家畜育种新技术.ppt

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1、第六篇 家畜育种新技术（生物技术在动物育种中的应用）一、生物技术的概念生物技术（Biotechnology）其英语的本意是“生物工艺学”，一些论著又将其译为“生物工程”，其定义至今没有一个十分经典的表述，常见的表述有两种：从微观上认识和控制生物遗传与繁殖过程的技术。在探索生物所具有的多种多样功能的同时，用工程设计的方式把这些功能应用于各个领域、或人工摸拟再现生物功能，为人类提供产品或服务的新兴技术。l生物技术是以生命科学研究成就为基础的综合性技术，是从微观上认识和控制生物的遗传物质和遗传过程，了解生命的全貌，其目的是要解决人类社会中的人口、粮食、肉蛋奶、环境能源医疗等各种具体问题。二、生物技术

2、应用的目的三、生物技术的主要组成部分三、生物技术的主要组成部分基因工程技术技术细胞工程技术细胞工程技术 酶工程技术酶工程技术发酵工程技术发酵工程技术四、在家畜育种中应用的生物技术四、在家畜育种中应用的生物技术u细胞工程技术u细胞遗传学技术u动物繁殖学技术u基因工程技术u分子遗传学技术（主要涉及基因组分析技术、DNA诊断技术、转基因技术等）u分子数量遗传学技术染色体及染色体片段移植与重组染色体组型与单个染色体的鉴别细胞遗传学技术u动物繁殖学技术l人工授精l配子低温冷冻保存lX、Y精子分离l同期发情、超数排卵与分娩控制l卵母细胞的体外培养与体外授精l胚胎冷冻保存与胚胎移植l核移植与细胞克隆l嵌合体

3、的制备分 子 数 量 遗 传（molecular quantitative genetics）学。将分子生物技术和方法与数量遗传 学 相 结 合，研 究 数 量 性 状 基 因 座（Quantitative Traits Loci，QTL）定位与分子标 记 辅 助 选 择（Molecular Assistant Selection，MAS）的理论和方法。这一学科领域的发展，将给家畜育种带来一次新的飞跃。分子遗传学技术基因结构与功能的分析基因组分析基因诊断基因克隆与基因组文库的建立转基因技术基因在微生物中的表达转基因动物的制备生物反应器第十七章 细胞工程技术的应用人工授精技术配子低温冷冻保存技术

4、同期发情、超数排卵技术体外受精技术性别控制与胚胎性别鉴定技术克隆技术一、人工授精技术给家畜育种带来的效应通过人工授精，提高了优良种公畜的利用率，迅速扩大优良遗传特性和高产基因在群体中的影响。依靠人工授精，提高了种公畜的利用率，大大减少了种公畜的需要量，在相同的选择基础上，提高了种公畜的选择强度，加快了群体的遗传进展。从生产上讲，节约了成本。建立了AI育种体系（Aggregative Index Breeding System）在畜群中广泛应用人工授精技术，精液全部来自经遗传评定验证的种公畜；在育种群中实施大规模的、规范化的生产性能测定；通过“定向选配”，有计划地培育后备公畜；组织科学、严格的公

5、畜后裔测定，并应用先进的数据统计分析方法估计育种值，提高选种的精确性。AI育种体系在奶牛育种中取得的效果：在过去40余年中，美国、加拿大等奶牛生产发达国家，因坚持AI育种体系，全国奶牛群体数量减少了1/3，而总产奶量却稳中有升，说明奶牛的平均产奶量提高了30%以上。据1996年统计分析结果，我国北京市自1972年建立种公牛站开始全面推广冷冻精液人工授精以来，奶牛产奶量平均每年获得近50kg的遗传进展，在25年中奶牛平均单产净增2200kg。AI育种体系在猪育种中取得的效果：在上个世纪80年代末90年代初，AI育种体系开始在猪育种中应用，至今，猪的主要生产性能已有大幅度提高。瘦肉率可达65%以上

6、；70日龄以后的日增重最高可达2000g以上；料肉比可达2.51，接近鸡的饲料利用率。人工控制母畜发情，更准确地掌握母畜的繁殖生理周期，适时输精，大大提高了母畜受胎率。通过同期发情处理，便于实施遗传改良措施。如实施胚胎移植、冷冻精液的输精等，都有必要进行同期发情处理。超数排卵技术的应用，可提高母畜繁殖率。人工促进母畜性早熟，实现提前配种，可缩短世代间隔，加快遗传进展。产后人工催情，缩短母畜胎间距，提高种畜使用效率，从而提高育种效益。二、二、同期发情、超数排卵与分娩同期发情、超数排卵与分娩控制控制三、精液和胚胎的低温冷冻保存技术给家畜育种带来的效应低温冷冻保存精液技术，延长了优秀种公畜的使用年限

7、，拓宽了优良种畜的覆盖面，扩大了优秀种公畜在家畜遗传改良中的作用。冷冻精液的使用，使参加后裔鉴定的公畜与不同地区、不同群体的母畜交配，获得数量更多、分布更广的后代及其测定数据，从而提高对公畜遗传评估的准确性和精确度。利用精液长期冷冻保存技术，可更经济、可靠地实现家畜品种资源的保护。胚胎的冷冻保存：1、胚胎的质量和收集时间的控制2、快速冷冻方法的摸索3、抗冻剂的应用。1973年，世界上第一头冷冻胚胎移植的牛诞生。利用胚胎冷冻保存技术，有效地保存家畜品种资源。冷冻胚胎的进出口，消除了家畜品种之间的地理隔离，促进优良种畜的基因交流，加速育种进程。冷冻胚胎的传递，可获得正常情况下难以得到的育种材料。卵

8、母细胞采集卵母细胞采集卵母细胞卵母细胞体外成熟体外成熟精液预精液预处理处理体外受精体外受精胚胎体外培养与胚胎移植胚胎体外培养与胚胎移植迄今，体外受精在各主要技术环节上的效率还不够高，总体技术水平还未达到应用的要求，胚胎工程学家们正在探索新的技术途径，如供体的活体取卵技术、腔前期或小腔期卵细胞的体外培养技术等。因此，体外受精技术的全面应用尚需一段时间。但仍可预测该技术在家畜育种和生产中广阔的应用前景。四、体外受精（在牛和羊的胚胎生产中得到四、体外受精（在牛和羊的胚胎生产中得到部分应用）部分应用）（一）技术步骤：大幅度降低胚胎的生产成本，若与超排技术相结合，可生产更多的可移植胚胎。使优秀母畜产生更

9、多的胚胎和后代，扩大优良基因在群体中的影响；对不小心宰了的优秀个体，还可利用其卵巢，通过体外受精继续在育种上加以利用。在母畜更新率一定的情况下，利用体外受精生产胚胎，可降低种母畜的留种率，提高母畜选择强度，加速群体遗传进展。在同胞测定中，应用体外受精技术可增加同胞数量，提高种畜选择的准确性。（二）体外受精技术的应用前景（二）体外受精技术的应用前景可实施一头母畜的卵母细胞用不同公畜的精液受精，产生同龄母系半同胞，利用同龄母系半同胞资料估计公畜育种值，将提高估计的准确性。体外受精耗精量少，可充分利用数量稀少而十分珍贵的种公畜的精液。体外受精技术的应用，可打破常规的生产体系，建立新的动物生产模式。如

10、用乳用家畜生产肉用品种。体外受精技术的应用，可为克隆和转基因操作提供大量胚胎。（二）体外受精技术的应用前景（二）体外受精技术的应用前景（一）性别控制的效应提供更多表现限性经济性状的个体（如母牛、母鸡、雄鹿等），对性别影响生产性能的畜种（如猪、肉牛、家蚕、马等），则能多生产雄性动物，提高动物生产的专门化程度和生产效率。对广泛使用人工授精技术的畜种，公畜饲养量有限，则可通过性别控制增加母畜数量，提高母畜选择强度，加快母畜遗传进展。五、性别控制与性别鉴定五、性别控制与性别鉴定通过性别控制实现不同阶段对公母比例的需要。在杂交育种中，不同阶段对公母比例的需要不同。如，肉牛杂交育种的初始阶段需要更多的杂种

11、母牛，而在横交固定阶段则需要选育一定数量的公牛，生产群中希望有更多的公牛用于肥育。（二）性别鉴定的作用性别鉴定后可对单胎动物实施同性别双胚移植，提高生产效率。性别鉴定是胚胎克隆的必要技术环节。胚胎克隆之前，首先要进行胚胎性别鉴定。（二）性别鉴定的方法1、通过X、Y精子的分离，实现受精卵的性别控制。2、通过胚胎性别诊断技术。（1）细胞遗传学方法：可以通过核型分析，判断是XX还是XY。还可以进行DNA检测，检测只有Y染色体上有的片段做探针。荧光原位杂交或PCR（性别决定基因）（2）免疫学方法：H-Y抗血清，阳性的为雄性。（3）生物化学方法X染色体失活前酶的活性鉴别。克隆（Clone）的作用：由克隆

12、获得的个体在遗传上是同质的（不考虑细胞质遗传）或基本同质的，因此克隆技术只能实现基因型的复制，而不能使一个群体的基因库得到创新或扩充。实现克隆的途径：胚胎分割、胚胎细胞中卵裂球细胞核的移植、体细胞的核移植。六、克隆技术六、克隆技术l胚胎克隆及其应用前景取8-32细胞期的胚胎卵裂细胞核去核的成熟卵子发育成新个体移植电融合、体外或体内培养1、获得更多的胚胎，进一步提高核心群育种体系的效率。理论上，一个32细胞期的供体胚胎，经过两次克隆即可得1024个胚胎。2、获得数量很大的遗传同质个体，为遗传效应、参数估计和育种值估计提供更准确的信息，提高估计的精确度。3、在MOET核心群育种体系中，快速建立具有

13、特定基因组合的多个纯系。4、迅速推广胚胎克隆家畜，提高生产总体水平。现阶段，胚胎克隆还有许多技术问题有待研究解决。但可预期，5-10年后这项技术将达到应用水平。其应用的潜在领域有：取体细胞的细胞核去核的成熟卵子发育成新个体移植电融合、体外或体内培养尽管这项技术获得成功的报道屈指可数，达到应用水平的时间也尚难预测，但动物遗传育种学家们仍十分关注这项技术的发展，并潜心研究它对未来家畜遗传育种产生的效应。由于体细胞克隆可产生已知基因个体的复制品，且移植所需细胞核来源不受限制，其意义远大于胚胎克隆。l体细胞克隆体细胞克隆的技术难度远大于胚胎克隆。该技术与其它胚胎生物工程技术结合，可建立最佳遗传资源保护

14、模式。如挽救濒危动物、克隆已绝灭了的物种、冷冻保存优秀个体的克隆胚胎等。体细胞克隆获得的遗传同质个体是比胚胎克隆更好的遗传学研究材料。体细胞克隆可最大限度地增加优质高产个体在群体中的数量，提高畜群总体水平；同时提高生产的一致化程度，便于管理和标准化生产。l体细胞克隆潜在的应用领域体细胞克隆潜在的应用领域体细胞克隆产生的遗传同质个体，是动物营养、基础医学、药物学等领域最好的试验材料。该技术为发展其它生物技术提供了最佳手段。如解决转基因动物的传代难问题。三、胚胎移植与MOET核心群育种体系MOET是超数排卵（Multiple Ovulation）与胚胎移植（Embryo Transfer）是两项相

15、互联系的生物技术的缩写。超排是基础，胚移是手段。人们习惯将两项技术统称为胚胎移植，用“MOET”表示。胚胎移植：是指从性状优良母畜（供体）体内取出早期胚胎，移植到性状一般的母畜（受体）体内继续发育以生产优良仔畜。MOET核心群育种体系基本流程示意图供体母畜（人工授精站）核心公畜群青年公畜群胚 胎母 畜核心群ET幼畜 青年家畜性能测定站（测定生长发育性状）生 产 群MOET育 成生产群核 心 群MOET在家畜育种中可实现的一般效应扩大优秀母畜在畜群遗传改良中的作用，提高母畜的利用率，缩短世代间隔。MOET可使一些遗传素质十分优秀，但因繁殖障碍而无法妊娠的母畜延续其在育种中的作用；甚至克服种间隔离

16、，挽救濒危动物。同期发情、体外受精、核移植、基因转移等技术均需通过胚胎移植才能得到后代。第十八章 基因工程技术的应用生产转基因动物进行基因诊断研制基因疫苗分子遗传标记应用前景（一）转基因动物的概念 所谓转基因动物就是把外源性目的基因导入动物的受精卵或其囊胚细胞中，后改用注入受精卵的任何一个前核，并在细胞基因组中稳定整合，再将合格的重组受精卵或囊胚细胞筛选出来，采用借腹怀孕法寄养在雌性动物（fostermother）的子宫内,使之发育成具表达目的基因的胚胎动物,并能传给下一代。这样，生育的动物为转基因动物。这类动物由于外源性目的基因的稳定存在而赋于子代动物个体.一、生产转基因动物一、生产转基因动

17、物l生产转基因动物的目的是使整合到动物核基 因 组 中 的rDNA高效表达，改变受体的生理特征或产生新的功能。1982年，等科学家将金年，等科学家将金属硫蛋白基因的启动子属硫蛋白基因的启动子和大白鼠生长激素基因和大白鼠生长激素基因拼接成融合基因，把这拼接成融合基因，把这种基因导入小白鼠的受种基因导入小白鼠的受精卵，再将这一受精卵精卵，再将这一受精卵移植到一借腹怀孕的母移植到一借腹怀孕的母鼠体内，生下来的小鼠鼠体内，生下来的小鼠比正常小鼠体格大一倍，比正常小鼠体格大一倍，称为称为“巨鼠巨鼠”。1、提高生产性能。如通过转生长激素基因或生长激素释放因子基因，可提高动物生长速度；转外源半胱氨酸生物合成

18、基因羊，其羊毛生长速度大幅度提高。2、提高产品质量。如转乳球蛋白基因奶牛和奶山羊，其奶中的乳蛋白构成受到改变，大大提高了奶的质量和价值；再如，将调控蛋白结构基因转入羊或蚕中，可以改变羊和蚕支持蛋白的合成，改变羊毛或蚕丝成份，提高其质量。（二）转基因动物的价值（二）转基因动物的价值3、实现抗病育种。如转外源Mx-基因猪具有强抗流感病毒能力；转乳铁蛋白基因奶牛，具有很强的乳房炎抗病力。5、制造生物反应器。比较成功的是乳腺生物反应器，利用奶牛或奶山羊获得在乳腺中生产对合成药物有重要意义的肽或蛋白质。目前研制生物反应器的主要目的基因有：人凝血因子、抗胰蛋白酶、胰岛素、人体白蛋白、干扰素等。在经济效益方

19、面，应用转基因动物乳腺生物反应器技术来制造基因药物也是一种可以获取巨额经济利润的新型产业。英国罗斯林研究所研制成功的转基因羊，其乳汁中含有a,1抗胰蛋白酶，可治疗肺气肿病。这种病在北美比较常见，病人以前只能依赖于注射人的a,1抗胰蛋白酶做替代疗法，价格昂贵，而现在用转基因羊来生产，每升这种羊奶可售6000美元。如荷兰的GenPharm公司用转基因牛生产乳铁蛋白，预计每年从牛奶生产出来营养奶粉的销售额是50亿美元。5、为医学试验提供实验动物，建立毒理试验、玩症研究和治疗等的动物模型。如，生产对致癌物质、诱变剂、毒物等敏感的转基因动物，有助于对环境危险因素的认识；制备用于人类脏器移植的转基因猪。1

20、、成本高。转基因的成功率极低，约为0.06%；转基因动物为半合子，传代不稳定；转基因的表达率低，甚至不表达；转基因品种无专利保护。2 2、随机整合如何控制随机整合如何控制无法控制基因插入预先选定的位置，只能接受整合到哪里就无法控制基因插入预先选定的位置，只能接受整合到哪里就无法控制基因插入预先选定的位置，只能接受整合到哪里就无法控制基因插入预先选定的位置，只能接受整合到哪里就算哪里的结果。算哪里的结果。算哪里的结果。算哪里的结果。即使外源即使外源即使外源即使外源DNADNADNADNA含有与某一条染色体广泛同含有与某一条染色体广泛同含有与某一条染色体广泛同含有与某一条染色体广泛同源的序列，大多

21、数整合仍然是随机的，只有少数是通过同源源的序列，大多数整合仍然是随机的，只有少数是通过同源源的序列，大多数整合仍然是随机的，只有少数是通过同源源的序列，大多数整合仍然是随机的，只有少数是通过同源交换而实现重组。交换而实现重组。交换而实现重组。交换而实现重组。（三）转基因动物的缺点（三）转基因动物的缺点转基因动物具有负面效应外源基因的导入可能诱发基因组中其它基因突变、失活或激活致癌基因，造成遗传缺陷或个体致死；载体DNA表达产生的负作用，如反转录病毒载体DNA的非生理性表达，扰乱正常生理功能；转基因本身的负作用，如转人生长激素基因鼠，其生长速度提高、乳腺发育提前、母鼠繁殖力降低甚至不育等。二、基

22、因诊断二、基因诊断人医：人医：利用分子生物学技术从利用分子生物学技术从DNA 水平检测人类遗水平检测人类遗 传性疾病的基因缺陷，又称传性疾病的基因缺陷，又称DNA分析法。分析法。畜牧：基因诊断是利用分子生物学技术从基因诊断是利用分子生物学技术从DNA DNA 水水平检测基因，为育种提供配种方案。实现对种畜平检测基因，为育种提供配种方案。实现对种畜的基因型选择，在选育群中淘汰有害或不利基因。的基因型选择，在选育群中淘汰有害或不利基因。基因诊断的技术手段：PCR（Polymerase Chain Reaction）、RFLP（Restriction Fragment Length Polymorp

23、hisms）、SSCP（Single Strand Conformation Polymorphism）等技术。RNA印迹（Northenblot）是检测基因是否表达、表达产物mRNA的大小及基因表达的效率。RT-PCR基因诊断技术已在猪、牛、羊育种中得到了广泛应用。目前能诊断的基因主要有：猪的氟烷基因（Hal）、雌激素受体基因（ESR）、酸猪肉基因（RN）、生长激素基因（PGH）等；牛的双肌（Double Muscling）基因；羊的产羔数（Booroola）基因等。现以猪的Hal基因为例来介绍基因诊断的技术要点及其在育种中的应用。v基因诊断技术应用情况基因诊断技术应用情况提取基因组DNA进

24、行PCR进 行 PCR-RFLP分析，判定基因型制定育种方案分析基因型与表型的关系在一定条件下，体外扩增目的基因。这是基因诊断的关键技术。从动物任何组织中均可获得基因组DNA用特定内切酶消化PCR产物后，电泳分离酶切片段，根据酶切片段多态性判定基因型。v基因诊断的技术环节基因诊断的技术环节-+从组织中获得的动物基因组DNA电泳图谱（琼脂糖凝胶）659 bp-+659 bp猪Hal基因PCR产物电泳图谱（琼脂糖凝胶）nnNnNN猪Hal基因PCR-Hha-RFLP电泳图谱（琼脂糖凝胶）1543994695515377237Marker-+NNnnNnNN猪PGH基因PCR产物电泳图谱（琼脂糖凝胶

25、）-+猪PGH基因PCR-Bst-RFLP电泳图谱（琼脂糖凝胶）-+CCCCCCCCCCCCCCAAACAAACBCCD猪PGH基因PCR-Apa-RFLP电泳图谱（聚丙烯酰胺凝胶）-+三、研制基因疫苗 19901990年沃尔夫（年沃尔夫（WOffWOff）等发现，将带有甲型流感）等发现，将带有甲型流感病毒核蛋白编码基因的质粒注射到小鼠肌肉内，可使病毒核蛋白编码基因的质粒注射到小鼠肌肉内，可使小鼠能经受致死剂量的甲型流感病毒的攻击。这种裸小鼠能经受致死剂量的甲型流感病毒的攻击。这种裸露的露的DNADNA通过滴鼻和肠道也可以进人细胞，并获得成通过滴鼻和肠道也可以进人细胞，并获得成功的保护性免疫。

26、这种具有疫苗作用的裸露功的保护性免疫。这种具有疫苗作用的裸露DNADNA称之称之为为“基因疫苗基因疫苗”。基因疫苗不仅可用于病毒感染，还可用于防治肿基因疫苗不仅可用于病毒感染，还可用于防治肿瘤，其主要优点为可以诱导很有效的专一性瘤，其主要优点为可以诱导很有效的专一性T T杀伤性杀伤性细胞，后者可以杀死肿瘤细胞。基因疫苗的安全性极细胞，后者可以杀死肿瘤细胞。基因疫苗的安全性极高，一是无直接副作用，二是无间接副作用，不存在高，一是无直接副作用，二是无间接副作用，不存在对人体的毒性，机体耐受性好，输注疫苗不引起其它对人体的毒性，机体耐受性好，输注疫苗不引起其它疾患。疾患。19951995年年4 4月

27、，经美国月，经美国FDAFDA批准进行了首例应用基批准进行了首例应用基因疫苗的人体临床试验因疫苗的人体临床试验。因而，可以看到其实际应用。因而，可以看到其实际应用已指日可待了。已指日可待了。伪狂犬病基因工程苗伪狂犬病基因缺失苗大肠杆菌基因缺失苗K88、K89（一）遗传标记的概念及其发展概念：遗传标记是指那些可准确鉴别、能反映个体特异性的遗传特征。遗传标记应具备的条件：具有丰富的多态性；数量多，且覆盖整个基因组；等位基因间呈共显性，能准确判别所有可能的基因型；其测定不受年龄、性别、环境等因素的限制。遗传标记的发展：形态学标记 细胞学标记 生化标记 DNA分子标记。四、分子遗传标记四、分子遗传标记

28、RFLP（Restriction Fragment Length Polymorphisms）：指用同一限制性内切酶酶切不同个体的基因组DNA后，所获得的含有同源序列的酶切片段在长度上存在的差异。这是最早开发的DNA标记，在同一基因座上只有两个等位基因，多态性不够高，且测定方法比较复杂，近年已很少使用。AFLP（Amplified Fragment Length Polymorphisms）：用特定引物，通过PCR反应，复制并扩增不同个体基因组DNA模板，所得DNA片段在长度上的差异。该方法较RFLP简单，但需要设计和合成特定引物，且AFLP标记可能是显性的，无法区分纯合子与杂合子。（二）（二

29、）DNADNA分子标记的类型分子标记的类型RAPD（Randomly Amplified Polymorphic DNA）：这也是基于PCR的分子标记，用随机序列组成的寡核苷酸作为引物通过PCR反应获得的长度不同的多态性DNA片段。该方法的重复性性较差，且多数RAPD标记为显性标记。SNPs（Single Nucleotide Polymorphisms）：指单个核苷酸突变而产生的多态，只有两个等位基因。虽其多态性不高，但在基因组中SNP的数量很大。如人类基因组中，单核苷酸突变的概率为10-6左右，人类基因组约含30亿个碱基，因而平均每1000个碱基就有1个以上的SNP标记。测定SNP最快速准

30、确的方法是用DNA芯片技术。（二）DNA分子标记的类型VNTR（Variable Number Tandem Repeat）：在真核生物基因组中存在许多串状重复序列，如CACACA 或GTGTGT ，由于重复单位在个体间有很大差异，因而可作为一种遗传标记，不同的重复次数就构成不同的等位基因。按重复单位大小可分为微卫星标记和小卫星标记。微卫星标记（Microsatelite Marker）的重复单位在6个碱基对以内，或称简单序列重复（Simple Sequence Repeat，SSR）。小 卫 星 标 记（Minisatelite Marker）的重复单位大于6个碱基对。对DNA的微卫星多态性

31、，可设计特定引物通过PCR加以鉴别。对小卫星多态性，可用重复单位的同源序列作为探针进行RFLP分析。（二）（二）DNADNA分子标记的类型分子标记的类型微卫星标记：M5 PCR扩增及电泳结果-+RAPD标记：R93 PCR扩增及电泳结果-+微卫星MCW0120 扩增产物变性聚丙烯酰胺电泳检测-+ABIABI遗传分析程序检测微卫星标记图谱遗传分析程序检测微卫星标记图谱图图中中共共有有7 7个个微微卫卫星星标标记记，获获得得PCRPCR产产品品后后，用用ABIABI遗遗传传分分析析技技术术2020分分钟钟获获得得的的结结果果。该该图图谱谱还还可可进进行行群群体体的的精精确确系系谱谱鉴鉴定定，即即通

32、通常常讲讲的的亲亲子子鉴鉴定定。该该技技术术还还可可以以用用以以进行遗传病的基因诊断。进行遗传病的基因诊断。目目前前正正在在研研究究一一次次获获得得2020个个以以上上标标记记的的程程序序，已经通过初步实验。已经通过初步实验。分子标记为我们提供了非常丰富的遗传育种信息，这些信息可用于：用于QTL检测；用于标记辅助选择；研究品种起源与发展；用于标记辅助基因的导入；标记辅助杂种优势的利用；标记辅助遗传资源的评估（下一章）亲子鉴定等。其中前3项是目前家畜遗传育种中研究得最多的内容，可望在家畜育种中得到广泛应用。（三）DNA分子标记的作用u概念：QTL（Quantitative Trait Loci）

33、理论上是指所有影响数量性状的基因位点。实际上，通常是将那些有较大效应的、可被检测出的基因或染色体片段称为QTL。当一个QTL就是一个基因时，该基因就是主效基因。若对影响数量性状的各个单基因都有清楚的了解，将大大提高对数量性状选择的有效性的准确性，同时还可利用克隆、转基因技术等对群体进行遗传改良。uQTL检测的方法：主要有标记-QTL连锁分析法（Marker-QTL Linkage Analysis，又称基因组扫描法）和候选基因分析法（Candidate Gene Approach）两种。1、QTL检测构建资源群体选择标记收集数据构建标记连锁图QTL的检测与参数估计一般家畜群体中，标记与QTL可

34、能处于连锁平衡状态，需要设计特定的资源群体，以产生足够的连锁不平衡。近交或杂交试验设计、家系试验设计。根据所选资源群、试验经费、技术水平、工作条件等，选择适当类型和数目的标记。对分子遗传标记基因型测定的数据；需要检测的数量性状表型值测定的数据。测定标记所在的连锁群（染色体），估计标记间的相对距离（用重组率或图距表示），确定标记的排列顺序。根据已确定的遗传图谱，利用已测得的标记基因型及其表型值，用统计分析方法估计QTL在染色体上的位置、基因频率、效应大小等。标记-QTL连锁分析以回交试验设计为例来说明以回交试验设计为例来说明M-QTLM-QTL连锁分析连锁分析亲本 F1M1 Q1M2 Q2M2

35、Q2M2 Q2M2 Q2M2 Q2回交一代M1 Q1M1 Q1 M1 Q1M2 Q2M2 Q2M2 Q2M1 Q2M2 Q2M2 Q1M2 Q2亲本型个体重组型个体这是利用微卫星标记绘制的绵羊1、2号染色体连锁图谱该研究通过组建 F2 分离群体，构建了鸡RAPD连锁图谱，用区间作图分析法，对鸡19种产肉性状基因位点（QTL）进行定位和效应分析。连锁图谱包含32个RAPD标记，分布于5个连锁群；检测到控制17种产肉性状的QTL 35个，控制鸡胫长的主效基因2个。该论文在畜牧兽医学报发表，全国家禽研究会交流，引起同行专家高度重视。鸡产肉性状与分子标记的连锁分析鸡产肉性状与分子标记的连锁分析标记-Q

36、TL连锁分析法的优、缺点优点：成功率高。可检测出基因组中所有的QTL。因为标记覆盖整个基因组。缺点:成本高，耗时长。因测定标记基因型及个体数多。统计分析难度大。方法及计算复杂，统计量的分布不确定，对多性状、多染色体分析时犯型错误的概率大。很难精确定位。只能给出QTL位点的一个估计值或一个置信区间。不便应用。实际育种群多为远交群体，标记与QTL间的关系因家系而异，用标记-QTL连锁分析找到的QTL很难直接用于这些群体。l候选基因法候选基因：已知在性状发育或生理过程中具有某种生物学功能并经测序的基因，这些基因可能是QTL基因。候选基因法：从一些可能是QTL的基因中筛选出QTL的方法。选择候选基因获

37、得用于扩增基因的引物序列揭示候选基因内的多态性建立大规模测定候选基因基因型的方法选择进行候选基因分析的群体研究候选基因与性状的关系证实所发现的候选基因与性状的关系，并确定其是否是QTL根据所掌握的生物学或生理学知识、或标记-QTL连锁分析的结果选择候选基因。从现有基因库中寻找，或自行设计特异性引物。用PCR-RFLP或SSCP等方法进行研究。PCR-RFLP和SSCP是目前用于大规模检测基因型的主要方法。原则上，任何群体都可用于候选基因分析，但最好是候选基因的平衡群体（未经选择的地方品种群或常规育种的商业化育种群）。否则不易区分候选基因与其连锁的其它基因的效应。可分析候选基因各多态位点与性状的

38、关系，也可分析整个候选基因与性状的关系。采用候选基因法对猪产仔数分子标采用候选基因法对猪产仔数分子标记及其效应的研究结果记及其效应的研究结果通过对ESR、PRLR、FSHR和RYR1四个基因与猪产仔数间的关系及第八号染色体上的 9 个微卫星分析研究，初步确立了三个新的猪产仔数分子标记：雌激素受体基因（ESR）第八外显子内的ESRB酶切位点。促卵泡生长激素受体基因（FSHR）第七外显子的FSHRB酶切位点。猪第八号染色体上的SWR1101微卫星。ESR基因的BB基因型；ESRB酶切位点的AA型；FSHRB酶切位点的BB型；猪催乳素受体(PRLR)基因的AA基因型；RYR1基因的BB基因型等。用这

39、5个分子遗传标记选择母猪，群体窝平产仔数可提高2.2头。对提高母猪产仔数有利而不影响仔对提高母猪产仔数有利而不影响仔猪生长的分子标记有猪生长的分子标记有5 5个个ESR基因的AA基因型；ESRB酶切位点的BB型；FSHRB酶切位点的AA型；PRLR基因的BB基因型；微卫星SWR1101的BD基因型。对提高母猪产仔不利的分子标记也有5个候选基因分析法的优、缺点优点统计检验效率高。只要是QTL，就能检测出来。应用范围广。只需一个世代的群体，结果可用于任何群体。成本低，容易实施。因为是对单个基因进行分析，而非对整个基因扫描。便于应用。一旦确定某个候选基因就是QTL，可直接用于遗传评估，而不必借助其它

40、标记信息。缺点不能找出所有的QTL。难以确定候选基因就是QTL。除非候选基因的效应非常大，否则其效应很有可能是与其连锁的一个或几个相邻QTL之间连锁不平衡造成的。所以在候选基因的效应未被明确证实之前，不能轻易下结论1）标记辅助选择的基本原理最理想的情况是基因辅助选择通过测定QTL基因型，直接选择理想基因型的个体。如猪的Hal基因 ESR基因 RN基因、羊的Booroola基因、肉牛的Double Muscling基因等。标记辅助选择（Marker Assistant Selection）：当QTL的基因型不能直接测定，只能根据标记信息推测时，就可根据与QTL紧密连锁的Marker进行选择。2

41、2 标记辅助选择（标记辅助选择（MASMAS）标记辅助选择的前提 若M与QTL在传代过程中有可能发生重组，就会导致选择错误。因此，进行标记辅助选择的前提条件是：父亲在Marker和QTL上都必须是杂合子；父亲的Marker和QTL的连锁相已知；能准确判断后代从父亲处获得了哪个Marker等位基因（母亲的Marker基因型是纯合子）。要开展要开展MAS育种，必须具备如下条育种，必须具备如下条件：件：分子标记与目标基因共分离或紧分子标记与目标基因共分离或紧密连锁，一般要求两者之间的遗传距离密连锁，一般要求两者之间的遗传距离小于小于5cM，最好，最好1cM或更小；或更小；具有在大群体中利用分子标记具

42、有在大群体中利用分子标记进行筛选的有效手段，目前，主要应进行筛选的有效手段，目前，主要应用在自动化程度高、相对易于分析，用在自动化程度高、相对易于分析，而且成本较小的而且成本较小的PCR技术；技术；筛选技术在不同试验室间重复性筛选技术在不同试验室间重复性好，而且具有经济、易操作的特点；好，而且具有经济、易操作的特点；应有实用化程度高并能协助育种应有实用化程度高并能协助育种家作出抉择的计算机数据处理软件。家作出抉择的计算机数据处理软件。由单基因控制的质量性状的分子标记，易于由单基因控制的质量性状的分子标记，易于用于用于MAS育种。对大多数数量性状遗传的重要农育种。对大多数数量性状遗传的重要农艺性

43、状，若利用艺性状，若利用MAS育种则必须具有精确的育种则必须具有精确的QTL图谱。这不仅需要将重复的性状利用合适软件分图谱。这不仅需要将重复的性状利用合适软件分成多个成多个QTLs，并将各个，并将各个QTL标记定位于合适的遗标记定位于合适的遗传图谱上，而且还与是否有对该数量性状表现型传图谱上，而且还与是否有对该数量性状表现型进行准确检测的方法有关。进行准确检测的方法有关。用于作图的群体大小、可重复性、环境用于作图的群体大小、可重复性、环境影响和不同遗传背景的影响以及是否有合适影响和不同遗传背景的影响以及是否有合适的数量性状遗传分析方法等有关。这为筛选的数量性状遗传分析方法等有关。这为筛选某一复

44、杂性状的某一复杂性状的QTL标记提出了更高的要求，标记提出了更高的要求，也增加了也增加了MAS付诸育种实践的难度。付诸育种实践的难度。MAS的优越性增加遗传评定的准确性进行早期遗传评定降低遗传评定的成本获得更大的遗传进展和育种效益MASMAS的基本策略的基本策略A A保持现行的育种方案，但同时利用标记信息、表型信息和系谱信息对个体进行遗传评定。提高遗传评定的准确性！2 2）标记辅助选择的策略）标记辅助选择的策略MAS的基本策略的基本策略 B两阶段选择降低育种成本！基因型选择EBV选择第一阶段：(生产性能测定之前)第二阶段：(生产性能测定之后)利用标记或主基因信息利用表型和系谱信息性能测定2 2

45、）标记辅助选择的策略）标记辅助选择的策略MASMAS的基本策略的基本策略 C C早期选择缩短世代间隔！选 择基因型信息亲代信息同胞信息繁殖生物技术+2 2）标记辅助选择的策略）标记辅助选择的策略 近十多年来，分子标记的研究已近十多年来，分子标记的研究已经得到快速发展，在许多动物中已定经得到快速发展，在许多动物中已定位了很多重要性状的基因，但是预测位了很多重要性状的基因，但是预测品系或品种的报道还很少。品系或品种的报道还很少。QTL效应的大小。Marker与QTL的连锁程度。选择的世代数。常规选择的效率。常规选择非常有效，则标记辅助选择的效应不显著；反之，常规选择效率越低，则标记辅助选择的优势越

46、明显。影响标记辅助选择的效率的因素 原因主要有：原因主要有：标记信息的丢失。标记标记信息的丢失。标记仍然存在，但是由于重组使标记与基因分离，仍然存在，但是由于重组使标记与基因分离，导致选择偏离方向；导致选择偏离方向；QTL定位和效应估算定位和效应估算的不精确性；的不精确性；上位性的存在，由于上位性的存在，由于QTL与与环境、环境、QTL与与QTL之间存在互作，导致不同之间存在互作，导致不同环境、不同背景下选择效率发生偏差；环境、不同背景下选择效率发生偏差；标标记鉴定技术有待于进一步提高。记鉴定技术有待于进一步提高。尽管近年来标记鉴定技术在实用尽管近年来标记鉴定技术在实用性及降低成本方面都得到了

47、很大的发性及降低成本方面都得到了很大的发展，但是对于大多数试验室来说，展，但是对于大多数试验室来说，MAS还是一项费时耗资的工作。还是一项费时耗资的工作。尽管目前尽管目前MAS的成功应用还存在许的成功应用还存在许多困难，但是多困难，但是MAS在未来动物育种中的在未来动物育种中的作用是毋容置疑的。相信在不久的将来，作用是毋容置疑的。相信在不久的将来，随着分子生物技术的进一步发展以及各随着分子生物技术的进一步发展以及各种动物图谱的日趋饱和，种动物图谱的日趋饱和，MAS会发挥它会发挥它应有的作用。应有的作用。3、利用DNA分子标记研究家畜品种起源与发展1 1）利利用用核核基基因因组组DNADNA上上

48、的的高高度度保保守守序序列列作作为为遗遗传传标记，研究家畜品种的起源与进化。标记，研究家畜品种的起源与进化。2 2）利利用用细细胞胞质质内内的的线线粒粒体体DNADNA（mtDNAmtDNA），研研究究家家畜的起源与进化。畜的起源与进化。v利用24种限制性内切酶对来自我国13个省的21个地方猪品种的线粒体DNA 限制性酶切片段长度多态性（mtDNA RFLP）进行分析研究，结果表明：中国地方猪种有四种mtDNA RFLP类型；长白猪有三种mtDNA RFLP类型，其中一种与中国地方猪种相同。根据mtDNA RFLP多态性聚类，中国地方猪种与四川野猪的亲缘关系较近，与越南野猪和长白猪的亲缘关系较

49、远。中地方猪种mtDNA的变异程度较低，说明其遗传多样性比较贫乏，提示中国家猪可能起源于一个共同的祖先。猪遗传多样性及起源与进化研究 采用mtDNA RFLP 和 RAPD 技术分析了16个中国家鹅品种和2个欧洲家鹅品种及2个杂交种共220只个体的核内基因组和核外基因组的多态性。是我国首次对鹅在分子水平的研究报道，获得了一系列重要研究成果，其研究水平得到较高评价，论文在畜牧兽医学报发表，并得到多次引用和检索。中国主要家鹅品种的遗传多样性及起源分化研究4、利用分子标记进行杂种优势分析和预测杂种优势来源于DNA的杂合性，分子标记第一次提供了准确判断杂交组合DNA杂合性的手段，从而也第一次有可能从D

50、NA水平预测杂种优势。利用分子标记，还可人工培育出在DNA序列的重要片段可能高度杂合的亲本，从而配制出超优势的F1组合。5、利用分子标记进行遗传资源评估（下一章）6、亲子鉴定微卫星标记7、标记辅助基因的导入标记辅助导入是分子遗传信息应用于动物育种的一个重要方面，其目的是在标记信息的辅助下将一个品种（供体）中的一个或多个优良基因导入另一个品种（受体），同时还要尽可能地保持受体群体原有的遗传背景。在标记辅助导入过程中，标记信息既可用于辅助前景选择，即对目标基因携带者的选择，以保证目标基因的正确导入，也可用于辅助背景选择，即对受体基因组的选择，以加快受体遗传背景的恢复。五、动物生物技术应用的前景u现