DNA、RNA及蛋白质操作技术.ppt

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1、第第 五五 章章 分子生物学研究法分子生物学研究法（上）（上）DNA、RNA及蛋白质操作技术及蛋白质操作技术基基因因操操作作主主要要包包括括DNA分分子子的的切切割割与与连连接接、细细胞胞转转化化、核核酸酸序序列列分分析析以以及及基基因因人人工工合合成成、表表达达、定定点点突变和突变和PCR扩增扩增等，是分子生物学研究的核心技术。等，是分子生物学研究的核心技术。基基因因工工程程是是指指在在体体外外将将核核酸酸分分子子插插入入病病毒毒、质质粒粒或或其其它它载载体体分分子子，构构成成遗遗传传物物质质的的新新组组合合，使使之之进进入入原原先先没没有有这这类类分分子子的的寄寄主主细细胞胞内内并并进进行

2、行持持续续稳稳定定的的繁殖和表达繁殖和表达。根根癌癌土土壤壤农农杆杆菌菌（Agrobaoterium tumefaciens）侵侵染染植植物物细细胞胞后后能能将将其其Ti（tumor inducing）质质粒粒上上的的一一段段DNA（T-DNA）插插入入到到被被侵侵染染细细胞胞的的基基因因组组，并并能能稳稳定定地地遗遗传传给给后后代代，植植物物的的遗遗传传转转化化（植植物物基基因因工工程程）技术随之得到迅速发展。技术随之得到迅速发展。5.1 重组重组DNA技术史话技术史话基因工程技术是核酸操作技术的一部分，只不过它基因工程技术是核酸操作技术的一部分，只不过它强强调了外源核酸分子在另一种不同的寄

3、主细胞中的繁衍调了外源核酸分子在另一种不同的寄主细胞中的繁衍与性状表达与性状表达。事实上，这种跨越物种屏障、把来自其它生物的基因事实上，这种跨越物种屏障、把来自其它生物的基因置于新的寄主生物细胞之中的能力，是基因工程技术置于新的寄主生物细胞之中的能力，是基因工程技术区别于其它生命科学技术的根本特征。区别于其它生命科学技术的根本特征。年年 份份事事 件件1869FMiescher首次从莱茵河首次从莱茵河鲑鱼精子中分离精子中分离DNA。1957AKornberg从大从大肠杆菌中杆菌中发现了了DNA聚合聚合酶I。1959-1960Uchoa发现RNA聚合聚合酶和信使和信使RNA，并，并证明明mRNA

4、决决定了蛋白定了蛋白质分子中的氨基酸序列。分子中的氨基酸序列。1961Nirenberg破破译了第一个了第一个遗传密密码；Jacob和和Monod提出了提出了调节基因表达的操基因表达的操纵子模型。子模型。1964Yanofsky和和Brenner等人等人证明，多明，多肽链上的氨基酸序上的氨基酸序列与列与该基因中的核苷酸序列存在着共基因中的核苷酸序列存在着共线性关系。性关系。1965Holley完成了酵母丙氨酸完成了酵母丙氨酸tRNA的全序列的全序列测定；科学家定；科学家证明明细菌的抗菌的抗药性通常由性通常由“质粒粒”DNA所决定。所决定。1966Nirenberg，Uchoa，Khorana，

5、Crick等人破等人破译了全了全部部遗传密密码。表表5-1重组重组DNA技术史上的主要事件技术史上的主要事件1967第一次第一次发现DNA连接接酶1970Smith，Wilcox和和Kelley分离了第一种限制性核酸分离了第一种限制性核酸内切内切酶，Temin和和Baltimore从从RNA肿瘤病毒中瘤病毒中发现反反转录酶。1972-1973Boyer，Berg等人等人发展了展了DNA重重组技技术，于，于72年年获得第一个重得第一个重组DNA分子，分子，73年完成第一例年完成第一例细菌菌基因克隆。基因克隆。1975-1977Sanger与与Maxam和和Gilbert等人等人发明了明了DNA序

6、列序列测定技定技术，1977年完成了全年完成了全长5387bp的噬菌体的噬菌体174基因基因组测定。定。1978首次在大首次在大肠杆菌中生杆菌中生产由人工合成基因表达的人由人工合成基因表达的人脑激素和人激素和人胰胰岛素素。1980美国美国联邦最高法院裁定微生物基因工程可以被邦最高法院裁定微生物基因工程可以被专利利化。化。1981Palmiter和和Brinster获得得转基因小鼠，基因小鼠，Spradling和和Rubin得到得到转基因果基因果蝇。1982美、英批准使用第一例基因工程美、英批准使用第一例基因工程药物物胰胰岛素，素，Sanger等人完成了入噬菌体等人完成了入噬菌体48,502bp

7、全序列全序列测定。定。1983获得第一例得第一例转基因植物基因植物。1984斯坦福大学斯坦福大学获得关于重得关于重组DNA的的专利。利。1986GMO首次在首次在环境中境中释放。放。1988Watson出任出任“人人类基因基因组计划划”首席科学家。首席科学家。1989DuPont公司公司获得得转肿瘤基因小鼠瘤基因小鼠“Oncomouse”。1992欧共体欧共体35个个实验室室联合完成酵母第三染色体全序列合完成酵母第三染色体全序列测定定（315kb）。）。1994第一批基因工程西第一批基因工程西红柿在美国上市。柿在美国上市。1996完成了完成了酵母基因酵母基因组（1.25107bp）全序列）全序

8、列测定。定。1997英国英国爱丁堡丁堡罗斯林研究所斯林研究所获得得克隆羊克隆羊。2000完成完成拟南芥南芥的全序列的全序列测定（定（1.2108bp）。）。2001完成第一个完成第一个人人类基因基因组全序列全序列测定（定（2.7109bp）。）。上个世纪中下叶以来，现代分子生物学的迅猛发展源上个世纪中下叶以来，现代分子生物学的迅猛发展源自工具酶的发现。自工具酶的发现。（一）（一）限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶能能够够识识别别DNA上上的的特特定定碱碱基基序序列列并并从从这这个个位位点点切切开开DNA分子。分子。第第一一个个核核酸酸内内切切酶酶EcoRI是是Boyer实实验验室室在在1972年

9、年发发现现的的，它它能能特特异异性性识识别别GAATTC序序列列，将将双双链链DNA分分子在这个位点切开并产生具有粘性末端的小片段。子在这个位点切开并产生具有粘性末端的小片段。图图5-1 几种主要几种主要DNA内切酶所识别的序列及内切酶所识别的序列及其酶切末端其酶切末端。图图5-2 DNA连接酶能把不同的连接酶能把不同的DNA片段连接成一个整体片段连接成一个整体 多聚核苷酸链中新生磷酸糖苷键的产生过程多聚核苷酸链中新生磷酸糖苷键的产生过程单核苷酸5-磷酸基团向核酸链的3-OH发起进攻RE 切割随机切割随机DNA分子（假定分子（假定4种碱基在种碱基在DNA中均匀中均匀分布）的概率由该酶所识别的碱

10、基数目按照分布）的概率由该酶所识别的碱基数目按照4n 来计来计算，如一个算，如一个6碱基切割酶平均每碱基切割酶平均每4096 bp核核DNA有一有一个酶切位点（个酶切位点（46），而一个），而一个4碱基切割酶平均每碱基切割酶平均每256 bp核核DNA就有一个酶切位点（就有一个酶切位点（44）。）。重组重组DNA实验中常见的主要工具酶实验中常见的主要工具酶酶酶 类类功功 能能限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶识别并在特定位点切开识别并在特定位点切开DNADNADNADNA连接酶连接酶通通过过磷磷酸酸二二酯酯键键把把两两个个或或多多个个DNADNA片片段段连连接接成一个成一个DNADNA分子分子D

11、NADNA聚合酶聚合酶I I（大肠杆菌）（大肠杆菌）按按55到到33方方向向加加入入新新的的核核苷苷酸酸，补补平平DNADNA双双链中的缺口链中的缺口反转录酶反转录酶按按照照RNARNA分分子子中中的的碱碱基基序序列列，根根据据碱碱基基互互补补原则合成原则合成DNADNA链链多核苷酸激酶多核苷酸激酶把把磷磷酸酸基基团团加加到到多多聚聚核核苷苷酸酸链链的的5-OH5-OH末末端端（进行末端标记实验或用来进行（进行末端标记实验或用来进行DNADNA的连接的连接末端转移酶末端转移酶在双链核酸的在双链核酸的3 3末端加上多聚或单核苷酸末端加上多聚或单核苷酸DNADNA外切酶外切酶IIIIII从从DNA

12、DNA链的链的33末端逐个切除单核苷酸末端逐个切除单核苷酸噬菌体噬菌体DNADNA外切酶外切酶从从DNADNA链的链的55末端逐个切除单核苷酸末端逐个切除单核苷酸碱性磷酸酯酶碱性磷酸酯酶切除位于切除位于DNADNA链末端的磷酸基团链末端的磷酸基团嘌呤嘌呤腺嘌呤腺嘌呤鸟嘌呤鸟嘌呤嘧啶嘧啶胞嘧啶胞嘧啶尿嘧啶尿嘧啶胸腺嘧啶胸腺嘧啶组成组成DNA和和RNA分子的五种含氮碱基的结构式分子的五种含氮碱基的结构式仅仅能在体外利用限制性核酸内切酶和仅仅能在体外利用限制性核酸内切酶和DNA连接酶连接酶进行进行DNA的切割和重组，还不能满足基因工程的要的切割和重组，还不能满足基因工程的要求，只有将它们连接到具备自

13、主复制能力的求，只有将它们连接到具备自主复制能力的DNA分分子上，才能在寄主细胞中进行繁殖。子上，才能在寄主细胞中进行繁殖。具备自主复制能力的具备自主复制能力的DNA分子就是分子克隆的载体分子就是分子克隆的载体（vector）。病毒、噬菌体和质粒等小分子量复制）。病毒、噬菌体和质粒等小分子量复制子都可以作为基因导入的载体。子都可以作为基因导入的载体。（二）基因克隆的载体（二）基因克隆的载体 1、pSC101质粒载体质粒载体长长9.09kb，带带有有四四环环素素抗抗性性基基因因（tetr）及及EcoRI、HindIII、BamHI、SalI、XhoI、PvuII以以及及SmaI等等7种种限限制制

14、性性核核酸酸内内切切酶酶的的单单酶酶切切位位点点，在在HindIII、BamHI和和SalI等等3个个位位点点插插入入外外源源基基因因，会会导导致致tetr失活。失活。大大 肠肠 杆杆 菌菌pSC101质质粒粒 载载 体体 示示意图。意图。是是第第一一个个基基因因克克隆隆载载体体。缺缺点点：它它是是一一种种严严紧紧型型复复制制控控制制的的低低拷拷贝贝质质粒粒，平平均均每每个个寄寄主主细细胞胞仅仅有有12个个拷拷贝贝，从从带带有有该该质质粒粒的的寄寄主主细细胞胞中中提提取取pSC101 DNA，产产量量很低。很低。2、ColE1质粒载体质粒载体松弛型复制控制的多拷贝质粒。松弛型复制控制的多拷贝质

15、粒。一一般般情情况况下下，当当培培养养基基中中氨氨基基酸酸被被耗耗尽尽，或或是是在在细细胞胞培培养养物物中中加加入入氯氯霉霉素素以以抑抑制制蛋蛋白白质质的的合合成成，寄寄主主染染色色体体DNA的的复复制制便便被被抑抑制制，细细胞胞的的生生长长也也随随之之停停止。止。松松弛弛型型质质粒粒DNA却却继继续续复复制制数数小小时时，使使每每个个寄寄主主细细胞胞中中ColE1质质粒粒的的拷拷贝贝数数达达到到10003000个个，占占细细胞胞总总DNA的的50%左右。左右。oriColE16.64 kbColE1质粒质粒DNA复制起始部位调控因子之间关系复制起始部位调控因子之间关系前体前体RNA(RNAI

16、I)的转录起始于复制起点上游，需经的转录起始于复制起点上游，需经RNaseH加工后产生有加工后产生有555个核苷酸的引物，起始个核苷酸的引物，起始DNA合成。合成。RNA 1在在RNA 2的的5末端，转录方向相反，因此能通过末端，转录方向相反，因此能通过氢键配对与后者相互作用，阻止氢键配对与后者相互作用，阻止RNaseH加工加工RNA 2，使其不能转化为有活性的引物，阻碍复制起始。使其不能转化为有活性的引物，阻碍复制起始。没有没有Rop蛋白，蛋白，RNA 1基因就不能起始转录。基因就不能起始转录。3、pBR322质粒载体质粒载体由三个不同来源的部分组成的：由三个不同来源的部分组成的：第第一一部

17、部分分来来源源于于pSF2124质质粒粒易易位位子子Tn3的的氨氨苄苄青青霉霉素抗性基因（素抗性基因（AmpR）；）；第第二二部部分分来来源源于于pSC101质质粒粒的的四四环环素素抗抗性性基基因因（tetr）；）；第第三三部部分分则则来来源源于于ColE1的的派派生生质质粒粒pMB1的的DNA复复制起点（制起点（ori）。）。AmprpBR3224.36 kb优优点点是是具具有有较较小小的的分分子子量量（4363 bp）。能能携携带带6-8 kb的外源的外源DNA片段，操作较为便利。片段，操作较为便利。有两种抗生素抗性基因作为转化子的选择标记。有两种抗生素抗性基因作为转化子的选择标记。有有较

18、较高高的的拷拷贝贝数数，经经过过氯氯霉霉素素扩扩增增，每每个个细细胞胞可可累累积积1000300010003000个拷贝，便于制备重组体个拷贝，便于制备重组体DNADNA。4、pUC质粒载体（包括四个部分）：质粒载体（包括四个部分）：来自来自pBR322质粒的复制起点（质粒的复制起点（ori）氨苄青霉素抗性基因（氨苄青霉素抗性基因（ampr）大大肠肠杆杆菌菌-半半乳乳糖糖酶酶基基因因（lacZ）启启动动子子及及编编码码-肽链的肽链的DNA序列。特称为序列。特称为lacZ基因基因位位于于lacZ基基因因5-端端的的一一段段多多克克隆隆位位点点（MCS），外源基因插入破坏外源基因插入破坏lacZ

19、基因功能基因功能pUC182.69 kbLacZ编码编码-半乳糖苷半乳糖苷酶氨基端氨基端146个氨基酸的个氨基酸的-肽，IPTG（异丙基（异丙基-D-硫代半乳糖苷）诱导硫代半乳糖苷）诱导该基因表达，基因表达，所合成的所合成的-半乳糖苷酶半乳糖苷酶-肽与宿主细胞编码的缺陷型肽与宿主细胞编码的缺陷型-半乳糖苷酶互补，产生有活性的半乳糖苷酶互补，产生有活性的-半乳糖苷酶，水半乳糖苷酶，水解培养基中的解培养基中的X-gal（5-溴溴-4-氯氯-3-吲哚吲哚-D-半乳糖苷）半乳糖苷），生成蓝色的溴氯吲哚。，生成蓝色的溴氯吲哚。含含X-gal培养基中非转化菌落呈蓝色，含有重组培养基中非转化菌落呈蓝色，含有

20、重组DNA分子的菌落为白色。分子的菌落为白色。优点：优点：更更小小的的分分子子量量和和更更高高的的拷拷贝贝数数。在在pBR322基基础础上上构构建建pUC质质粒粒载载体体时时，仅仅保保留留下下其其中中的的氨氨苄苄青青霉霉素素抗抗性性基基因因及及复复制制起起点点，其其分分子子小小了了许许多多，pUC8为为2750bp，pUC18为为2686bp。由由于于缺缺失失rop基基因因，pUC质质粒粒不不经经氯氯霉霉素素扩扩增增时时，平平均均每每个个细细胞胞即即可可达达500700个拷贝。个拷贝。pUC质质粒粒结结构构中中具具有有来来自自大大肠肠杆杆菌菌lac操操纵纵子子的的lacZ基基因因，所所编编码码

21、的的-肽肽链链可可参参与与-互互补补作作用用。因因此此，可可用用X-gal显色法实现对重组体转化子的鉴定。显色法实现对重组体转化子的鉴定。具具有有多多克克隆隆位位点点MCS区区段段，可可以以把把具具两两种种不不同同粘粘性性末末端端（如如EcoRI和和BamHI）的的外外源源DNA片片段段直直接接克克隆隆到到pUC8质粒载体上。质粒载体上。5、pGEM-3Z质粒质粒 长长度度为为2743bp，编编码码有有一一个个氨氨苄苄青青霉霉素素抗抗性性基基因因和和一个一个lacZ基因。基因。含含有有两两个个噬噬菌菌体体启启动动子子(T7和和SP6)，为为RNA聚聚合合酶酶的的附附着着提提供供了了特特异异性性

22、识识别别位位点点。加加入入T7或或SP6 RNA聚聚合合酶，所克隆的外源基因便会转录出相应的酶，所克隆的外源基因便会转录出相应的mRNA。6、穿梭质粒载体（、穿梭质粒载体（shuttle plasmid vector）由由人人工工构构建建的的具具有有原原核核和和真真核核两两种种不不同同复复制制起起点点和和选选择择标标记记，可可在在不不同同的的寄寄主主细细胞胞内内存存活活和和复复制制的的质粒载体。质粒载体。这这类类质质粒粒载载体体可可保保证证外外源源DNA序序列列在在不不同同物物种种(原核和真核原核和真核)的细胞内得到扩增，用途广泛。的细胞内得到扩增，用途广泛。7、pBluescript噬菌粒载

23、体噬菌粒载体 pBluescript是是一一类类从从pUC载载体体派派生生而而来来的的噬噬菌菌粒粒载载体体，简简称称为为pBS（+/-），如如今今则则更更多多地地叫叫作作pBluescript KS（+/-）或）或pBluescript SK（+/-）。）。SK表表示示多多克克隆隆位位点点区区的的取取向向，即即lacZ基基因因是是按按照照SacIKpnI的方向转录；的方向转录；（+/-）表表示示单单链链噬噬菌菌体体f1复复制制起起点点的的两两种种相相反反的的取取向。向。f1（+）起起点点表表示示当当pBluescript噬噬菌菌粒粒载载体体和和辅辅助助噬噬菌菌体体共共感感染染寄寄主主细细胞胞时

24、时，能能够够回回收收到到lacZ基基因因的的有有意意义义链链DNA；而而f1（-）起起点点则则表表示示当当pBluesript噬噬菌菌粒粒载载体体与与辅辅助助噬噬菌菌体体共共感感染染寄寄主主细细胞胞时时，可可回回收收到到lacZ基因的无意义链基因的无意义链DNA。(i)在在多多克克隆隆位位点点区区（MCS）的的两两侧侧，存存在在一一对对T3和和T7噬噬菌菌体体的的启启动动子子，用用以以定定向向指指导导插插入入在在多多克克隆隆位位点点上上的外源基因的转录；的外源基因的转录；(ii)具具有有单单链链噬噬菌菌体体f1的的复复制制起起点点和和一一个个来来自自ColE1质质粒粒的的复复制制起起点点，保保

25、证证pBluescript噬噬菌菌粒粒载载体体在在有有无无辅辅助助噬噬菌菌体体共共感感染染时时，按按照照不不同同的的复复制制形形式式分分别别合合成成出出单链或双链单链或双链DNA；(iii）编编码码有有一一个个氨氨苄苄青青霉霉素素抗抗性性基基因因，作作为为转转化化子子克克隆的选择标记；隆的选择标记；(iv)含含有有一一个个lacZ基基因因，可可以以按按照照X-gal-IPTG组组织织化化学显色法筛选噬菌粒载体的重组子。学显色法筛选噬菌粒载体的重组子。5.2 DNA操作技术操作技术5.2.1核酸的凝胶电泳核酸的凝胶电泳自自 从从 琼琼 脂脂 糖糖（agarose）和和 聚聚 丙丙 烯烯 酰酰 胺

26、胺（polyacrylamide）凝凝胶胶被被引引入入核核酸酸研研究究以以来来，按按分分子子量量大大小小分分离离DNA的的凝凝胶胶电电泳泳技技术术，已已经经发发展展成成为为一一种种分分析析鉴鉴定定重重组组DNA分分子子及及蛋蛋白白质质与与核核酸酸相相互互作作用用的的重要实验手段。重要实验手段。一一种种分分子子被被放放置置到到电电场场中中，它它就就会会以以一一定定的的速速度度移移向向适适当当的的电电极极。我我们们把把这这种种电电泳泳分分子子在在电电场场作作用用下下的的迁迁移移速速度度，叫叫做做电电泳泳的的迁迁移移率率，它它与与电电场场强强度度和和电电泳泳分分子本身所携带的净电荷数成正比，与片段大

27、小成反比。子本身所携带的净电荷数成正比，与片段大小成反比。生生理理条条件件下下，核核酸酸分分子子中中的的磷磷酸酸基基团团呈呈离离子子化化状状态态，所所 以以，DNA和和 RNA又又 被被 称称 为为 多多 聚聚 阴阴 离离 子子（polyanions），在电场中向正电极的方向迁移。），在电场中向正电极的方向迁移。由由于于糖糖-磷磷酸酸骨骨架架在在结结构构上上的的重重复复性性质质，相相同同数数量量的的双双链链DNA几几乎乎具具有有等等量量的的净净电电荷荷，因因此此它它们们能能以以同同样的速度向正电极方向迁移。样的速度向正电极方向迁移。琼脂糖凝胶分辨琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围为片段的范围为0.

28、250kb之间。之间。聚丙烯酰胺凝胶的分辨范围为聚丙烯酰胺凝胶的分辨范围为1到到1000个碱基对之间。个碱基对之间。凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小，浓度越高，凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小，浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。孔隙越小，其分辨能力就越强。表表5-3 琼脂糖及聚丙烯酰胺凝胶分辨琼脂糖及聚丙烯酰胺凝胶分辨DNA片片段的能力段的能力 凝胶类型及浓度凝胶类型及浓度 分离分离DNA的大小范围（的大小范围（bp）0.3%琼脂糖琼脂糖 50 0001 000 0.7%琼脂糖琼脂糖 20 0001 000 1.4%琼脂糖琼脂糖 6 000300 4.0%聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺 1

29、000100 10.0%聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺 50025 20.0%聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺 501溴溴化化乙乙锭锭染染料料的的化化学学结结构构及及其其对对DNADNA分分子子的的插插入入作作用用。由由于于插插入入了了溴溴化化乙乙锭锭分分子子，在在紫紫外外光光照照射射下下，琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶电电泳泳中中DNADNA的的条条带带便便呈呈现现出出橘橘黄黄色色荧荧光光，易于鉴定。易于鉴定。DNA脉冲电场凝胶电泳示意图脉冲电场凝胶电泳示意图 5.2.2 细菌转化与目标细菌转化与目标DNA分子的增殖分子的增殖获获得得了了用用外外源源DNA片片段段和和载载体体分分子子重重组组而而成成的的杂杂种种DNA分分子

30、子后后，还还必必须须通通过过一一个个被被称称为为细细菌菌转转化化的的过过程程将将其其重重新新导导入入到到寄寄主主细细胞胞中中，才才能能保保证证重重组组DNA分分子子的增殖。的增殖。外源外源DNA能在宿主细胞中通过自身载体上的复制起始能在宿主细胞中通过自身载体上的复制起始位点进行复制增殖，从而在宿主细胞中长期保存，并位点进行复制增殖，从而在宿主细胞中长期保存，并以完整的形式从细胞中被分离纯化出来。以完整的形式从细胞中被分离纯化出来。细菌转化（细菌转化（transformation），是指一种细菌菌株由于），是指一种细菌菌株由于捕获了来自供体菌株的捕获了来自供体菌株的DNA而导致性状特征发生遗传而

31、导致性状特征发生遗传改变的过程。改变的过程。重组重组DNA操作过程示意图操作过程示意图 为提高效率，可对受体菌进行物理或化学处理，增为提高效率，可对受体菌进行物理或化学处理，增加其获取加其获取DNADNA的能力。经过这种处理的细胞被称作感的能力。经过这种处理的细胞被称作感受态细胞受态细胞（competent cells）。CaCl2法法将将快快速速生生长长期期大大肠肠杆杆菌菌置置于于经经0预预处处理理的的低低渗渗CaCl2溶溶液液中中，细细胞胞膨膨胀胀，膜膜通通透透性性改改变变，易易与与外外源源DNA相相粘附。粘附。将将该该体体系系转转移移到到42下下做做短短暂暂的的热热刺刺激激，外外源源DN

32、A就就可可能能被被细细胞胞吸吸收收。将将经经过过转转化化后后的的细细胞胞置置于于选选择择性性培培养基上，筛选阳性克隆。养基上，筛选阳性克隆。转转化化效效率率可可达达到到51062107个个转转化化子子/g超超螺螺旋旋质质粒粒DNA。细菌转化及蓝白斑筛选细菌转化及蓝白斑筛选 电击法电击法电脉冲可以在细胞膜上造成小凹陷，形成疏水孔洞。电脉冲可以在细胞膜上造成小凹陷，形成疏水孔洞。随着跨膜电压增加，大疏水性孔洞会转变为亲水性随着跨膜电压增加，大疏水性孔洞会转变为亲水性孔洞，介质中的孔洞，介质中的DNA进入细胞质。进入细胞质。将将生生长长至至对对数数中中期期的的E.coli菌菌液液冷冷却却至至4后后离

33、离心心，洗洗 菌菌 后后 用用 10%的的 甘甘 油油 悬悬 浮浮，将将 高高 密密 度度 菌菌 液液（21010/ml）置于特制的电极杯中进行电击。）置于特制的电极杯中进行电击。获获得得最最大大转转化化效效率率时时场场强强一一般般为为12.515kV/cm，时间跨度一般为时间跨度一般为4.55.5毫秒。毫秒。电电击击转转化化与与温温度度有有关关，一一般般在在04进进行行。由由于于转转化化载载体体上上常常带带有有LacZ基基因因，多多用用带带有有不不同同抗抗生生素素的的选选择择性性培培养养基基结结合合-互互补补蓝蓝白白斑斑筛筛选选法法鉴鉴定定转转化化细细胞。胞。利用噬菌体颗粒能够有效地将利用噬

34、菌体颗粒能够有效地将DNADNA注入到寄主细胞中注入到寄主细胞中这一特点，科学家还发明了重组体这一特点，科学家还发明了重组体DNADNA分子的体外包分子的体外包装法。经包装的基因工程噬菌体颗粒能够借助细菌装法。经包装的基因工程噬菌体颗粒能够借助细菌表面的噬菌体接受器位点将表面的噬菌体接受器位点将DNADNA注入受体细菌，并在注入受体细菌，并在这些细胞中得到繁殖和表达。这些细胞中得到繁殖和表达。5.2.3聚合酶链式反应（聚合酶链式反应（PCR）技术）技术聚合酶链式反应是快速扩增聚合酶链式反应是快速扩增DNA序列最常用的方法。序列最常用的方法。PCR反反应应的的模模板板DNA若若是是基基因因组组上

35、上的的某某个个片片段段，就就称称为为genomic PCR，若若是是mRNA反反转转录录产产生生的的cDNA，就称为，就称为RT-PCR。图图5-7 聚合酶链式反应（聚合酶链式反应（PCR）技术）技术 图图5-8 PCR指指数数扩扩增增时时循循环环次次数数与与DNA产产物物数数量量的的比比较较1989年年12月，月，著名的自然科学杂志著名的自然科学杂志“SCIENCE”将将PCR和它所使用的聚合酶命名为第一个和它所使用的聚合酶命名为第一个“年度分子年度分子”。主编主编Daniel Koshland Jr.写道：第一篇有关写道：第一篇有关PCR的论的论文发表于文发表于1985年。自那以后，年。自

36、那以后，PCR已经发展成为日益已经发展成为日益强大的和有广泛用途的技术。强大的和有广泛用途的技术。有了有了PCR，极少量，极少量遗传物质也能扩增产生大量一般实验室都能得到的、遗传物质也能扩增产生大量一般实验室都能得到的、可用于生化分析和鉴定的材料。可用于生化分析和鉴定的材料。“SCIENCE”确实在确实在1985年发表了第一篇关于年发表了第一篇关于PCR的的论文。但是，却拒绝了由穆利斯撰写的描述论文。但是，却拒绝了由穆利斯撰写的描述PCR技技术的论文。编辑部给他回了一封标准的拒稿信：术的论文。编辑部给他回了一封标准的拒稿信：“这篇文章虽然通过了评审委员会的初选，但不幸这篇文章虽然通过了评审委员

37、会的初选，但不幸的是，专家们对本文的评审结论并没有像对同时期的是，专家们对本文的评审结论并没有像对同时期拟录用的稿件那样积极。所以，尊稿无力竞争本刊拟录用的稿件那样积极。所以，尊稿无力竞争本刊有限的版面。有限的版面。”凯利凯利穆利斯（穆利斯（Kary Mullis），），1944年出生，年出生，1962年年在佐治亚理工学院化学工程专业毕业在佐治亚理工学院化学工程专业毕业.受受同学们的蛊惑同学们的蛊惑，1966年报考加州伯克利大学生化专年报考加州伯克利大学生化专业研究生被录取。业研究生被录取。1968年一个人在年一个人在NATURE发表发表“时间反演的宇宙学意时间反演的宇宙学意义义”论文并论文并

38、侥幸侥幸通过了博士生资格考试。通过了博士生资格考试。1972年，以年，以“微生物铁转运因子的结构与有机合成微生物铁转运因子的结构与有机合成”获得博士学位。获得博士学位。毕业后，尝试写小说，但因毕业后，尝试写小说，但因“不能使一部分人物具有不能使一部分人物具有不幸的遭遇不幸的遭遇”而失败，又因而失败，又因厌恶天天宰杀实验小鼠厌恶天天宰杀实验小鼠而而两次丢掉工作。两次丢掉工作。他有一条知名的可能引起不少同学共鸣的学习曲线：他有一条知名的可能引起不少同学共鸣的学习曲线：刚开始时，对拓宽自身知识面表现出极大的兴趣刚开始时，对拓宽自身知识面表现出极大的兴趣知知识迅速上升，然后徘徊不前，最终进入失望和不安

39、阶识迅速上升，然后徘徊不前，最终进入失望和不安阶段段辞职辞职以后去一家小咖啡馆当了两年经理。以后去一家小咖啡馆当了两年经理。1979年加入西特年加入西特斯公司，负责斯公司，负责DNA合成。合成。正是费时费力的正是费时费力的DNA合成（单引物，以算术级数增长）合成（单引物，以算术级数增长），激发了他的思维。，激发了他的思维。1983年年8月，穆利斯第一次在公司正式作了一个有关月，穆利斯第一次在公司正式作了一个有关PCR原理原理的学术报告。人们对这个报告的反应冷谈，的学术报告。人们对这个报告的反应冷谈，只有少数几个实验技术人员有些兴趣。穆利斯回忆说，只有少数几个实验技术人员有些兴趣。穆利斯回忆说，

40、“绝大多数人要么在我结束报告之前就离开了会场，绝大多数人要么在我结束报告之前就离开了会场，要么故意留下来给我出难题。他们认为这些肯定是胡要么故意留下来给我出难题。他们认为这些肯定是胡说八道。说八道。”普遍的观点是，虽然我不够聪明，没看出问题的要害，普遍的观点是，虽然我不够聪明，没看出问题的要害，但肯定有理由证明这个方法不行，要不为什么从前没但肯定有理由证明这个方法不行，要不为什么从前没人想到呢？人想到呢？PCR技术的原理技术的原理首首先先将将双双链链DNA分分子子在在临临近近沸沸点点的的温温度度下下加加热热分分离离成成两两条条单单链链DNA分分子子，DNA聚聚合合酶酶以以单单链链DNA为为模模

41、板板并并利利用用反反应应混混合合物物中中的的四四种种脱脱氧氧核核苷苷三三磷磷酸酸、合合适适的的Mg2+浓浓度度和和实实验验中中提提供供的的引引物物序序列列合合成成新新生生的的DNA分子。分子。DNA解链（变性）解链（变性）引物与模板引物与模板DNA相结合（退火）相结合（退火）DNA合成（链的延伸）三步。合成（链的延伸）三步。经经不不断断重重复复循循环环之之后后，反反应应混混合合物物中中所所含含有有的的双双链链DNA分分子子数数，即即两两条条引引物物结结合合位位点点之之间间的的DNA区区段段的拷贝数，理论上的最高值应是的拷贝数，理论上的最高值应是2n,实得实得1.8n.将将含含有有待待扩扩增增D

42、NA样样品品的的反反应应混混合合物物放放置置在在高高温温（94）环环境境下下加加热热1分分钟钟，使使双双链链DNA变变性性，形形成成单链模板单链模板DNA。94加热，变性加热，变性（也叫淬火）（也叫淬火）降降低低反反应应温温度度（退退火火，约约50），约约1分分钟钟，使使寡寡核核苷苷酸酸引引物物与与两两条条单单链链模模板板DNA结结合合在在靶靶DNA区区段段两两端端的互补序列位置上。的互补序列位置上。5060，退火，退火引物与模板引物与模板DNA相相结合结合将将反反应应混混合合物物的的温温度度上上升升到到72左左右右保保温温1-数数分分钟钟，在在DNA聚聚合合酶酶的的作作用用下下，从从引引物物

43、的的3-端端加加入入脱脱氧氧核核苷苷三三磷磷酸酸，并并沿沿着着模模板板分分子子按按53方方向向延延伸伸，合合成成新新生生DNA互补链。互补链。PCR扩增，扩增，72左右左右,按每按每分钟分钟1000个碱基对设计个碱基对设计循环往复循环往复实验中通过对拟南芥基因芯片数据分析实验中通过对拟南芥基因芯片数据分析,鉴定出一个受鉴定出一个受干旱胁迫诱导的干旱胁迫诱导的cDNA。干旱、紫外线、脱落酸、高。干旱、紫外线、脱落酸、高盐以及水杨酸等胁迫条件处理后表达量均有显著提高盐以及水杨酸等胁迫条件处理后表达量均有显著提高,特别是干旱处理特别是干旱处理3h后表达量极后表达量极显著显著提高。提高。多序列比对和系

44、统进化分析发现该基因含有典型的多序列比对和系统进化分析发现该基因含有典型的AP2/EREBP DNA结合结构域，且属于结合结构域，且属于DREB亚家族。亚家族。由于其由于其N端富含谷氨酰氨残基端富含谷氨酰氨残基,将它命名为将它命名为QRAP2(Glutamine-rich AP2)。5.2.4 实时定量实时定量PCR（real time quantitative PCR，Q-PCR）由由于于PCR敏敏感感性性高高，扩扩增增产产物物总总量量变变异异系系数数大大，定定量量不不准准确确。90年年代代末末期期出出现现了了Q-PCR，利利用用荧荧光光检检测测PCR仪仪绘绘制制DNA扩扩增增过过程程中中的

45、的累累积积速速率率动动态态变变化化图图，基基本本消消除除在在测测定定终终端端产产物物丰丰度度时时变变异异系系数数较较大大的问题。的问题。混混合合在在PCR反反应应液液中中的的荧荧光光探探针针只只有有与与大大片片段段DNA结合后，才能够被激发出荧光。结合后，才能够被激发出荧光。随随着着新新合合成成DNA片片段段的的增增加加，由由于于结结合合到到DNA上上的的荧光探针增加，被激发产生的荧光相应增加。荧光探针增加，被激发产生的荧光相应增加。非非序序列列特特异异性性荧荧光光染染料料SYBR Green I,激激发发光光波波长长520nm。SYBR Green I作作探探针针的的实实时时定定量量PCR实

46、实验验过程图示过程图示 Ct值值是是产产物物荧荧光光强强度度首首次次超超过过设设定定阈阈值值时时，PCR反反应应所所需需的的循循环环数数。利利用用标标准准曲曲线线，可可以以确确定定样样品品中中待待检检测靶测靶DNA的绝对含量。的绝对含量。图图5-11用实时定量用实时定量PCR法法分析未知样品靶基因的绝对分析未知样品靶基因的绝对量量A 扩增曲线循环数荧光强度Log值循环数B标准曲线线性范围的确定线性范围的确定为为确确保保荧荧光光检检测测的的确确实实是是靶靶DNA，又又设设计计了了仅仅能能与与目的目的DNA特异结合的荧光探针。特异结合的荧光探针。TaqMan探探针针是是一一段段与与靶靶DNA序序列

47、列中中间间部部位位结结合合的的单单链链DNA，长长50bp-150bp，该该DNA的的5和和3端端带带有有短短波波长长和和长长波波长长两两个个不不同同荧荧光光基基团团，由由于于彼彼此此距距离离靠靠近近，在在荧荧光光共共振振能能量量转转移移（FRET）作作用用下下发发生荧光淬灭，因而检测不到荧光。生荧光淬灭，因而检测不到荧光。随随着着PCR反反应应的的进进行行，TaqMan 探探针针结结合合到到目目的的DNA序序列列上上，并并且且会会被被具具有有外外切切酶酶活活性性的的Taq DNA聚聚合合酶酶逐逐个个切切除除而而降降解解。切切下下来来的的荧荧光光基基团团解解除除了了荧荧光光淬淬灭灭的的束束缚缚

48、，会会在在激激发发光光下下发发出出荧荧光光，因因此此，产生的荧光强度直接反映了所扩增靶产生的荧光强度直接反映了所扩增靶DNA的总量。的总量。TaqMan探探针针 实实 时时 定定量量 PCR技技术术 表表5-3 实时定量实时定量PCR相对定量实验的数据处理相对定量实验的数据处理*野生型拟南芥（WT）突变体拟南芥（Mu）Ct(AvgCtWT-AvgCtMu）相对比值（1.8Ct）Wus Ct值31.4921.7830.8721.9531.3422.04平均值（Avg）31.23+0.3221.92+0.139.31+0.19239+26.25*拟南芥野生型和突变体样品经由拟南芥持家基因（UBQ1

49、0）进行均一化处理。5.2.5 重亚硫酸盐测序技术（重亚硫酸盐测序技术（Bisulfite Sequencing）DNA分子上可能发生多种化学修饰，如甲基化、乙分子上可能发生多种化学修饰，如甲基化、乙酰化等。在不改变酰化等。在不改变DNA序列的情况下，通过对序列的情况下，通过对DNA分子的化学修饰，可以改变基因表达水平。相对于分子的化学修饰，可以改变基因表达水平。相对于传统的遗传学传统的遗传学即只有即只有DNA序列变化才能导致基序列变化才能导致基因表达的改变因表达的改变而言，这种现象被称为表观遗传而言，这种现象被称为表观遗传学（学（Epigenetics）。）。主要实验过程：主要实验过程：将待

50、测将待测DNA样品用限制性内切酶处理或超声波破碎样品用限制性内切酶处理或超声波破碎等物理方法打断成等物理方法打断成5001000 bp的碎片，的碎片，重亚硫酸盐处理使重亚硫酸盐处理使DNA中未甲基化的胞嘧啶脱氨基中未甲基化的胞嘧啶脱氨基变成尿嘧啶，变成尿嘧啶，PCR扩增后被测序仪读为胸腺嘧啶。扩增后被测序仪读为胸腺嘧啶。已甲基化的胞嘧啶由于甲基的保护而不受影响。已甲基化的胞嘧啶由于甲基的保护而不受影响。参考原始序列判定原参考原始序列判定原C位点是否甲基化位点是否甲基化未甲基未甲基化的化的C位点变为位点变为T，甲基化的，甲基化的C位点仍保持为位点仍保持为C。重亚硫酸盐重亚硫酸盐测序测序(bisu