分子生物学绪论第一章.ppt

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1、绪绪 论论 Introduction何为何为“分子生物学分子生物学”？是是在在分分子子水水平平上上研研究究生生命命本本质质的的一一门门新新兴兴的的边边缘缘学学科科，是是生生物物学学研研究究从从宏宏观观发发展展到到微微观观而而形形成成的的。终终极极目目标标是是要要了了解解所所有有生生物物学现象的分子本质。学现象的分子本质。是当前生命科学中是当前生命科学中发展最快并正在与发展最快并正在与其它学科广泛交叉其它学科广泛交叉与渗透的重要前沿与渗透的重要前沿领域。领域。分子生物学的研究对象分子生物学的研究对象生物大分子生物大分子核酸核酸蛋白质蛋白质多糖多糖脂类脂类 它以核酸和蛋白质等生物它以核酸和蛋白质等

2、生物大分子的结构及其在遗传信息大分子的结构及其在遗传信息和细胞信息传递中的作用为研和细胞信息传递中的作用为研究对象。究对象。分子生物学与生物化学的关系分子生物学与生物化学的关系“你中有我，我中有你你中有我，我中有你你中有我，我中有你你中有我，我中有你”分子生物学分子生物学生物化学生物化学研究方向研究方向主要研究核酸、蛋白质和其它大主要研究核酸、蛋白质和其它大分子的结构和功能，及它们之间分子的结构和功能，及它们之间的相互作用。着重解决细胞中信的相互作用。着重解决细胞中信息传递的问题。息传递的问题。主要研究大、小分子在主要研究大、小分子在生命活动中的代谢转化生命活动中的代谢转化过程，如糖酵解、脂肪

3、过程，如糖酵解、脂肪氧化、三羧酸循环等。氧化、三羧酸循环等。研究方法研究方法以以X-射射线线等等物物理理学学方方法法研研究究大大分分子子结结构构，以以生生化化与与遗遗传传相相结结合合的的方法探索其功能。方法探索其功能。采用生化和化学方法。采用生化和化学方法。重点是大分重点是大分子的结构与子的结构与功能功能重点是分重点是分子的代谢子的代谢转化转化第一章第一章 遗传的物质基础遗传的物质基础-DNADNADNA一级结构一级结构DNADNA二级结构二级结构DNADNA三级结构三级结构脱氧核糖核苷酸脱氧核糖核苷酸脱氧核糖核苷酸脱氧核糖核苷酸3,5-3,5-磷酸二酯键磷酸二酯键磷酸二酯键磷酸二酯键线状或环

4、状线状或环状线状或环状线状或环状一、一、DNADNA一级结构一级结构DNADNA的的一一级级结结构构实实际际上上就就是是DNADNA分分子子内内碱碱基基的的排列顺序。排列顺序。DNA和和RNA在稳定性上的差异在稳定性上的差异DNA的的戊戊糖糖2上上没没有有自自由由羟羟基基，很很稳稳定定，在在pH11.5时时DNA的的一一级级结结构构几几乎乎无无变变化化；而而RNA的的戊戊糖糖有有2上上的的自自由由羟羟基基，遇遇碱碱水水解解生生成成2,3环环式式单单核核苷苷酸酸，极极不不稳稳定定，很很快快转转变变成成2单核苷酸和单核苷酸和3单核苷酸。单核苷酸。结构决定特性结构决定特性结构决定特性结构决定特性结构

5、决定功能结构决定功能结构决定功能结构决定功能重复序列重复序列（repetitive sequence）高度重复序列高度重复序列中度重复序列中度重复序列低度重复序列低度重复序列1 1、高度重复序列、高度重复序列重复频率高，几十万到几百万次；重复频率高，几十万到几百万次；重复序列较短，重复序列较短，5300bp，多数为，多数为515bp；有些是反向重复序列。有些是反向重复序列。卫星卫星DNA回文结构回文结构 palindrome卫星卫星DNA（satellite DNA）在高度重复序列中，有一种由富含AT的210bp成串排列组成的简单重复序列，可用等密度梯度离心法将其与主体DNA分开，因此把它叫做

6、卫星DNA。分类分类微卫星微卫星DNA（microsatelletite DNA）小卫星小卫星DNA（minisatelletite DNA）重复频率重复频率重复序列长度重复序列长度具有种属特异性，具有种属特异性，常作为一种分子遗常作为一种分子遗传标记。传标记。2 2、中度重复序列、中度重复序列重重复复频频率率和和重重复复序序列列长长度度差异大；差异大；有有些些成成串串集集中中排排列列，有有些些与单拷贝序列间隔排列；与单拷贝序列间隔排列；有有些些是是编编码码蛋蛋白白质质的的结结构构基因；基因；一一般般有有种种的的特特异异性性，可可作作为为探探针针，区区分分不不同同种种间间细细胞胞DNA。差异大

7、差异大种的特异性种的特异性3 3、低度重复序列、低度重复序列序列不重复或只重复几次、十几次；序列不重复或只重复几次、十几次；重复序列长度重复序列长度1000bp；携带大量能编码功能蛋白质的遗传信息。携带大量能编码功能蛋白质的遗传信息。又称单又称单拷贝拷贝拷贝拷贝序序列列The Double Helix(1953)The foundation of molecular biology Francis H.Crick James D.Watson 二、二、DNADNA二级结构二级结构（1）反向平行，右手双螺旋；）反向平行，右手双螺旋；（2）糖糖与与磷磷酸酸通通过过3,5-磷磷酸酸二二酯键在外侧形成

8、骨架；酯键在外侧形成骨架；（3）碱碱基基在在内内部部，平平面面与与螺螺旋旋轴垂直；轴垂直；（4）A=T，G C；（5）直直径径为为2nm，螺螺距距为为3.4 nm，10bp/helix；（6）大大沟沟（major groove）和和小小沟（沟（minor groove）The Double Helix氢键碱基堆积力DNADNADNADNA分子结构状态的维持是四种作分子结构状态的维持是四种作分子结构状态的维持是四种作分子结构状态的维持是四种作用力相互竞争的结果用力相互竞争的结果用力相互竞争的结果用力相互竞争的结果静电斥力疏水力有利于维持双螺旋结构有利于维持双螺旋结构不利于维持双螺旋结构不利于维持

9、双螺旋结构DNA二级结构的多态性二级结构的多态性除除B-DNA外，人们还发现到了其它的结构参数有一定差外，人们还发现到了其它的结构参数有一定差异的异的DNA，如，如A-DNA,Z-DNA，三链和四链，三链和四链DNA等，这等，这一现象称为一现象称为DNADNA结构的多态性（结构的多态性（结构的多态性（结构的多态性（polymorphismpolymorphism）。三链三链三链三链DNADNADNADNA分子间的三螺旋分子间的三螺旋DNADNA分子内的三螺旋分子内的三螺旋DNADNA平行的三螺旋结构平行的三螺旋结构 R-DNAR-DNAA-DNAA-DNA：周碱基数可变：周碱基数可变DNADN

10、AZ-DNAZ-DNA：左旋：左旋DNADNA双链双链双链双链DNADNADNADNADNA三三螺螺旋旋结结构构中中的的第第三三条条链链与与第第一一条条链链的的序序列列和和方方向向均均相相同同，这种的这种的DNA叫叫R-DNAR-DNA。四链四链四链四链DNADNADNADNAG四联体螺旋：含有端粒重复序列的单链寡四联体螺旋：含有端粒重复序列的单链寡核苷酸可以形成四联体螺旋结构。核苷酸可以形成四联体螺旋结构。DNA结构的动态性结构的动态性不同不同DNA结构形式相互转变的现象，称为结构形式相互转变的现象，称为DNADNA结结结结构的动态性构的动态性构的动态性构的动态性。DNA基本结构：基本结构：

11、B型型天然天然DNADNA分子中，分子中，以以B B型结构为主型结构为主在这个分子的某些区段在这个分子的某些区段会出现会出现A、Z型，甚至三型，甚至三链、四链。链、四链。这些不同的结构处于动态变化中这些不同的结构处于动态变化中双双链链DNADNA中中配配对对碱碱基基的的氢氢键键不不断断处处于于断断裂裂和和再再生生状状态态之之中中，特特别别是是稳稳定定性性较较低低的的富富含含A-TA-T的的区区段段，氢氢键键的的断断裂裂和和再再生生更更为为明明显显。在在微微观观上上，它它们们常常常常发发生生瞬瞬间间的的单单链链泡泡状状结结构构，这这种种现现象象称称为为双螺旋的呼吸作用。双螺旋的呼吸作用。DNAD

12、NA结构的呼吸作用结构的呼吸作用对于一些识别双链对于一些识别双链DNADNA开链成单链的蛋白质结合开链成单链的蛋白质结合到到DNADNA上具有重要作用。这些蛋白质需要处于呼上具有重要作用。这些蛋白质需要处于呼吸状态的双链吸状态的双链DNADNA来阅读和识别来阅读和识别DNADNA内部所含信内部所含信息（如碱基序列、碱基上可以作用的氢供体、氢息（如碱基序列、碱基上可以作用的氢供体、氢受体的数目和方位等）。受体的数目和方位等）。DNADNA的超螺旋结构的超螺旋结构的超螺旋结构的超螺旋结构是指是指DNA双螺旋进一步扭曲盘绕所双螺旋进一步扭曲盘绕所形成的构象，包括线形双链中的纽结、超螺旋、多重形成的构

13、象，包括线形双链中的纽结、超螺旋、多重螺旋、分子内局部单链环和环状螺旋、分子内局部单链环和环状DNA中的超螺旋及连中的超螺旋及连环等拓扑学性质。环等拓扑学性质。三、三、DNADNA三级结构三级结构超螺旋结构（最常见）超螺旋结构（最常见）超螺旋结构（最常见）超螺旋结构（最常见）生物学意义生物学意义生物学意义生物学意义1、超螺旋、超螺旋DNA形状更紧密，在形状更紧密，在DNA 组装中有重要作用；组装中有重要作用；2、超螺旋程度的改变介导了、超螺旋程度的改变介导了DNA结构的变化，有利于功能结构的变化，有利于功能的发挥；的发挥；3、超螺旋、超螺旋DNA能实现松弛态能实现松弛态DNA所不能实现的结构转

14、化。所不能实现的结构转化。四、四、DNADNA的变性、复性与杂交的变性、复性与杂交DNADNA的变性的变性（denaturation）在物理和化学因素的影响下，维系核酸二级在物理和化学因素的影响下，维系核酸二级结构的氢键和碱基堆积力受到破坏，结构的氢键和碱基堆积力受到破坏，DNA双链解旋成单链，这一过程称为双链解旋成单链，这一过程称为DNA的变的变性。性。判断：判断：判断：判断：1、核酸的变性可发生在整个、核酸的变性可发生在整个DNA分子中，也可发生在局分子中，也可发生在局部的双螺旋节段上（局部变性）。部的双螺旋节段上（局部变性）。2、DNA变性不涉及核苷酸中二酯键的断裂。变性不涉及核苷酸中二

15、酯键的断裂。3、引起变性的因素有酸、碱、尿素、胍等变性剂和乙醇、引起变性的因素有酸、碱、尿素、胍等变性剂和乙醇、丙酮等化学因素以及热、紫外线等物理因素。丙酮等化学因素以及热、紫外线等物理因素。4、变性后的、变性后的DNA其一系列的物理、化学性质都发生变化，其一系列的物理、化学性质都发生变化，如如260nm处紫外吸收值降低，粘度下降，沉降速度增加，处紫外吸收值降低，粘度下降，沉降速度增加，浮力密度上升等。浮力密度上升等。5、熔解曲线的中点，即一半的、熔解曲线的中点，即一半的DNA双螺旋解为单链所对双螺旋解为单链所对应的温度称为熔解温度或解链温度。应的温度称为熔解温度或解链温度。6、每一种、每一种

16、DNA都有一个解链温度，都有一个解链温度，Tm值是一个固定常数。值是一个固定常数。增色效应增色效应增色效应增色效应同一种同一种同一种同一种 DNA DNA DNA DNA分子在分子在分子在分子在不同离子强度溶液不同离子强度溶液不同离子强度溶液不同离子强度溶液中其中其中其中其TmTmTmTm值不同值不同值不同值不同你还记得影响变你还记得影响变你还记得影响变你还记得影响变性的因素有哪些吗？性的因素有哪些吗？性的因素有哪些吗？性的因素有哪些吗？变变性性的的DNADNA重重新新恢恢复复为为双双螺螺旋旋的的过过程程，叫叫做做复性或退火。复性或退火。DNADNA的复性（的复性（renaturation）分

17、子碰撞分子碰撞时间长时间长核心作用核心作用时间短时间短拉拉链作用拉拉链作用限制因素限制因素复性机制复性机制 不完全变性不完全变性DNA容易迅速复性；容易迅速复性；复性复性DNA分子不一定是原有互补链，大分子不一定是原有互补链，大部分不是原配，而是形成杂交分子；部分不是原配，而是形成杂交分子；复性复性DNA分子的结构和理化性质等均得分子的结构和理化性质等均得到恢复。到恢复。复性的特点复性的特点你知道影你知道影你知道影你知道影响复性速度的因素有哪些吗？响复性速度的因素有哪些吗？响复性速度的因素有哪些吗？响复性速度的因素有哪些吗？判断：判断：判断：判断：、DNA片段小的比大的容易复性。片段小的比大的

18、容易复性。、盐可以减少两条互补链负电荷的排斥作用，通常增盐可以减少两条互补链负电荷的排斥作用，通常增加盐浓度，可加速两条互补链重新结合的速度。加盐浓度，可加速两条互补链重新结合的速度。、DNA浓度越大，两条互补链彼此相遇的可能性越大，浓度越大，两条互补链彼此相遇的可能性越大，复性速度也越快。复性速度也越快。一定的盐浓度一定的盐浓度 适宜的温度适宜的温度复性的条件有哪些？复性的条件有哪些？复性的条件有哪些？复性的条件有哪些？为什么？为什么？复性是分子杂交的理论基础复性是分子杂交的理论基础核酸分子杂交核酸分子杂交Nucleic acid hybridization亲亲缘缘关关系系很很近近的的不不同

19、同来来源源的的DNADNA单单链链或或RNARNA单单链链与与DNADNA单单链链之之间间通通过过碱碱基基互互补补形形成成杂杂交交分分子子的的过过程程,叫叫做做核核酸酸分分子子杂杂交。交。DNA/DNADNA/RNA根据核酸分子杂交的原理，有目的地人工制备或从基因根据核酸分子杂交的原理，有目的地人工制备或从基因组中分离一段已知序列的组中分离一段已知序列的DNA，使其带上标记，经变性，使其带上标记，经变性后成为单链，在一定条件下与待测后成为单链，在一定条件下与待测DNA单链杂交，如两单链杂交，如两者序列有同源性，就形成带有标记的双链者序列有同源性，就形成带有标记的双链DNA分子，即分子，即检测到

20、了待测的检测到了待测的DNA。这段带有标记的核苷酸序列称为。这段带有标记的核苷酸序列称为核酸探针或基因探针（核酸探针或基因探针（Gene probe）。）。核酸探针（核酸探针（核酸探针（核酸探针（Nucleic acid probeNucleic acid probe）常用的核酸分子杂交方法常用的核酸分子杂交方法SouthernSouthern印迹杂交（印迹杂交（印迹杂交（印迹杂交（Southern blotingSouthern bloting）Northern Northern 印迹杂交（印迹杂交（印迹杂交（印迹杂交（Northern blotingNorthern bloting）斑点杂

21、交（斑点杂交（斑点杂交（斑点杂交（dot blottingdot blotting）原位杂交（原位杂交（原位杂交（原位杂交（in situ hybridizationin situ hybridization）五、五、DNA DNA序列分析及进展序列分析及进展DNADNA序列分析技术是揭开生命奥秘的一把金钥匙序列分析技术是揭开生命奥秘的一把金钥匙吴瑞士吴瑞士 引物引物-延伸测序策略延伸测序策略19711971年首次成功地测定了年首次成功地测定了噬菌体两个粘性末端噬菌体两个粘性末端的完整序列。的完整序列。F.SangerF.Sanger末端终止法末端终止法K.MullisK.MullisPCRP

22、CRM.SmithM.Smith碱基定点突变技术碱基定点突变技术SangerSanger法法1、基本原理、基本原理SangerSanger双脱氧末端终止法双脱氧末端终止法利用脱氧核苷三磷酸（利用脱氧核苷三磷酸（dNTPdNTP）的类似物双脱氧核）的类似物双脱氧核苷三磷酸（苷三磷酸（ddNTPddNTP）取代正常的底物。）取代正常的底物。在在DNA合合成成反反应应中中除除了了加加入入4种种正正常常dNTP外外，再再加加入入1种种少少量量的的ddNTP，反反应应产产物物是是一一系系列列长长短短不不一一的的核核苷苷酸酸链链。在在4组组独独立立的的核核苷苷酸酸反反应应中中，分分别别加加入入4种种不不同

23、同的的ddNTP，结结果果生生成成4组组核核苷苷酸酸链链，它它们们分分别别终终止止于于每每一一个个A、T、C、G的的位位置置上上。对对这这4组组核核苷苷酸酸进进行行聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶电电泳泳区区分分长长度度差差一一个个核核苷苷酸酸的的单单链链DNA，可可读读出序列。出序列。2 2、反应原理、反应原理 ddNTP可可以以在在DNA聚聚合合酶酶作作用用下下和和多多核核苷苷酸酸链链的的3羟羟基基形形成成磷磷酸酸二二酯酯键键，但但却却不不能能再再与与下下一一个核苷酸缩合，结果使得多核苷酸链的延伸终止个核苷酸缩合，结果使得多核苷酸链的延伸终止。ddNTP的作的作用用方法过程方法过程ddNTPd

24、dNTPddNTPddNTP与与与与dNTPdNTPdNTPdNTP聚丙烯酰胺凝胶电泳 DNADNA聚合酶聚合酶 单链单链DNADNA模板模板 单链寡核苷酸引物单链寡核苷酸引物 MgMg2+2+4 4种种dNTPdNTP(dATP,dGTP,dCTPdATP,dGTP,dCTP和和dTTPdTTP)4 4种种ddNTPddNTP(ddATP,ddGTP,ddCTPddATP,ddGTP,ddCTP和和ddTTPddTTP)3 3、反应体系、反应体系DNADNA序列测定策略序列测定策略1 1 1 1、定向测序、定向测序、定向测序、定向测序是从大片段是从大片段是从大片段是从大片段DNADNA的一端

25、开始按顺序进行分析的一端开始按顺序进行分析的一端开始按顺序进行分析的一端开始按顺序进行分析 。2 2、随机测序、随机测序、随机测序、随机测序又称鸟枪策略又称鸟枪策略又称鸟枪策略又称鸟枪策略(shotgun strategy)(shotgun strategy)，是将人类基因组，是将人类基因组，是将人类基因组，是将人类基因组DNADNA用机用机用机用机械方法随机切割成械方法随机切割成械方法随机切割成械方法随机切割成2Kb2Kb左右的小片段，把这些左右的小片段，把这些左右的小片段，把这些左右的小片段，把这些DNADNA片段装入片段装入片段装入片段装入适当载体，建立亚克隆文库，从中随机挑取克隆片段。

26、最后通适当载体，建立亚克隆文库，从中随机挑取克隆片段。最后通适当载体，建立亚克隆文库，从中随机挑取克隆片段。最后通适当载体，建立亚克隆文库，从中随机挑取克隆片段。最后通过克隆片段的重叠组装确定大片段过克隆片段的重叠组装确定大片段过克隆片段的重叠组装确定大片段过克隆片段的重叠组装确定大片段DNADNA序列。序列。序列。序列。3 3 3 3、多路测序、多路测序、多路测序、多路测序(Multiplex method)(Multiplex method)是鸟枪法的一种发展策略，是通过多个随机克隆同是鸟枪法的一种发展策略，是通过多个随机克隆同是鸟枪法的一种发展策略，是通过多个随机克隆同是鸟枪法的一种发展策略，是通过多个随机克隆同时进行电泳及阅读，快速分析时进行电泳及阅读，快速分析时进行电泳及阅读，快速分析时进行电泳及阅读，快速分析DNADNA序列的一种技术。序列的一种技术。序列的一种技术。序列的一种技术。分析仪器分析仪器分析仪器分析仪器实现了凝胶电泳、初始数据获取、碱基阅读等步骤自动化。实现了凝胶电泳、初始数据获取、碱基阅读等步骤自动化。DNADNA自动测序仪自动测序仪大规模大规模大规模大规模DNADNADNADNA测序的趋势测序的趋势测序的趋势测序的趋势 自动化自动化自动化自动化