蛋白质与其他物质的相互作用精选课件.ppt

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1、关于蛋白质与其他物质的相互作用第一页，本课件共有35页2蛋白质的简介蛋白质的简介在在生生物物体体内内，蛋蛋白白质质（包包括括酶酶）占占细细胞胞干干重重的的70%70%以以上上，种种类类繁繁多多，在在生生命命活活动动过过程程中中起起着着发发挥挥各各种种各各样样的的作作用用。随随着着人人们们对对环环境境保保护护和和生生活活质质量量要要求求的的提提高高，蛋蛋白白质质在在食食品品、医医药药（生生化化药药物物、临临床床检检验验、药药物物筛筛选选等等）、环环保保（环环境境分分析析）、农农业业、日日用用化化工工（化化妆妆品品）、精精细细化化工工（酶酶催催化化合合成成）等等领域的应用日益广泛。领域的应用日益广

2、泛。在蛋白质体外的应用中，一般涉及到分离纯化、储存、含量检测在蛋白质体外的应用中，一般涉及到分离纯化、储存、含量检测等过程，其中常常发生化学物质与蛋白质非专一性的相互作用，等过程，其中常常发生化学物质与蛋白质非专一性的相互作用，如沉淀作用、变性作用、稳定作用以及化学修饰作用等。如沉淀作用、变性作用、稳定作用以及化学修饰作用等。第二页，本课件共有35页3蛋白质与化学物质相互作用的原因蛋白质与化学物质相互作用的原因球状蛋白三级结构的主要特征：球状蛋白三级结构的主要特征：绝大多致的蛋白质折叠成为近乎球状的结构。球状蛋白质一旦绝大多致的蛋白质折叠成为近乎球状的结构。球状蛋白质一旦具有三级结构后，蛋白质

3、内部变得更为紧密，内部的空间约有具有三级结构后，蛋白质内部变得更为紧密，内部的空间约有7575被原子所充满。这样的密集程度远远超过在液体中的小被原子所充满。这样的密集程度远远超过在液体中的小分子，可以与一些晶体的情况相比。分子，可以与一些晶体的情况相比。可以认为蛋白质是带有极性外套的油滴，也就是可以认为蛋白质是带有极性外套的油滴，也就是“非极性在内，非极性在内，极性在外极性在外”。大量蛋白质的。大量蛋白质的X X射线晶体衍射分析统计的结果充射线晶体衍射分析统计的结果充分证明了这一规律。分证明了这一规律。第三页，本课件共有35页4存在于蛋白质内部主要是一些非极性残基的侧链，约有存在于蛋白质内部主

4、要是一些非极性残基的侧链，约有6363是丙是丙氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、有氨酸、缬氨酸和苯丙氨酸等；氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、有氨酸、缬氨酸和苯丙氨酸等；带电的残基，天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸和精氨酸只有带电的残基，天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸和精氨酸只有4 4。约约9595的带电的侧链是分布在蛋白质的表面；约的带电的侧链是分布在蛋白质的表面；约1414的亮氨酸、的亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸和苯丙氨酸在蛋白质分子表面。异亮氨酸、缬氨酸和苯丙氨酸在蛋白质分子表面。在蛋白质的内部也存在极少量的亲水残基，在蛋白质分子的在蛋白质的内部也存在极少量的亲水残基，在蛋白质分子的表面也常见到一些疏水的残基。这些表面也常见

5、到一些疏水的残基。这些“异常异常”分布的残基，分布的残基，致使肽链的局部结构发生致使肽链的局部结构发生“扭曲扭曲”，一些键的张角与一般正，一些键的张角与一般正常的值有所偏离，蛋白质中这些局部的构象具有相对偏高的常的值有所偏离，蛋白质中这些局部的构象具有相对偏高的能量，相对地处于较不稳定的状态，在外界很小的扰动作用能量，相对地处于较不稳定的状态，在外界很小的扰动作用下，就能发生变化。下，就能发生变化。第四页，本课件共有35页5原则上，一些相对规则的原则上，一些相对规则的-螺旋和螺旋和-折叠分布在球状蛋白的折叠分布在球状蛋白的内部，而且压积得很紧密，致使球状蛋白成为致密的结构；内部，而且压积得很紧

6、密，致使球状蛋白成为致密的结构；那些连接那些连接-螺旋和螺旋和-折叠叠的规整性相对差一些的二级结折叠叠的规整性相对差一些的二级结构，转角和环状以及特定的构，转角和环状以及特定的“无规无规”卷曲，则更多地是分卷曲，则更多地是分布在球状蛋白的外周。布在球状蛋白的外周。还值得指出的是，在很多蛋白质分子的内部还存在着数量还值得指出的是，在很多蛋白质分子的内部还存在着数量不同的水分子，这些水分子也和一些极性的基因或负电性不同的水分子，这些水分子也和一些极性的基因或负电性的原子形成氢键。其中一些水分子也参与了蛋白质功能的的原子形成氢键。其中一些水分子也参与了蛋白质功能的行使。行使。第五页，本课件共有35页

7、6球状蛋白的表面并不是非常光滑的，而是具有很多沟渠，多数球球状蛋白的表面并不是非常光滑的，而是具有很多沟渠，多数球状蛋白的可及表面的面积约为同样大小的球的表面积的两倍。状蛋白的可及表面的面积约为同样大小的球的表面积的两倍。球状蛋白质分子的立体结构具右高度特异性和高度灵敏性。每种球状蛋白质分子的立体结构具右高度特异性和高度灵敏性。每种蛋白质分子都有特定的高级结构。这种构象的特异性，使它区别蛋白质分子都有特定的高级结构。这种构象的特异性，使它区别于其他蛋白质；但这种高度特异的结构，并非固定不变，在执行于其他蛋白质；但这种高度特异的结构，并非固定不变，在执行生物学功能时，常常发生一系列的构象变化，表

8、现出高度灵敏性。生物学功能时，常常发生一系列的构象变化，表现出高度灵敏性。第六页，本课件共有35页7在生物体内，这些构象变化，往往是该蛋白质分子与配基在生物体内，这些构象变化，往往是该蛋白质分子与配基相互作用引起的，配基包括酶的小分子底物、受体的小分相互作用引起的，配基包括酶的小分子底物、受体的小分子激素和神经介质、血红蛋白的子激素和神经介质、血红蛋白的O O2 2等。因此，生物体内的蛋等。因此，生物体内的蛋白质是处于一种可以相互转变的多种构象的平衡态白质是处于一种可以相互转变的多种构象的平衡态.球状蛋白质分子表面并不是光滑的，经常会出现一些球状蛋白质分子表面并不是光滑的，经常会出现一些“裂隙

9、裂隙”或或“洞穴洞穴”，在，在“裂隙裂隙”或或“洞穴洞穴的周围常常是疏水性的：的周围常常是疏水性的：这些这些“裂隙裂隙”或或“洞穴洞穴”可能是蛋白质可能是蛋白质(酶酶)的活性部位所在。的活性部位所在。第七页，本课件共有35页硫氧还蛋白的结构硫氧还蛋白的结构紧密结合水紧密结合水亲水性残基亲水性残基疏水性残基疏水性残基第八页，本课件共有35页9蛋白质与化学物质的相互作用蛋白质与化学物质的相互作用1、沉淀作用沉淀作用2 2、变性作用、变性作用3 3、稳定作用、稳定作用4 4、化学修饰作用。、化学修饰作用。第九页，本课件共有35页10化学物质对蛋白质的沉淀作用化学物质对蛋白质的沉淀作用由于蛋白质的分子

10、量很大，它在水中能够形成胶体溶液。由于蛋白质的分子量很大，它在水中能够形成胶体溶液。根根据据蛋蛋白白质质的的亲亲水水胶胶体体性性质质，当当其其环环境境发发生生改改变变时时，蛋蛋白白质质会会发生沉淀作用。发生沉淀作用。蛋白质胶体溶液的稳定性与它的分子量大小、所带的电荷和水蛋白质胶体溶液的稳定性与它的分子量大小、所带的电荷和水化作用有关。改变溶液的条件，将影响蛋白质的溶解性质。在化作用有关。改变溶液的条件，将影响蛋白质的溶解性质。在适当的条件下，蛋白质能够从溶液中沉淀出来。适当的条件下，蛋白质能够从溶液中沉淀出来。第十页，本课件共有35页沉沉淀淀作作用用的的类类型型可逆沉淀可逆沉淀不可逆沉淀不可逆

11、沉淀抗体抗体-抗原沉淀抗原沉淀在温和条件下，通过改变溶液的在温和条件下，通过改变溶液的pHpH或电荷状况，使蛋白质从胶体溶液或电荷状况，使蛋白质从胶体溶液中沉淀分离。蛋白质在沉淀过程中中沉淀分离。蛋白质在沉淀过程中结构和性质都没有发生变化，在适结构和性质都没有发生变化，在适当的条件下，可以重新溶解形成溶当的条件下，可以重新溶解形成溶液，又称为非变性沉淀。液，又称为非变性沉淀。在强烈沉淀条件下，不仅破坏了蛋在强烈沉淀条件下，不仅破坏了蛋白质胶体溶液的稳定性，而且也破白质胶体溶液的稳定性，而且也破坏了蛋白质的结构和性质，产生的坏了蛋白质的结构和性质，产生的蛋白质沉淀不可能再重新溶解于水蛋白质沉淀不

12、可能再重新溶解于水由于沉淀过程发生了蛋白质的结构由于沉淀过程发生了蛋白质的结构和性质的变化，又称为变性沉淀。和性质的变化，又称为变性沉淀。抗体和抗原蛋白通过相互识别抗体和抗原蛋白通过相互识别和结合而发生的沉淀现象。这和结合而发生的沉淀现象。这种特殊的沉淀作用是生物体免种特殊的沉淀作用是生物体免疫功能的基础疫功能的基础。第十一页，本课件共有35页12沉淀作用主要包括盐析、金属离子沉淀、等电点沉淀、有机物沉沉淀作用主要包括盐析、金属离子沉淀、等电点沉淀、有机物沉淀、聚合物沉淀等。淀、聚合物沉淀等。1 1、盐析：当向蛋白质溶液中加入无机盐到一定程度时，、盐析：当向蛋白质溶液中加入无机盐到一定程度时，

13、蛋白质的溶解度减小，称为无机物沉淀。这是由于电解质蛋白质的溶解度减小，称为无机物沉淀。这是由于电解质的离子在水中发生水化，当电解质的浓度增加时，水分子的离子在水中发生水化，当电解质的浓度增加时，水分子就离开蛋白质的周围，暴露出疏水区域，疏水区域间的相就离开蛋白质的周围，暴露出疏水区域，疏水区域间的相互作用，使蛋白质聚集而沉淀，疏水区域越多，就越易产互作用，使蛋白质聚集而沉淀，疏水区域越多，就越易产生沉淀。生沉淀。通常情况下含高价阴离子的盐，效果比低价的盐好，但高价通常情况下含高价阴离子的盐，效果比低价的盐好，但高价阳离子的效果不如低价阳离子。阳离子的效果不如低价阳离子。最常用的盐析剂是硫酸铵、

14、硫酸钠、磷酸钾或磷酸钠。最常用的盐析剂是硫酸铵、硫酸钠、磷酸钾或磷酸钠。第十二页，本课件共有35页132 2、金属离子沉淀、金属离子沉淀一些高价金属离子对沉淀蛋白质很有效。它们可以分为三类：一些高价金属离子对沉淀蛋白质很有效。它们可以分为三类：第一类为第一类为MnMn2+2+，FeFe2+2+，CoCo2+2+，NiNi2+2+，CuCu2+2+，ZnZn2+2+和和CdCd2+2+能和蛋白质能和蛋白质分子表面的羧基，氨基、咪唑基、胍基等侧链结合。分子表面的羧基，氨基、咪唑基、胍基等侧链结合。第二类为第二类为CaCa2+2+，BaBa2+2+，MgMg2+2+和和PbPb2+2+能和蛋白质分子

15、表面的羧基能和蛋白质分子表面的羧基结合，但不和含氮化合物相结合。结合，但不和含氮化合物相结合。第三类为第三类为AgAg+，HgHg2+2+和和PbPb2+2+能和蛋白质分子表面的巯基相结合。能和蛋白质分子表面的巯基相结合。第十三页，本课件共有35页14金属离子沉淀法的优点是它们在稀溶液中对蛋白质有效强的沉金属离子沉淀法的优点是它们在稀溶液中对蛋白质有效强的沉淀能力。处理后残余的金属离子可用离子交换树脂或螯合剂除淀能力。处理后残余的金属离子可用离子交换树脂或螯合剂除去。去。在这些离子中，应用较广的是在这些离子中，应用较广的是Zn2+，Ca2+，Mg2+，Ba2+和和Mn2+，而，而Cu2+，Fe

16、2+，Pb2+，Hg2+等较少应用，因为它们会使产品等较少应用，因为它们会使产品损失和引起污染。如损失和引起污染。如ZnZn2+2+可用于沉淀杆菌肽可用于沉淀杆菌肽(作用于第作用于第4 4个组个组氨酸残基上氨酸残基上)和胰岛素；和胰岛素；CaCa2+2+(CaCO(CaCO3 3)用于分离乳酸，血清清用于分离乳酸，血清清蛋白等。蛋白等。第十四页，本课件共有35页3 3、等电点沉淀、等电点沉淀蛋白质与多肽一样，能够发生两性离解，也有等电点。在等电蛋白质与多肽一样，能够发生两性离解，也有等电点。在等电点时，蛋白质的溶解度最小，在电场中不移动。点时，蛋白质的溶解度最小，在电场中不移动。等电点沉淀法的

17、一个主要优点是很多蛋白质的等电点都在偏等电点沉淀法的一个主要优点是很多蛋白质的等电点都在偏酸性范围内，而无机酸通常价较廉，并且某些酸，如磷酸、酸性范围内，而无机酸通常价较廉，并且某些酸，如磷酸、盐酸和硫酸的应用能为蛋白质类食品所允许。同时，常可直盐酸和硫酸的应用能为蛋白质类食品所允许。同时，常可直接进行其他纯化操作，无需将残余的酸除去。接进行其他纯化操作，无需将残余的酸除去。等电点沉淀法的最主要缺点是酸化时，易使蛋白质失活，这等电点沉淀法的最主要缺点是酸化时，易使蛋白质失活，这是由于蛋白质对低是由于蛋白质对低pHpH比较敏感。比较敏感。第十五页，本课件共有35页pHpH对对-乳球蛋白溶解度的影

18、响乳球蛋白溶解度的影响 第十六页，本课件共有35页4 4、有机物沉淀、有机物沉淀有机溶剂：当有机溶剂浓度增大时，水对蛋白质分子表面有机溶剂：当有机溶剂浓度增大时，水对蛋白质分子表面上荷电基团或亲水基团的水化程度降低，或者说溶剂的介上荷电基团或亲水基团的水化程度降低，或者说溶剂的介电常数降低，因而静电吸力增大。电常数降低，因而静电吸力增大。在疏水区域附近近有序排列的水分子可以为有机溶剂所取在疏水区域附近近有序排列的水分子可以为有机溶剂所取代，使这些区域的溶解性增大。导致蛋白质分子聚集而沉代，使这些区域的溶解性增大。导致蛋白质分子聚集而沉淀。淀。一般所选择的溶剂必须能和水互溶，而和蛋白质不发生化学

19、一般所选择的溶剂必须能和水互溶，而和蛋白质不发生化学反应，最常用的溶剂是乙醇和丙酮。当蛋白质的溶液反应，最常用的溶剂是乙醇和丙酮。当蛋白质的溶液pHpH接近接近等电点时，引起沉淀所需加入有机溶剂的量较少。等电点时，引起沉淀所需加入有机溶剂的量较少。第十七页，本课件共有35页酚类化合物及有机酸沉淀：酚类化合物及有机酸沉淀：当蛋白质溶液当蛋白质溶液pHpH小于其等电点小于其等电点时，蛋白质颗粒带有正电荷，容易与酚类化合物或有机酸时，蛋白质颗粒带有正电荷，容易与酚类化合物或有机酸酸根所带的负电荷发生作用生成不溶性盐而沉淀。酸根所带的负电荷发生作用生成不溶性盐而沉淀。这类化合物包括鞣酸（又称单宁）、苦

20、味酸（即这类化合物包括鞣酸（又称单宁）、苦味酸（即2,4,6-2,4,6-三三硝基苯酚）、三氯乙酸、磺酰水杨酸等。硝基苯酚）、三氯乙酸、磺酰水杨酸等。单宁是一种多酚类化合物的寡聚体，它们的酚羟基可以解单宁是一种多酚类化合物的寡聚体，它们的酚羟基可以解离而带有负电荷，而且分子中的苯环、多个羟基可以与蛋离而带有负电荷，而且分子中的苯环、多个羟基可以与蛋白质发生非共价相互作用，结合在蛋白质的表面，然后在白质发生非共价相互作用，结合在蛋白质的表面，然后在蛋白质分子之间形成多点交连而成网络结构，最终导致聚蛋白质分子之间形成多点交连而成网络结构，最终导致聚集而沉淀集而沉淀 第十八页，本课件共有35页5 5

21、、聚合物沉淀、聚合物沉淀 非离子型聚合物沉淀法：非离子型聚合物沉淀法：非离子型聚合物沉淀法：非离子型聚合物沉淀法：许多非离子型聚合物，包括聚乙二许多非离子型聚合物，包括聚乙二醇（醇（PEGPEG）可用来进行选择性沉淀以纯化蛋白质。聚合物的作）可用来进行选择性沉淀以纯化蛋白质。聚合物的作用认为与有机溶剂相似，能降低水化度，使蛋白质沉淀。此现用认为与有机溶剂相似，能降低水化度，使蛋白质沉淀。此现象和双水相的形成有联系。因为无毒，不可燃性且对大多数蛋象和双水相的形成有联系。因为无毒，不可燃性且对大多数蛋白质有保护作用而被广泛使用。白质有保护作用而被广泛使用。聚电解质沉淀法：聚电解质沉淀法：聚电解质沉

22、淀法：聚电解质沉淀法：有一些离子型多糖化合物可应用于沉淀食品有一些离子型多糖化合物可应用于沉淀食品蛋白质。如羧甲基纤维素，海藻酸盐，果胶酸盐和卡拉胶等。蛋白质。如羧甲基纤维素，海藻酸盐，果胶酸盐和卡拉胶等。它们的作用主要是静电引力。如羧甲基纤维素能在它们的作用主要是静电引力。如羧甲基纤维素能在pHpH值低于值低于等电点时使蛋白质沉淀。但加入量不能太多，否则会引起胶溶作等电点时使蛋白质沉淀。但加入量不能太多，否则会引起胶溶作用而重新溶解。用而重新溶解。第十九页，本课件共有35页化学物质对蛋白质的稳定作用化学物质对蛋白质的稳定作用 许多蛋白质在一般缓冲溶液中的稳定性相当低，某些酶蛋许多蛋白质在一般

23、缓冲溶液中的稳定性相当低，某些酶蛋白溶液在白溶液在37C37C 放置的半衰期仅几个小时。放置的半衰期仅几个小时。这种稳定性降低的原因常常是某些物理或化学因素破坏了这种稳定性降低的原因常常是某些物理或化学因素破坏了维持蛋白质结构的天然状态，引起蛋白质理化性质改变并维持蛋白质结构的天然状态，引起蛋白质理化性质改变并导致其生理活性丧失，这种现象称为蛋白质的变性。导致其生理活性丧失，这种现象称为蛋白质的变性。第二十页，本课件共有35页211 1、强酸和强碱、强酸和强碱强的无机酸碱及有机酸碱都可以改变蛋白质溶液的强的无机酸碱及有机酸碱都可以改变蛋白质溶液的pHpH，引，引起蛋白质表面必需基团的电离，由于

24、各氨基酸残基所带电起蛋白质表面必需基团的电离，由于各氨基酸残基所带电荷的相互吸引或排斥使蛋白质的空间结构发生较大变化，荷的相互吸引或排斥使蛋白质的空间结构发生较大变化，造成蛋白质分子聚集，导致不可逆失活。造成蛋白质分子聚集，导致不可逆失活。另外，在强酸、强碱条件下，肽键也容易被水解断裂，天冬另外，在强酸、强碱条件下，肽键也容易被水解断裂，天冬酰胺和谷酰胺侧链的酰胺会发生脱氨作用，改变了原来蛋白酰胺和谷酰胺侧链的酰胺会发生脱氨作用，改变了原来蛋白质表面的电荷分布，使蛋白质构象重新排布，结果导致蛋白质表面的电荷分布，使蛋白质构象重新排布，结果导致蛋白质失去活性。质失去活性。第二十一页，本课件共有3

25、5页222 2、氧化剂、氧化剂各种氧化剂能够氧化芳香族侧链的氨基酸以及甲硫氨酸、半胱各种氧化剂能够氧化芳香族侧链的氨基酸以及甲硫氨酸、半胱氨酸和胱氨酸残基。其中酪氨酸侧链的酚羟基可以被氧化成醌，氨酸和胱氨酸残基。其中酪氨酸侧链的酚羟基可以被氧化成醌，后者可以与蛋白质表面的巯基、氨基发生迈克尔加成反应形成后者可以与蛋白质表面的巯基、氨基发生迈克尔加成反应形成交联产物。在碱性条件下，半胱氨酸可以被交联产物。在碱性条件下，半胱氨酸可以被CuCu2+2+氧化成次磺酸氧化成次磺酸或亚磺酸或磺酸半胱氨酸。或亚磺酸或磺酸半胱氨酸。分子氧、分子氧、H H2 2O O2 2以及过氧化物（如过氧甲酸）、氧自由基等

26、以及过氧化物（如过氧甲酸）、氧自由基等是最常见的氧化剂，在生物体内，蛋白质的氧化失活主要是最常见的氧化剂，在生物体内，蛋白质的氧化失活主要是通过活性氧（羟基自由基、超氧离子、过氧化氢、过氧是通过活性氧（羟基自由基、超氧离子、过氧化氢、过氧化物）来完成的。这些氧化剂的杀菌作用主要也是造成蛋化物）来完成的。这些氧化剂的杀菌作用主要也是造成蛋白质失活。白质失活。第二十二页，本课件共有35页233 3、去污剂和表面活性剂、去污剂和表面活性剂去污剂一般分为离子型和非离子型两大类，都具有长链疏水去污剂一般分为离子型和非离子型两大类，都具有长链疏水尾和亲水的极性头。当少量的阴离子去污剂（如十二烷基硫尾和亲水

27、的极性头。当少量的阴离子去污剂（如十二烷基硫酸钠，酸钠，SDS SDS）单体加入到蛋白质溶液中时，去污剂与蛋白质表面）单体加入到蛋白质溶液中时，去污剂与蛋白质表面的疏水区域结合，随着加入量增加，与蛋白质的结合位点达到饱的疏水区域结合，随着加入量增加，与蛋白质的结合位点达到饱和，这时去污剂则以协同方式结合于蛋白质其它位点，导致蛋白和，这时去污剂则以协同方式结合于蛋白质其它位点，导致蛋白质伸展，分子内部的疏水性氨基酸残基暴露，并进一步与去污剂质伸展，分子内部的疏水性氨基酸残基暴露，并进一步与去污剂结合，直到达到饱和为止，从而使蛋白质发生不可逆变性。结合，直到达到饱和为止，从而使蛋白质发生不可逆变性

28、。第二十三页，本课件共有35页244 4、变性剂、变性剂高浓度脲（高浓度脲（8-10mol/L8-10mol/L）和盐酸胍（）和盐酸胍（6 mol/L6 mol/L）常常用于蛋白质）常常用于蛋白质变性和复性研究，由于脲或盐酸胍与蛋白质多肽链作用，破坏了变性和复性研究，由于脲或盐酸胍与蛋白质多肽链作用，破坏了蛋白质分子内维持其二级结构和高级结构的氢键，引起蛋白质不蛋白质分子内维持其二级结构和高级结构的氢键，引起蛋白质不可逆失活。可逆失活。有机溶剂有机溶剂:水互溶有机溶剂可以使酶、蛋白质失去活性，是水互溶有机溶剂可以使酶、蛋白质失去活性，是因为有机溶剂取代了蛋白质表面的结合水，并通过疏水作用因为有

29、机溶剂取代了蛋白质表面的结合水，并通过疏水作用与蛋白质结合，改变了溶液的介电常数，从而影响维持蛋白与蛋白质结合，改变了溶液的介电常数，从而影响维持蛋白质天然构象的非共价力的平衡质天然构象的非共价力的平衡 螯合剂螯合剂结合金属离子的试剂，如结合金属离子的试剂，如EDTAEDTA等可以使金属酶、金属蛋白失活，等可以使金属酶、金属蛋白失活，这是因为这是因为EDTAEDTA与金属离子形成配位复合物，从而使酶失去金属与金属离子形成配位复合物，从而使酶失去金属辅助因子造成的。螯合剂可以螯合对蛋白质有害的金属离子，辅助因子造成的。螯合剂可以螯合对蛋白质有害的金属离子，使那些不需要金属离子的蛋白质稳定。使那些

30、不需要金属离子的蛋白质稳定。第二十四页，本课件共有35页蛋白质不可逆失活的化学因素蛋白质不可逆失活的化学因素 强酸和强碱强酸和强碱 强的酸碱可强的酸碱可以改变蛋白以改变蛋白质溶液的质溶液的pHpH引起蛋白质引起蛋白质表面必需基表面必需基团的电离，团的电离，使蛋白质的使蛋白质的空间结构发空间结构发生变化，造生变化，造成蛋白质分成蛋白质分子聚集，导子聚集，导致变性。致变性。氧化剂氧化剂 氧化剂甲硫氧化剂甲硫氨酸、半胱氨酸、半胱氨酸和胱氨氨酸和胱氨酸残基。酪酸残基。酪氨酸侧链的氨酸侧链的酚羟基可以酚羟基可以被氧化成醌被氧化成醌再与巯基、再与巯基、氨基发生迈氨基发生迈克尔加成反克尔加成反应形成交联应形

31、成交联产物。产物。表面活性剂表面活性剂变性剂变性剂 重金属离子重金属离子去污剂与蛋去污剂与蛋白质表面的白质表面的疏水区域结疏水区域结合，导致蛋合，导致蛋白质伸展，白质伸展，分子内部的分子内部的疏水性氨基疏水性氨基酸残基暴露酸残基暴露从而使蛋白从而使蛋白质发生不可质发生不可逆变性。逆变性。脲或盐酸胍脲或盐酸胍与蛋白质多与蛋白质多肽链作用，肽链作用，破坏了蛋白破坏了蛋白质分子内维质分子内维持其二级结持其二级结构和高级结构和高级结构的氢键。构的氢键。有机溶剂也有机溶剂也会引起蛋白会引起蛋白质变性失活质变性失活Hg2+Hg2+、Cd2+Cd2+、Pb2+Pb2+能与蛋能与蛋白质分子中白质分子中的半胱氨

32、酸的半胱氨酸的巯基、组的巯基、组氨酸的咪唑氨酸的咪唑基以及色氨基以及色氨酸的吲哚基酸的吲哚基反应，使蛋反应，使蛋白质不可逆白质不可逆沉淀而变性沉淀而变性失活。失活。第二十五页，本课件共有35页26化学物质对蛋白质的稳定作用化学物质对蛋白质的稳定作用在蛋白质（酶）分离、纯化、储藏和应用中，可以通过化学方在蛋白质（酶）分离、纯化、储藏和应用中，可以通过化学方法使蛋白质稳定。其中常用的方法有以下几种：法使蛋白质稳定。其中常用的方法有以下几种：固定化：将酶或蛋白质多点连接于载体上（无机载体、高分固定化：将酶或蛋白质多点连接于载体上（无机载体、高分子载体）；子载体）；添加剂：保护蛋白质（酶）不受氧化剂氧

33、化、不受变性剂变性等添加剂：保护蛋白质（酶）不受氧化剂氧化、不受变性剂变性等化学修饰：共价交联，使蛋白质构象固化。化学修饰：共价交联，使蛋白质构象固化。第二十六页，本课件共有35页稳定剂稳定剂共溶剂共溶剂 糖类，醇糖类，醇氨基酸及氨基酸及其衍生物其衍生物无机盐，无机盐，甘油，聚甘油，聚乙二醇等乙二醇等常用常用1-4M1-4M浓度共溶浓度共溶剂来稳定剂来稳定蛋白质和蛋白质和细胞器。细胞器。抗氧化剂抗氧化剂 底物、辅酶底物、辅酶金属离子金属离子 化学交联剂化学交联剂半胱氨酸，半胱氨酸，2-2-巯基乙醇巯基乙醇还原谷胱甘还原谷胱甘肽，二巯基肽，二巯基赤藓醇等巯赤藓醇等巯基试剂可防基试剂可防止巯基氧化

34、止巯基氧化植物抗氧化植物抗氧化剂如儿茶酚剂如儿茶酚黄酮等也具黄酮等也具有保护作用有保护作用酶可被底酶可被底物辅酶、物辅酶、竞争性抑竞争性抑制剂及反制剂及反应产物等应产物等所稳定。所稳定。金属离子不金属离子不仅可以影响仅可以影响酶的活性，酶的活性，还可以影响还可以影响酶的稳定性酶的稳定性如如Ca2+Ca2+多位多位点结合使得点结合使得蛋白质分子蛋白质分子成为紧密的成为紧密的活性形式。活性形式。交联剂可在交联剂可在相隔较近的相隔较近的两个氨基酸两个氨基酸残基之间，残基之间，或蛋白质与或蛋白质与其他分子之其他分子之间（如固定间（如固定化载体）发化载体）发生交联反应生交联反应使蛋白质的使蛋白质的构象稳

35、定。构象稳定。第二十七页，本课件共有35页化学物质的共价修饰作用化学物质的共价修饰作用 化学物质与生物大分子的共价作用常常涉及到物质的生理活化学物质与生物大分子的共价作用常常涉及到物质的生理活性（包括药理、毒理等），如何判断化合物与蛋白质分子中性（包括药理、毒理等），如何判断化合物与蛋白质分子中的哪类基团作用，在体外主要用化合修饰的方法。的哪类基团作用，在体外主要用化合修饰的方法。该方法是研究蛋白质结构与功能的一种重要的基础手该方法是研究蛋白质结构与功能的一种重要的基础手段。段。第二十八页，本课件共有35页生物体内蛋白质加合物的形成：生物体内蛋白质加合物的形成：当外源化合物的活性代谢当外源化合

36、物的活性代谢产物与细胞内重要生物大分子，如核酸、蛋白质、脂质等产物与细胞内重要生物大分子，如核酸、蛋白质、脂质等共价结合，发生烷基化或芳基化，即导致共价结合，发生烷基化或芳基化，即导致DNADNA损伤、蛋白质损伤、蛋白质正常功能丧失，乃至细胞的损伤或死亡、外源化合物与生物大正常功能丧失，乃至细胞的损伤或死亡、外源化合物与生物大分子相互作用主要有两种方式：非共价结合和共价结合。分子相互作用主要有两种方式：非共价结合和共价结合。可与蛋白质发生反应的化合物：可与蛋白质发生反应的化合物：绝大多数外源化合物需经绝大多数外源化合物需经体内代谢活化，转变成亲电子的活性代谢物，再与细胞内体内代谢活化，转变成亲

37、电子的活性代谢物，再与细胞内生物大分子中的亲核部位和基团发生共价结合，例如蛋白生物大分子中的亲核部位和基团发生共价结合，例如蛋白质分子中的亲核基团、质分子中的亲核基团、DNADNA、RNARNA及一些小分子物质如谷胱及一些小分子物质如谷胱甘肽等的亲核部位等。甘肽等的亲核部位等。第二十九页，本课件共有35页30蛋白质分子中的可反应基团：蛋白质分子中的可反应基团：致癌物分子量的大小不同，反应致癌物分子量的大小不同，反应是不同的，分子量较小的，如乙烯、丙烷和苯乙烯的氧化物、是不同的，分子量较小的，如乙烯、丙烷和苯乙烯的氧化物、尿烷和氯乙烯的环氧化物、丙烯酰胺等，与蛋白质作用时，所尿烷和氯乙烯的环氧化

38、物、丙烯酰胺等，与蛋白质作用时，所形成的加合物依赖于外源化合物与各种氨基酸反应的相对速率。形成的加合物依赖于外源化合物与各种氨基酸反应的相对速率。氨基酸残基侧链基团的修饰氨基酸残基侧链基团的修饰：蛋白质侧链基团的修饰是通过蛋白质侧链基团的修饰是通过选择性的试剂或亲和标记试剂与蛋白质分子侧链上特定的功选择性的试剂或亲和标记试剂与蛋白质分子侧链上特定的功能基团发生化合反应而实现的。其中的一个重要作用是用来能基团发生化合反应而实现的。其中的一个重要作用是用来探测活性部位的结构。探测活性部位的结构。第三十页，本课件共有35页 蛋白质光谱探针蛋白质光谱探针 所谓蛋白质光谱探针，就是能与蛋白质发生相互作用

39、的无所谓蛋白质光谱探针，就是能与蛋白质发生相互作用的无机离子、有机小分子或络合物，这些物质与蛋白质结合生机离子、有机小分子或络合物，这些物质与蛋白质结合生成超分子复合物之后，体系的光谱性质发生变化，从而可成超分子复合物之后，体系的光谱性质发生变化，从而可以提供蛋白质浓度或结构方面的信息。以提供蛋白质浓度或结构方面的信息。第三十一页，本课件共有35页蛋蛋白白质质吸吸光光探探针针金金属属探探针针双缩脲在碱性溶液中与双缩脲在碱性溶液中与 CuCu2+2+生成紫生成紫红色化合物的反应。肽和蛋白质化红色化合物的反应。肽和蛋白质化合物都有双缩脲反应，生成紫红色合物都有双缩脲反应，生成紫红色化合物，在化合物

40、，在540nm540nm具有光吸收具有光吸收。双缩脲法双缩脲法Folin-Folin-LowryLowry法法 将双缩脲试剂和将双缩脲试剂和FolinFolin酚试剂酚试剂(磷钼磷钼酸盐磷钨酸盐）结合使用，在蛋白酸盐磷钨酸盐）结合使用，在蛋白质发生双缩脲反应之后，再和质发生双缩脲反应之后，再和FolinFolin酚试剂反应，此试剂在碱性条件下酚试剂反应，此试剂在碱性条件下被蛋白质中酪氨酸的酚基还原，生被蛋白质中酪氨酸的酚基还原，生成颜色更深的化合物，在成颜色更深的化合物，在640nm640nm具具有光吸收，可测定有光吸收，可测定25-250ug25-250ug蛋白质。蛋白质。双辛可双辛可宁酸法

41、宁酸法 在碱性条件下，肽键与铜离子反应生在碱性条件下，肽键与铜离子反应生成成Cu(I),Cu(I)Cu(I),Cu(I)再与再与BCABCA反应形成紫反应形成紫色络合物，在色络合物，在565nm565nm测量吸光度。二测量吸光度。二喹啉甲酸（又称双辛可宁酸法的试剂喹啉甲酸（又称双辛可宁酸法的试剂比比Folin-LowryFolin-Lowry法的试剂稳定法的试剂稳定,干扰少。干扰少。第三十二页，本课件共有35页染染料料探探针针染料探针是染料探针是蛋白质分析蛋白质分析中种类最多中种类最多应用最广的应用最广的一类探针，一类探针，该法是利用该法是利用蛋白质与染蛋白质与染料结合成沉料结合成沉淀或改变结

42、淀或改变结合染料的光合染料的光吸收特性，吸收特性，借助染料颜借助染料颜色的减退或色的减退或变化的程度变化的程度来测定蛋白来测定蛋白质的含量。质的含量。溴酚蓝溴酚蓝 是一种研究性能优良的探是一种研究性能优良的探针试剂，该试剂颜色对比针试剂，该试剂颜色对比度为度为160nm,160nm,反应在反应在pH3.2pH3.2左右进行，在左右进行，在600nm600nm测量测量吸光度。吸光度。考马斯考马斯亮蓝亮蓝 在酸性条件下，染料考马斯在酸性条件下，染料考马斯亮兰亮兰G-250 G-250 与蛋白质结合后与蛋白质结合后其吸收峰从其吸收峰从465465移至移至595nm595nm处，而颜色也由棕黄色转为处

43、，而颜色也由棕黄色转为深兰色。蛋白质与染料生成深兰色。蛋白质与染料生成复合物颜色的深浅与其浓度复合物颜色的深浅与其浓度成比例关系。该方法使用方成比例关系。该方法使用方便，反应时间短，染色稳定便，反应时间短，染色稳定成为灵敏度最高的染料探针成为灵敏度最高的染料探针分析方法。分析方法。第三十三页，本课件共有35页荧光探针的条件荧光探针的条件（1 1）探针分子与蛋白质分子的某一微区必需有特异性的）探针分子与蛋白质分子的某一微区必需有特异性的结合，并且结合比较牢固；结合，并且结合比较牢固；（2 2）探针的荧光必须对环境条件敏感；）探针的荧光必须对环境条件敏感；（3 3）蛋蛋白白质质分分子子与与探探针针结结合合后后不不影影响响其其原原来来的的结结构构和特性。和特性。在在满满足足这这些些条条件件的的基基础础上上可可进进行行蛋蛋白白质质的的测测定定及及与与金金属属离离子结合的计量化学等。子结合的计量化学等。常常用用的的蛋蛋白白质质荧荧光光探探针针有有：1-1-苯苯胺胺基基-8-8-萘萘磺磺酸酸 (ANS)(ANS)、2-2-对对甲甲苯苯胺胺基基萘萘-6-6-磺磺酸酸 (TNS)(TNS)、1-(N-1-(N-二二甲甲胺胺)萘萘-5-5-磺磺酸酸 (DNS)(DNS)和荧光胺等。和荧光胺等。第三十四页，本课件共有35页感感谢谢大大家家观观看看第三十五页，本课件共有35页