TEMEDTEMED最后加。最后加。3 3注胶过程最好一次性完成注胶过程最好一次性完成,避免产生气泡。避免产生气泡。4.4.氨基黑染色氨基黑染色脱色脱色染液回收。染液回收。5 5固体胶切忌倒入水池固体胶切忌倒入水池。6.6.注意观察实验现象：分界面，浓缩效应注意观察实验现象：分界面，浓缩效应7.7.水封的目的是为了使分离胶上延平直，并排除气水封的目的是为了使分离胶上延平直，并排除气泡。泡。8.8.凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界凝胶聚合好的标志

15、是胶与水层之间形成清晰的界面。面。9.9.剥胶时要小心剥胶时要小心,保持胶完好无损保持胶完好无损,染色要充分。染色要充分。注意事项：注意事项：方法学评价方法学评价PAGE优点：优点：n分辨率高，具有三大效应，灵敏度高可达分辨率高，具有三大效应，灵敏度高可达10-6gn可以通过控制单体和交联剂的浓度来调节凝胶可以通过控制单体和交联剂的浓度来调节凝胶孔径的大小使大分子得到更好地分离。孔径的大小使大分子得到更好地分离。n聚丙烯酰胺凝胶只带有不活泼的酰胺基侧链，聚丙烯酰胺凝胶只带有不活泼的酰胺基侧链，所以凝胶性能稳定，电渗作用小，无吸附，化学所以凝胶性能稳定，电渗作用小，无吸附，化学惰性强，与生物大分

16、子不发生反应。电泳过程中惰性强，与生物大分子不发生反应。电泳过程中不受温度、不受温度、PH的变化影响。的变化影响。n在一定浓度范围内，凝胶透明，有弹性，机械在一定浓度范围内，凝胶透明，有弹性，机械性能好，易于观察。性能好，易于观察。n单体纯度高，在相同的实验条件下，电泳结果有单体纯度高，在相同的实验条件下，电泳结果有很好的重复性。很好的重复性。n凝胶杂质少，在很多溶剂中不溶，可适用于少量凝胶杂质少，在很多溶剂中不溶，可适用于少量样品的制备，不致污染样品。样品的制备，不致污染样品。缺点：缺点：但它的操作较复杂但它的操作较复杂,影响实验效果的因素较影响实验效果的因素较多多,使其在生化实验教学中的开

17、展受到一定限制。使其在生化实验教学中的开展受到一定限制。醋酸纤维薄膜电泳醋酸纤维薄膜电泳优点：优点：n样品用量少、灵敏度高样品用量少、灵敏度高n区带清晰，分离效果好区带清晰，分离效果好n易于定量，便于保存。易于定量，便于保存。n对各种蛋白质几乎完全不吸附，无拖尾现象。对各种蛋白质几乎完全不吸附，无拖尾现象。对染料也没有吸附，电渗作用小。对染料也没有吸附，电渗作用小。n应用面广。应用面广。缺点：缺点：分辨率较聚丙烯酰胺凝胶电泳要低分辨率较聚丙烯酰胺凝胶电泳要低SDS-PAGE优点与优点与PAGEPAGE相似，相似，SDSSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳经常应用于聚丙烯酰胺凝胶电泳经常应用于提纯过程中纯度

18、的检测，纯化的蛋白质通常在提纯过程中纯度的检测，纯化的蛋白质通常在SDSSDS电泳上电泳上应只有一条带，但如果蛋白质是由不同的亚基组成的，它应只有一条带，但如果蛋白质是由不同的亚基组成的，它在电泳中可能会形成分别对应于各个亚基的几条带。在电泳中可能会形成分别对应于各个亚基的几条带。SDSSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳具有较高的灵敏度，一般只需要不聚丙烯酰胺凝胶电泳具有较高的灵敏度，一般只需要不到微克量级的蛋白质，而且通过电泳还可以同时得到关于到微克量级的蛋白质，而且通过电泳还可以同时得到关于分子量的情况，这些信息对于了解未知蛋白及设计提纯过分子量的情况，这些信息对于了解未知蛋白及设计提纯过程都是非常重要的。程都是非常重要的。缺点：电荷异常或构象异常的蛋白、带有较大辅基的蛋白缺点：电荷异常或构象异常的蛋白、带有较大辅基的蛋白（如（如 糖蛋白）及一些结构蛋白等测出的糖蛋白）及一些结构蛋白等测出的MrMr不太可靠。不太可靠。