蛋白质的研究历史与方法精选课件.ppt

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1、关于蛋白质的研究历史与方法第一页，本课件共有39页第一节第一节 蛋白质研究的历史回顾蛋白质研究的历史回顾 蛋白质是一类重要的生物大分子，蛋白质是一类重要的生物大分子，protein字源出自希腊文，是字源出自希腊文，是“最原初的最原初的”，“第一重要的第一重要的”意思意思 19世纪世纪30年代中期以前，认识其年代中期以前，认识其化学元化学元素组成素组成情况及情况及原子之间结合比例原子之间结合比例，即确定，即确定经验性的分子式经验性的分子式 第二页，本课件共有39页 1937年，年，A.W.k.Tiselius 建立了研究蛋白质的建立了研究蛋白质的移动界面电泳移动界面电泳(electrophore

2、sis)方法方法,于于1948年获诺年获诺贝尔化学奖贝尔化学奖 1941年，年，A.J.P.Martin和和R.L.M.Synge建建立了立了分配层析分配层析(partition chromatography)技术，技术，被授予被授予1952年的诺贝尔化学奖年的诺贝尔化学奖 第三页，本课件共有39页The Nobel Prize in Chemistry 1948for his research on electrophoresis and adsorption analysis,especially for his discoveries concerning the complex nat

3、ure of the serum proteinsArne W.K.Tiselius Uppsala University Uppsala,Sweden 1902-1971第四页，本课件共有39页The Nobel Prize in Chemistry 1952for their invention of partition chromatographyArcher J.P.MartinRichard L.M.Synge 1/2 of the prize1/2 of the prizeNational Institute for Medical Research London,United K

4、ingdom Rowett Research Institute Bucksburn(Scotland),United Kingdom1910-20021914-1994第五页，本课件共有39页第六页，本课件共有39页第七页，本课件共有39页第八页，本课件共有39页第九页，本课件共有39页第十页，本课件共有39页 1953年，年，F.Sanger利用纸层析和纸电泳利用纸层析和纸电泳技术第一次揭示出技术第一次揭示出牛胰岛素的一级结构牛胰岛素的一级结构，开创了以后数千种蛋白质序列分析的先声，开创了以后数千种蛋白质序列分析的先声，被授予被授予1958年诺贝尔化学奖年诺贝尔化学奖 第十一页，本课件共有

5、39页The Nobel Prize in Chemistry 1958for his work on the structure of proteins,especially that of insulinFrederick Sanger University of Cambridge Cambridge,United Kingdom 1918-第十二页，本课件共有39页The Nobel Prize in Chemistry 1980for his fundamental studies of the biochemistry of nucleic acids,with particula

6、r regard to recombinant-DNAfor their contributions concerning the determination of base sequences in nucleic acidsPaul Berg1/2 of the prizeStanford University Stanford,CA,USA1926-Walter Gilbert Frederick Sanger1/4 of the prize 1/4 of the prize Harvard University,Biological Laboratories Cambridge,MA,

7、USAMRC Laboratory of Molecular Biology Cambridge,United Kingdom1932-1918-第十三页，本课件共有39页 J.C.Kendrew(1958)及及M.F.Perutz(1960)利用利用X射线技术解析了射线技术解析了肌红蛋白肌红蛋白(myoglobin)和和血红蛋白血红蛋白(hemoglobin)的三维的三维结构，使人们第一次能够洞察生物大分子的结构，使人们第一次能够洞察生物大分子的空间结构，共同赢得了空间结构，共同赢得了1962年的诺贝尔化学年的诺贝尔化学奖奖 第十四页，本课件共有39页The Nobel Prize in C

8、hemistry 1962for their studies of the structures of globular proteins Max Ferdinand Perutz1/2 of the prizeMRC Laboratory of Molecular Biology Cambridge,United Kingdom1914-2002 John Cowdery Kendrew 1/2 of the prizeMRC Laboratory of Molecular Biology Cambridge,United Kingdom1917-1997 第十五页，本课件共有39页 20世

9、纪世纪70年代中后期，年代中后期，Gunter Blobel利用体外蛋利用体外蛋白质翻译系统发现动物细胞中很多分泌蛋白的跨膜白质翻译系统发现动物细胞中很多分泌蛋白的跨膜方式，提出方式，提出“信号假说信号假说”(signal hypothesis)，获得，获得了了1998年的诺贝尔生理医学奖年的诺贝尔生理医学奖 第十六页，本课件共有39页 20世纪世纪50年代后期，年代后期，E.W.Sutherland发现细发现细胞内胞内cAMP的存在，的存在，1971年被授予诺贝尔生理医年被授予诺贝尔生理医学奖学奖 70年代末年代末80年代初，年代初，A.G.Gilman和和M.Rodbell独立发现独立发现

10、G蛋白蛋白的存在，因此二人在的存在，因此二人在1994年获得诺贝尔生理医学奖年获得诺贝尔生理医学奖“信号转导信号转导”(signal transduction)第十七页，本课件共有39页The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1994for their discovery of G-proteins and the role of these proteins in signal transduction in cellsAlfred G.GilmanMartin Rodbell1941-1925-1998University of Texas,So

11、uthwestern Medical Center Dallas,TX,USA National Institute of Environmental Health Sciences Research Triangle Park,NC,USA 第十八页，本课件共有39页 60年代，年代，P.Mitchell提出提出“化学渗透学说化学渗透学说”，获获1978年获诺贝尔化学奖年获诺贝尔化学奖 70年代，年代，P.D.Boyer提出提出“结合改变机制结合改变机制”；90年代，年代，J.E.Walker测定测定ATP合酶的晶体结构，合酶的晶体结构，他们他们共享了共享了1997年的诺贝尔化学奖年的诺贝尔

12、化学奖 揭示能量转化机制揭示能量转化机制第十九页，本课件共有39页The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1993for contributions to the developments of methods within DNA-based chemistry Michael Smith1944-1932-2000La Jolla,CA,USA Kary B.Mullis University of British Columbia Vancouver,Canada for his invention of the polymerase chai

13、n reaction(PCR)methodfor his fundamental contributions to the establishment of oligonucleotide-based,site-directed mutagenesis and its development for protein studies第二十页，本课件共有39页Nature 1998;391:806-811.Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.第二十一页，本

14、课件共有39页What Roger Kornberg himself has now done is to describe how the genetic information is copied from DNA into what is called messenger-RNA第二十二页，本课件共有39页Kornberg had described how genetic information is transferred from a mother cell to its daughters.第二十三页，本课件共有39页The Nobel Prize in Physiology o

15、r Medicine 2007for their discoveries of principles for introducing specific gene modifications in mice by the use of embryonic stem cellsMario R.Capecchi Sir Martin J.Evans Oliver Smithies USA United Kingdom USA University of Utah Salt Lake City,UT,USA;Howard Hughes Medical Institute b.1937(in Italy

16、)Cardiff University Cardiff,United Kingdom b.1941 University of North Carolina at Chapel Hill Chapel Hill,NC,USA b.1925(in United Kingdom)第二十四页，本课件共有39页The Nobel Prize in Chemistry 2008for the discovery and development of the green fluorescent protein,GFPOsamu Shimomura Martin Chalfie Roger Y.Tsien1

17、/3oftheprize1/3oftheprize1/3oftheprizeUSAUSAUSAMarine Biological Laboratory(MBL)Woods Hole,MA,USA;Boston University Medical School Massachusetts,MA,USAb.1928(in Kyoto,Japan)Columbia University New York,NY,USA b.1947University of California San Diego,CA,USA;Howard Hughes Medical Instituteb.1952 第二十五页

18、，本课件共有39页The Nobel Prize in Physiology or Medicine 2008for his discovery of human papilloma viruses causing cervical cancerfor their discovery of human immunodeficiency virusHarald zur Hausen Franoise Barr-Sinoussi Luc Montagnier 1/2oftheprize1/4oftheprize1/4oftheprizeGermanyFranceFranceGerman Cance

19、r Research Centre Heidelberg,Germany b.1936 Regulation of Retroviral Infections Unit,Virology Department,Institut PasteurParis,Franceb.1947World Foundation for AIDS Research and PreventionParis,Franceb.1932第二十六页，本课件共有39页化学奖：化学奖：http:/ http:/nobelprize.org/nobel_prize/chemistry/生理生理/医学奖：医学奖：http:/ ht

20、tp:/nobelprize.org/nobel_prizes/medicine/第二十七页，本课件共有39页Summary(1)分离纯化蛋白质分离纯化蛋白质 测定蛋白质分子质量测定蛋白质分子质量蛋白质结构分析蛋白质结构分析蛋白质生物学活性分析蛋白质生物学活性分析探索结构与功能的关系探索结构与功能的关系第二十八页，本课件共有39页Summary(2)学科交叉学科交叉分子生物学是一门实践性、应用性强的学科分子生物学是一门实践性、应用性强的学科 生化方法学是在不断发展的生化方法学是在不断发展的 第二十九页，本课件共有39页第二节第二节 蛋白质样品的提取蛋白质样品的提取目的蛋白的获取目的蛋白的获取直

21、接从生物体直接从生物体内获取内获取基因工程表达基因工程表达重组蛋白重组蛋白采用免疫学方法获取相关抗体采用免疫学方法获取相关抗体获取蛋白质的编码获取蛋白质的编码序列序列(cDNA)基因组测序基因组测序基因组测序进行推导基因组测序进行推导获取部分肽段氨基酸序列获取部分肽段氨基酸序列捕获相应蛋白质捕获相应蛋白质第三十页，本课件共有39页经典的细胞蛋白质分离纯化流程由下述经典的细胞蛋白质分离纯化流程由下述主要步骤组成主要步骤组成：清洗组织或细胞清洗组织或细胞裂解细胞裂解细胞离心除去膜组分等获得可溶性蛋白质离心除去膜组分等获得可溶性蛋白质离心、层析、电泳等进一步纯化离心、层析、电泳等进一步纯化获取产物蛋

22、白获取产物蛋白第三十一页，本课件共有39页一、细胞的破碎一、细胞的破碎各种组织和细胞的常用破碎方法各种组织和细胞的常用破碎方法细胞破碎方法细胞破碎方法 组织种类组织种类 旋刀式匀浆旋刀式匀浆 大多数动、植物组织大多数动、植物组织手动式匀浆手动式匀浆 柔软的动物组织柔软的动物组织高压匀浆高压匀浆 细菌、酵母、植物细胞细菌、酵母、植物细胞研磨研磨 细菌、植物细胞细菌、植物细胞高速珠磨高速珠磨 细胞混悬液细胞混悬液酶溶酶溶 细菌、酵母细菌、酵母去垢剂渗透去垢剂渗透 组织培养细胞组织培养细胞有机溶剂渗透有机溶剂渗透 细菌、酵母细菌、酵母超声破碎超声破碎 细胞混悬液细胞混悬液低渗裂解低渗裂解 红细胞、细

23、菌红细胞、细菌冻融裂解冻融裂解 培养细胞培养细胞 第三十二页，本课件共有39页二、去污剂处理溶解二、去污剂处理溶解膜蛋白膜蛋白 去污剂为去污剂为双极性双极性(amphipathic)脂类分子，可脂类分子，可在水中溶解。通常由线性或带有分枝的碳氢化合在水中溶解。通常由线性或带有分枝的碳氢化合物尾部和结构各不相同的亲水性头部组成物尾部和结构各不相同的亲水性头部组成SDSTriton X-100NP-40Tween-20第三十三页，本课件共有39页三、蛋白质分子的稳定三、蛋白质分子的稳定 在蛋白质提取过程中，需要加入蛋白酶抑在蛋白质提取过程中，需要加入蛋白酶抑 制剂以防止蛋白水解制剂以防止蛋白水解P

24、MSF(35 ug/ml)EDTA(0.3 mg/ml)Pepstatin(0.7 ug/ml)Leupeptin(0.5 ug/ml)Aprotinin 目的：目的：保证蛋白质的生物活性保证蛋白质的生物活性第三十四页，本课件共有39页 细胞内有许多种还原成分，一旦细胞破碎细胞内有许多种还原成分，一旦细胞破碎 由于和氧的接触以及稀释作用而使抗氧化由于和氧的接触以及稀释作用而使抗氧化 成分减少，导致许多蛋白质被氧化而失去活成分减少，导致许多蛋白质被氧化而失去活 性，如巯基蛋白性，如巯基蛋白 常用的还原剂常用的还原剂 抗坏血酸抗坏血酸 巯基乙醇巯基乙醇(mercaptoethanol)二硫苏糖醇二

25、硫苏糖醇(dithiothreitol,DTT)第三十五页，本课件共有39页 蛋白质的环境因素蛋白质的环境因素 表面效应表面效应温度温度储存储存第三十六页，本课件共有39页四、离心去除细胞碎片四、离心去除细胞碎片五、目标蛋白的纯化五、目标蛋白的纯化 1.盐析盐析(salting out)2.离子交换层析离子交换层析3.凝胶过滤层析凝胶过滤层析4.亲和亲和层析层析第三十七页，本课件共有39页第三节第三节 蛋白质的检测和鉴定蛋白质的检测和鉴定光谱学特性光谱学特性190200 nm230300 nm电泳检测电泳检测SDS-PAGEIEF分子量测定分子量测定排阻层析排阻层析沉降平衡超速离心沉降平衡超速离心动态弹性光散射动态弹性光散射孔径梯度电泳孔径梯度电泳质谱质谱氨基酸序列测定氨基酸序列测定用抗体检测蛋白质用抗体检测蛋白质Western blotting免疫共沉淀免疫共沉淀第三十八页，本课件共有39页02.03.2023感感谢谢大大家家观观看看第三十九页，本课件共有39页