蛋白质的分离提取方法精选课件.ppt

《蛋白质的分离提取方法精选课件.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《蛋白质的分离提取方法精选课件.ppt（30页珍藏版）》请在淘文阁 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、关于蛋白质的分离提取方法第一页，本课件共有30页一、一、凝胶色谱法（分配色谱法）凝胶色谱法（分配色谱法）根据被分离物质的蛋白质相对分子根据被分离物质的蛋白质相对分子质量的大小，质量的大小，利用具有网状结构的利用具有网状结构的凝胶凝胶的的分子筛作用，来进行分离。分子筛作用，来进行分离。大多数凝胶是由大多数凝胶是由多糖类化合物多糖类化合物（如葡（如葡聚糖或琼脂糖）构成的聚糖或琼脂糖）构成的多孔小球体多孔小球体，内，内部有许多贯穿的通道。部有许多贯穿的通道。.概念：概念：第二页，本课件共有30页.凝胶色谱法分离蛋白质的原理和具体过程凝胶色谱法分离蛋白质的原理和具体过程第三页，本课件共有30页.凝胶色

2、谱法的原理凝胶色谱法的原理分子筛效应：分子筛效应：当相对分子量不同的蛋白质通过凝胶当相对分子量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子量较小的蛋白质容易进入凝时，相对分子量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢；胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢；而相对分子量较大的蛋白质无法进入凝胶而相对分子量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。相对分子质量不同较短，移动速度较快。相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。的蛋白质分子因此得以分离。依据的特性是：蛋白质分子量的大小。依据的特性是：蛋白质分子量的大小。第

3、四页，本课件共有30页凝胶色谱法分离蛋白质过程的动画演示凝胶色谱法分离蛋白质过程的动画演示第五页，本课件共有30页二、缓冲溶液二、缓冲溶液1.1.概念概念:在一定的范围内，凡是能够在一定的范围内，凡是能够抵制外加抵制外加少量强酸或强碱少量强酸或强碱的影响使原来溶液的影响使原来溶液pHpH值基本保持值基本保持不变的混合溶液。不变的混合溶液。2.2.缓冲溶液的组成举例：缓冲溶液的组成举例：H H2 2COCO3 3 NaHCO NaHCO3 3、CHCH3 3COOH CHCOOH CH3 3COONaCOONaNaHNaH2 2POPO4 4 Na Na2 2HPOHPO4 4、KHKH2 2P

4、OPO4 4 K K2 2HPOHPO4 43.3.缓冲溶液的配制缓冲溶液的配制第六页，本课件共有30页在电场的作用下，这些带电分子会向着与在电场的作用下，这些带电分子会向着与在电场的作用下，这些带电分子会向着与在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。其所带电荷相反的电极移动。其所带电荷相反的电极移动。其所带电荷相反的电极移动。琼脂糖凝胶电泳示意图琼脂糖凝胶电泳示意图琼脂糖凝胶电泳示意图琼脂糖凝胶电泳示意图.概念：概念：带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。三、电泳：三、电泳：第七页，本课件共有30页血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳血清蛋白醋酸纤

5、维薄膜电泳第八页，本课件共有30页.电泳原理：电泳原理：电泳利用了待分离样品中各种电泳利用了待分离样品中各种分子带电性分子带电性质的差异质的差异以及以及分子本身的大小分子本身的大小，形状的不同形状的不同，使，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。中各种分子的分离。.常见电泳类型：常见电泳类型：琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳聚丙稀酰胺凝胶电泳聚丙稀酰胺凝胶电泳SDSSDS聚丙稀酰胺凝胶电泳聚丙稀酰胺凝胶电泳迁移率取决于它所带净迁移率取决于它所带净迁移率取决于它所带净迁移率取决于它所带净电荷的多少以及分子的电荷的多少以及分子的电荷的多少以

6、及分子的电荷的多少以及分子的大小、形状。大小、形状。大小、形状。大小、形状。电泳迁移率电泳迁移率完全取决于完全取决于分子的大小。分子的大小。第九页，本课件共有30页课外拓展：课外拓展：用用SDSSDS测定蛋白质分子量的方法测定蛋白质分子量的方法 使用使用SDSSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋测定蛋白质的分子量时，可白质的分子量时，可选用一组已知分子量选用一组已知分子量的标准蛋白的标准蛋白同时进行电泳，根据已知分子量同时进行电泳，根据已知分子量的标准蛋白的的标准蛋白的电泳区带位置电泳区带位置，用，用电泳迁移率电泳迁移率和分子量的对数作标准曲线和分子量的对数作标准曲线，可以测定，可

7、以测定未未知蛋白质知蛋白质的分子量。的分子量。市场上有高分子量、次市场上有高分子量、次高分子量及低分子量的标准蛋白试剂出售。高分子量及低分子量的标准蛋白试剂出售。第十页，本课件共有30页实践训练实践训练1.1.1.1.在凝胶色谱法分离蛋白质中，所用凝胶的化学本质是在凝胶色谱法分离蛋白质中，所用凝胶的化学本质是在凝胶色谱法分离蛋白质中，所用凝胶的化学本质是在凝胶色谱法分离蛋白质中，所用凝胶的化学本质是()A.A.糖类化合物糖类化合物 B.B.脂质脂质 C.C.蛋白质蛋白质 D.D.核酸核酸2.SDS2.SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳中决定蛋白质或多肽移动聚丙烯酰胺凝胶电泳中决定蛋白质或多肽移动速度的主

8、要因素是速度的主要因素是()()A.A.蛋白质分子所带的电荷蛋白质分子所带的电荷 B.B.蛋白质分子的形状蛋白质分子的形状 C.C.蛋白质分子的相对质量蛋白质分子的相对质量 D.D.缓冲溶液的缓冲溶液的pHpHC CA A第十一页，本课件共有30页3.3.3.3.凝胶色谱法分离蛋白质时，凝胶的种类较多，但其作用的共凝胶色谱法分离蛋白质时，凝胶的种类较多，但其作用的共凝胶色谱法分离蛋白质时，凝胶的种类较多，但其作用的共凝胶色谱法分离蛋白质时，凝胶的种类较多，但其作用的共同点是同点是同点是同点是()()()()A.A.A.A.改变蛋白质分子通过凝胶时的路径改变蛋白质分子通过凝胶时的路径改变蛋白质分

9、子通过凝胶时的路径改变蛋白质分子通过凝胶时的路径 B.B.B.B.吸附一部分蛋白质，从而影响蛋白质分子的移动速度吸附一部分蛋白质，从而影响蛋白质分子的移动速度吸附一部分蛋白质，从而影响蛋白质分子的移动速度吸附一部分蛋白质，从而影响蛋白质分子的移动速度 C.C.将酶或细胞固定在凝胶中将酶或细胞固定在凝胶中 D.D.D.D.与蛋白质分子进行化学反应，从而影响其移动速度与蛋白质分子进行化学反应，从而影响其移动速度与蛋白质分子进行化学反应，从而影响其移动速度与蛋白质分子进行化学反应，从而影响其移动速度4.4.4.4.在利用凝胶电泳法分离蛋白质时，一定要加入缓冲液，其在利用凝胶电泳法分离蛋白质时，一定要

10、加入缓冲液，其在利用凝胶电泳法分离蛋白质时，一定要加入缓冲液，其在利用凝胶电泳法分离蛋白质时，一定要加入缓冲液，其作用主要是作用主要是作用主要是作用主要是()()()()A.A.使酶的活性最高使酶的活性最高 B.B.使蛋白质的活性最高使蛋白质的活性最高 C.C.C.C.维持蛋白质所带的电荷维持蛋白质所带的电荷维持蛋白质所带的电荷维持蛋白质所带的电荷 D.D.D.D.使蛋白质带上电荷使蛋白质带上电荷使蛋白质带上电荷使蛋白质带上电荷A AC C第十二页，本课件共有30页1.1.分离生物大分子的基本思路：分离生物大分子的基本思路：选用一定的选用一定的物理或化学物理或化学的方法分离具有的方法分离具有不

11、不同物理或化学性质同物理或化学性质的的生物大分子。生物大分子。2.2.蛋白质分离和提取的原理：蛋白质分离和提取的原理：根据蛋白质根据蛋白质各种特性的差异各种特性的差异，如，如分子的形分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力吸附性质和对其他分子的亲和力等等，可以等等，可以用来分离用来分离不同种类不同种类的蛋白质。的蛋白质。四、实验操作四、实验操作血红蛋白的提取和分离血红蛋白的提取和分离第十三页，本课件共有30页水水 分分固体物质固体物质血血液液血浆血浆血细血细 胞胞白细胞白细胞血小板血小板红细胞红细胞（最多）（最多）血红

12、蛋白血红蛋白两个两个肽链肽链肽链肽链两个两个两个两个肽链肽链四个亚铁红素基团四个亚铁红素基团思考思考血液有哪些成分？血液有哪些成分？血浆蛋白血浆蛋白无机盐无机盐磷脂磷脂葡萄糖等葡萄糖等第十四页，本课件共有30页血红蛋白的特点：血红蛋白的特点：血红血红蛋白蛋白两个两个肽链肽链两个两个肽链肽链四个亚铁红素基团四个亚铁红素基团第十五页，本课件共有30页样品处理样品处理粗分离粗分离纯化纯化纯度鉴定纯度鉴定1.1.样品处理：样品处理：.蛋白质提取和分离步骤蛋白质提取和分离步骤.凝胶色谱法分离蛋白质操作步骤凝胶色谱法分离蛋白质操作步骤思考：思考：人们用鸡的红细胞提取人们用鸡的红细胞提取DNADNA，用猪、

13、牛、羊，用猪、牛、羊的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？答：答：鸡的红细胞具有细胞核，含有鸡的红细胞具有细胞核，含有DNADNA，便于进行，便于进行DNADNA的提取，哺乳动物成熟的红细胞无细胞核，结的提取，哺乳动物成熟的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富便于提取血红蛋白。构简单，血红蛋白含量丰富便于提取血红蛋白。第十六页，本课件共有30页洗涤操作：洗涤操作：(1)(1)红细胞的洗涤红细胞的洗涤:洗涤目的洗涤目的:去除杂蛋白，以利于后续血红蛋白的分离纯化，去除杂蛋白，以利于后续血红蛋白的分离纯化，洗涤次数不可过少。洗涤次数不可过少。柜式离心机柜式离心机初

14、次离心初次离心后的结果后的结果3 3次洗涤后次洗涤后的结果的结果第十七页，本课件共有30页磁力搅拌器磁力搅拌器搅拌器转子搅拌器转子搅拌器正在工作搅拌器正在工作(2)(2)血红蛋白的释放血红蛋白的释放（使用蒸馏水和甲苯）（使用蒸馏水和甲苯）第十八页，本课件共有30页(3)(3)分离血红蛋白溶液：分离血红蛋白溶液：甲苯层（甲苯层（无色透明无色透明）；）；脂溶性物质沉淀层（脂溶性物质沉淀层（白色薄层固体白色薄层固体）；）；）；）；血红蛋白的水溶液层（血红蛋白的水溶液层（红色透明液体红色透明液体）；）；）；）；杂质沉淀层（杂质沉淀层（暗红色暗红色暗红色暗红色）。）。过滤：过滤：除去除去脂溶性物质沉淀层

15、脂溶性物质沉淀层脂溶性物质沉淀层脂溶性物质沉淀层和和杂质沉淀层。杂质沉淀层。杂质沉淀层。杂质沉淀层。第十九页，本课件共有30页(4)(4)透析透析(粗分离粗分离)：过程：取过程：取1ml1ml的血红蛋白的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有袋放入盛有300ml300ml的物质的的物质的量浓度为量浓度为20mmol/l20mmol/l的的磷酸磷酸缓冲液缓冲液中（中（pHpH为为7.07.0），透），透析析1212小时。小时。透析目的：除去样品中透析目的：除去样品中分子量较小的杂质。分子量较小的杂质。利用透析袋透析利用透析袋透析第二十页，本课件共有30页透析过程动画演

16、示透析过程动画演示第二十一页，本课件共有30页2.2.凝胶色谱操作凝胶色谱操作:.凝胶色谱柱的制作：凝胶色谱柱的制作：注意事项：注意事项：底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质分离不彻底。蛋白质分离不彻底。第二十二页，本课件共有30页.凝胶色谱柱的装填凝胶色谱柱的装填凝胶的选择：凝胶的选择：凝胶的前处理：凝胶的前处理：凝胶的前处理：凝胶的前处理：凝胶色谱柱的装填方法：凝胶色谱柱的装填方法：注意：注意：1.1.凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的凝胶

17、装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。空隙。2.2.装填凝胶柱时不得有气泡存在：装填凝胶柱时不得有气泡存在：因为气泡会搅因为气泡会搅因为气泡会搅因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。洗涤平衡：洗涤平衡：装填完毕后，立即用缓冲液洗装填完毕后，立即用缓冲液洗装填完毕后，立即用缓冲液洗装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在脱瓶，在脱瓶，在脱瓶，在50cm50cm50cm50cm高的操作压下，用高的操作压下，用高的操作压下，用高的操作压下，用300ml300ml300

18、ml300ml的的的的20mmol/l20mmol/l20mmol/l20mmol/l的的的的磷酸缓冲液（磷酸缓冲液（磷酸缓冲液（磷酸缓冲液（pHpH为为7.07.0）充分洗充分洗充分洗充分洗涤平衡涤平衡涤平衡涤平衡1212小时小时。注意：注意：注意：注意：1.1.液面不要低于凝胶表面，否则可液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影响液体在柱内的流动与能有气泡混入，影响液体在柱内的流动与最终生物大分子物质的分离效果。最终生物大分子物质的分离效果。2.2.不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象现象。50505050cmcmcmcm高高高高第二十三页，本课件共

19、有30页装装配配好好的的凝凝胶胶柱柱第二十四页，本课件共有30页.样品加入与洗脱样品加入与洗脱调节缓冲液面调节缓冲液面滴加透析样品滴加透析样品注意：注意：正确的加正确的加样操作是：样操作是：1.1.不要触及并破不要触及并破坏凝胶面。坏凝胶面。2.2.2.2.贴壁加样。贴壁加样。贴壁加样。贴壁加样。3.3.使吸管管口沿管壁环绕移动。使吸管管口沿管壁环绕移动。样品渗入凝胶床样品渗入凝胶床洗脱洗脱收集收集注意：在分离过程中，如果红色区带均匀一致的移动，注意：在分离过程中，如果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功。说明色谱柱制作成功。第二十五页，本课件共有30页开开始始进进行行层层析析收集得到的

20、纯收集得到的纯化后的蛋白化后的蛋白第二十六页，本课件共有30页思考下面的问题：思考下面的问题：1 1、在血红蛋白的整个过程中不断用磷酸缓冲、在血红蛋白的整个过程中不断用磷酸缓冲液处理的目的是什么？液处理的目的是什么？答：答：让血红蛋白处在稳定的让血红蛋白处在稳定的pHpH范围内，维持结构范围内，维持结构和功能。和功能。2 2、与其他真核细胞相比，红细胞有什么特点？这、与其他真核细胞相比，红细胞有什么特点？这一特点对你进行蛋白质得分离有什么意义？一特点对你进行蛋白质得分离有什么意义？答：答：血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候

21、应该收离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观，集洗脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。大大简化了实验操作。第二十七页，本课件共有30页1、(多选多选)关于血红蛋白分子的叙述正确的是关于血红蛋白分子的叙述正确的是()A.两个两个肽链，两个肽链，两个肽链，一个亚铁血红素基团肽链，一个亚铁血红素基团 B.两个两个肽链，两个肽链，两个肽链，四个亚铁血红素基团肽链，四个亚铁血红素基团 C.C.亚铁血红素能与亚铁血红素能与亚铁血红素能与亚铁血红素能与CO2CO2结合结合结合结合 D.D.血红蛋白在人体主要运输能源物质血红蛋白在人体主要运输能源

22、物质血红蛋白在人体主要运输能源物质血红蛋白在人体主要运输能源物质2.2.下列各项中，一般不影响在凝胶色谱法分离蛋白质中的下列各项中，一般不影响在凝胶色谱法分离蛋白质中的分离度的是分离度的是()()A.A.层析柱高层析柱高 B.B.层析柱的直径层析柱的直径 C.C.缓冲溶液缓冲溶液 D.D.样品的分布样品的分布3.3.蛋白质的提取和分离一般分为四步，即蛋白质的提取和分离一般分为四步，即、和、和。后三步常用的方法依。后三步常用的方法依次是、次是、。B B粗分离粗分离纯化纯化纯化纯化样品处理样品处理纯度鉴定纯度鉴定纯度鉴定纯度鉴定透析法透析法凝胶色谱法凝胶色谱法SDSSDS聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺凝胶电

23、泳凝胶电泳凝胶电泳凝胶电泳BCBC第二十八页，本课件共有30页观察你处理的血液样品离心后观察你处理的血液样品离心后是否分层是否分层，如果分如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。蛋白的原因。此外，离心速度过高和时间过长，此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。结果分析与评价结果分析与评价.你是否完成了对血液样品的处理？你能描述你是否完成了对血液样品的处理？你能描述处理后的样品发生了哪些变化吗？处理后的样品发生了哪些变化吗？第二十九页，本课件共有30页感谢大家观看第三十页，本课件共有30页