基因结构与功能分析.ppt

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1、目录目录生物化学与分子生物学生物化学与分子生物学目录目录第二十二章第二十二章 基因结构与功能分析技术基因结构与功能分析技术 The Analysis Technology for Gene Structure and Function目录目录人类的多种疾病都与基因的结构或功能异常人类的多种疾病都与基因的结构或功能异常有关，因此，要阐明疾病发生的分子机制和有关，因此，要阐明疾病发生的分子机制和进行有效的诊断与防治，均需首先揭示基因进行有效的诊断与防治，均需首先揭示基因的结构与功能。的结构与功能。DNADNA序列测定序列测定基因转录起点及其启动子的分析基因转录起点及其启动子的分析基因编码序列的分析

2、基因编码序列的分析基因拷贝数及其表达产物的分析基因拷贝数及其表达产物的分析基因功能获得和基因功能获得和/或缺失策略或缺失策略随机突变筛选策略随机突变筛选策略目录目录第一节第一节 基因结构分析技术基因结构分析技术 目录目录一、基因一级结构解析技术一、基因一级结构解析技术 基因的一级结构是指脱氧核苷酸的排列基因的一级结构是指脱氧核苷酸的排列顺序，解析一级结构最精确的技术就是顺序，解析一级结构最精确的技术就是DNA测序（测序（DNA sequencing）。）。目录目录（一）双脱氧法和化学降解法是两种常规的（一）双脱氧法和化学降解法是两种常规的DNA测序方法测序方法 Sanger双脱氧测序（双脱氧测

3、序（dideoxy sequencing）法）法 目录目录Maxam-Gilbert化学降解测序法化学降解测序法 目录目录（二）全自动激光荧光（二）全自动激光荧光DNA测序技术的原理测序技术的原理基于基于Sanger双脱氧法双脱氧法 1.四色荧光法：四色荧光法：采采用用四四种种不不同同的的荧荧光光染染料料标标记记同同一一引引物物或或4种种不不同同的的终终止止底底物物ddNTP，最最终终结结果果均均相相当当于于赋赋予予DNA片片段段4种种不不同同的的颜颜色色。因因此此，一一个个样样品品的的4个个反反应应产产物物可可在在同同一一个个泳泳道内电泳。道内电泳。2.单色荧光法：单色荧光法：采采用用单单一

4、一荧荧光光染染料料标标记记引引物物5-端端或或dNTP，所所有有产产物物的的5-末末端端均均带带上上了了同同一一种种荧荧光光标标记记，一一个个样样品品的的四四个个反反应应必须分别进行，相应产物也必须在四个不同的泳道内电泳必须分别进行，相应产物也必须在四个不同的泳道内电泳目录目录（三）焦磷酸测序是一种基于发光法测定焦磷（三）焦磷酸测序是一种基于发光法测定焦磷酸的测序技术酸的测序技术 焦焦磷磷酸酸测测序序技技术术操操作作简简单单，结结果果准准确确可可靠靠，可可应应用用于于单单核核苷苷酸酸多多态态性性位位点点（SNP）分分析析、等等位位基基因因频频率率测测定定、细细菌菌和和病病毒毒等等微微生生物物的

5、的分分型型鉴鉴定定、CpG甲甲基基化化分分析析、扫扫描描与与疾疾病病相相关关基基因因序序列列中中的的突突变变点点等等领领域域。该该方方法法的的测测序序长长度度一一般般短短于于Sanger法。法。目录目录（四）循环芯片测序被称为第二代测序技术（四）循环芯片测序被称为第二代测序技术 循环芯片测序（循环芯片测序（cyclic-array sequencing）可实现大规模并行化分析可实现大规模并行化分析 不需电泳，设备易于微型化不需电泳，设备易于微型化 样本和试剂的消耗量降低，降低了测序成本样本和试剂的消耗量降低，降低了测序成本 优势：优势：技术平台：技术平台：454测序、测序、Solexa测序（测

6、序（Illumina测序）、测序）、SOLiD测序等。测序等。目录目录基本流程：基本流程：将基因组将基因组DNA随机切割成为小片段随机切割成为小片段DNA；在所获小片段在所获小片段DNA分子的末端连上接头，然分子的末端连上接头，然后变性得到单链模板文库；后变性得到单链模板文库；将带接头的单链小片段将带接头的单链小片段DNA文库固定于固体文库固定于固体表面；表面；对固定片段进行克隆扩增，从而制成对固定片段进行克隆扩增，从而制成polony芯片。芯片。针对芯片上的针对芯片上的DNA，利用聚合酶或连接酶进，利用聚合酶或连接酶进行一系列循环反应，通过读取碱基连接到行一系列循环反应，通过读取碱基连接到D

7、NA链过程中释放出的光学信号而间接确定链过程中释放出的光学信号而间接确定碱基序列。碱基序列。目录目录（五）单分子测序技术被称为第三代测序技术（五）单分子测序技术被称为第三代测序技术 主要策略：主要策略：通过掺入并检测荧光标记的核苷酸，来实现单分通过掺入并检测荧光标记的核苷酸，来实现单分子测序，如单分子实时技术（子测序，如单分子实时技术（single molecule real time technology，SMRT）；）；利用利用DNA聚合酶在聚合酶在DNA合成时的天然化学方式合成时的天然化学方式来实现单分子测序；来实现单分子测序；直接读取单分子直接读取单分子DNA序列信息。序列信息。目录目

8、录二、基因转录起点分析技术二、基因转录起点分析技术 转录起点（转录起点（transcription start site，TSS）（一）用（一）用cDNA克隆直接测序法鉴定克隆直接测序法鉴定TSS 以以mRNA为模板，经逆转录合成为模板，经逆转录合成cDNA第一链，同时第一链，同时利用逆转录酶的末端转移酶活性，在利用逆转录酶的末端转移酶活性，在cDNA第一链的末端第一链的末端加上加上polyC尾，并以此引导合成尾，并以此引导合成cDNA第二链。将双链第二链。将双链cDNA克隆于适宜载体，通过对克隆克隆于适宜载体，通过对克隆cDNA的的5-末端进行末端进行测序分析即可确定基因的测序分析即可确定基

9、因的TSS序列。序列。该方法比较简单，尤其适于对特定基因该方法比较简单，尤其适于对特定基因TSS的分析。的分析。但可导致但可导致5-末端部分缺失，从而影响对末端部分缺失，从而影响对TSS的序列测定。的序列测定。目录目录（二）用（二）用5-cDNA末端快速扩增技术鉴定末端快速扩增技术鉴定TSS 常用的技术包括常用的技术包括5-末端基因表达系列分析（末端基因表达系列分析（5-end serial analysis of gene expression，5-SAGE）和帽分析基因表达）和帽分析基因表达（cap analysis gene expression，CAGE）技术。）技术。目录目录（三）用

10、数据库搜索（三）用数据库搜索TSS 利用对寡核苷酸帽法构建的全长利用对寡核苷酸帽法构建的全长cDNA文文库库5-末端测序所得的数据信息建立了一个末端测序所得的数据信息建立了一个TSS数据库（数据库（database of transcription start sites，DBTSS），并在此基础上，通过将寡核苷酸帽），并在此基础上，通过将寡核苷酸帽法和大量平行测序技术相结合开发了一种法和大量平行测序技术相结合开发了一种TSS测序法，从而实现了一次测试可产生测序法，从而实现了一次测试可产生1107 个个TSS的数据。的数据。目录目录三、基因启动子结构分析技术三、基因启动子结构分析技术（一）用（

11、一）用PCR结合测序技术分析启动子结构结合测序技术分析启动子结构 该方法最为简单和直接，即根据基因的启动该方法最为简单和直接，即根据基因的启动子序列，设计一对引物，然后以子序列，设计一对引物，然后以PCR法扩增启动法扩增启动子，经测序分析启动子序列结构。子，经测序分析启动子序列结构。目录目录（二）用核酸（二）用核酸-蛋白质相互作用技术分析启动蛋白质相互作用技术分析启动子结构子结构 1.用足迹法分析启动子中潜在的调节蛋白结合位点用足迹法分析启动子中潜在的调节蛋白结合位点 足迹法（足迹法（footprinting）是利用）是利用DNA电泳条带电泳条带连续性中断的图谱特点判断与蛋白质结合的连续性中断

12、的图谱特点判断与蛋白质结合的DNA区域，它是研究核酸区域，它是研究核酸-蛋白质相互作用的方法，而蛋白质相互作用的方法，而不是专门用于研究启动子结构的方法。不是专门用于研究启动子结构的方法。分类：分类：酶足迹法酶足迹法化学足迹法化学足迹法 目录目录（1）用核酸酶进行足迹分析）用核酸酶进行足迹分析 酶酶足足迹迹法法（enzymatic footprinting）是是 利利 用用DNA酶酶处处理理DNA-蛋蛋白白质质复复合合物物，然然后后通通过过电电泳泳分分析蛋白质结合序列。析蛋白质结合序列。常常用用的的酶酶有有DNA酶酶I（DNase I）和和核核酸酸外外切切酶酶III。目录目录（2）用化学试剂进

13、行足迹分析）用化学试剂进行足迹分析 化化学学足足迹迹法法（chemical footprinting）是是利利用用能能切切断断DNA骨骨架架的的化化学学试试剂剂处处理理DNA-蛋蛋白白质质复复合合物物，由由于于化化学学试试剂剂无无法法接接近近结结合合了了蛋蛋白白质质的的DNA区区域域，因因此此在在电电泳泳上上形形成成空空白白区区域域的的位位置置就就是是DNA结结合合蛋蛋白白的的结结合合位位点点。最最常常用用的的化化学学足足迹迹法法是是羟羟自自由由基基足足迹迹法法（hydroxyl radical footprinting）。）。目录目录2.用电泳迁移率变动分析和染色质免疫沉淀技术鉴定用电泳迁移

14、率变动分析和染色质免疫沉淀技术鉴定启动子启动子 电电泳泳迁迁移移率率变变动动分分析析（EMSA）和和染染色色质质免免疫疫沉沉淀淀（ChIP）只只能能确确定定DNA序序列列中中含含有有核核蛋蛋白白结结合合位位点点，故故尚尚需需结结合合DNA足足迹迹实实验验和和DNA测测序序等技术来确定具体结合序列。等技术来确定具体结合序列。目录目录（三）用生物信息学预测启动子（三）用生物信息学预测启动子 1.用启动子数据库和启动子预测算法定义启动子用启动子数据库和启动子预测算法定义启动子 在在定定义义启启动动子子或或预预测测分分析析启启动动子子结结构构时时应应包包括括启启动子区域的动子区域的3个部分个部分 核心

15、启动子（核心启动子（core promoter）；）；近近端端启启动动子子（proximal promoter）：含含有有几几个个调控元件的区域，其范围一般涉及调控元件的区域，其范围一般涉及TSS上游几百个碱基；上游几百个碱基；远远端端启启动动子子（distal promoter）：范范围围涉涉及及TSS上游几千个碱基，含有增强子和沉默子等元件。上游几千个碱基，含有增强子和沉默子等元件。目录目录2.预测启动子的其他结构特征预测启动子的其他结构特征 启启动动子子区区域域的的其其他他结结构构特特征征包包括括GC含含量量、CpG比比率、转录因子结合位点、碱基组成及核心启动子元件等。率、转录因子结合位

16、点、碱基组成及核心启动子元件等。用用于于启启动动子子预预测测的的数数据据库库：EPD（eukaryotic promoter databases）数数据据库库，主主要要预预测测真真核核RNA聚聚合合酶酶型型启启动动子子，数数据据库库中中的的所所有有启启动动子子数数据据信信息息都都经经过过实实 验验 证证 实实；TRRD（transcription regulatory region databases）是是一一个个转转录录调调控控区区数数据据库库，数数据据来来源源于于已已发发表的科学论文。表的科学论文。目录目录四、基因编码序列分析技术四、基因编码序列分析技术（一）用（一）用cDNA文库法分析基

17、因编码序列文库法分析基因编码序列 cDNA克克隆隆测测序序或或构构建建cDNA文文库库是是最最早早分分析析基基因因编编码码序序列列的的方方法法。全全长长cDNA文文库库可可以以通通过过mRNA的的结结构构特特征征进进行行判判断断，mRNA的的序序列列基基本本都都由由3部部分分组组成成，即即5-UTR、编码序列和、编码序列和3-UTR。cDNA末末端端快快速速扩扩增增（RACE）技技术术是是高高效效钓钓取取未未知基因编码序列的一种方法。知基因编码序列的一种方法。核核酸酸杂杂交交法法可可从从cDNA文文库库中中获获得得特特定定基基因因编编码码序序列的列的cDNA克隆。克隆。目录目录（二）用（二）用

18、RNA剪接分析法确定基因编码序列剪接分析法确定基因编码序列 高通量分析高通量分析RNA剪接的方法：剪接的方法：基于基于DNA芯片的分析法芯片的分析法 交联免疫沉淀法交联免疫沉淀法 体外报告基因测定法体外报告基因测定法选选择择性性剪剪接接的的转转录录产产物物可可以以通通过过基基因因表表达达序序列列标标签签（expression sequence tag,EST）的的比比较较进进行行鉴鉴定定，但但这这种种方方法法需需进进行行大大量量的的EST序序列列测测定定；同同时时由由于于大大多多数数EST文文库库来来源源于于非非常常有有限限的的组织，故组织特异性剪接变异体也很可能丢失。组织，故组织特异性剪接变

19、异体也很可能丢失。目录目录（三）用数据库分析基因编码序列（三）用数据库分析基因编码序列在在基基因因数数据据库库中中，对对各各种种方方法法所所获获得得的的cDNA片片段段的的序序列列进进行行同同源源性性比比对对，通通过过染染色色体体定定位位分分析析、内内含含子子外外显显子子分分析析、ORF分分析析及及表表达达谱谱分分析析等等，可可以以初初步步明明确确基基因因的的编码序列，并可对其编码产物的基本性质进行分析。编码序列，并可对其编码产物的基本性质进行分析。利利用用有有限限的的序序列列信信息息即即可可通通过过同同源源性性搜搜索索获获得得全全长长基基因因序序列列，然然后后，利利用用NCBI的的ORF F

20、inder软软件件或或EMBOSS中中的的getorf软软件件进进行行ORF分分析析，并并根根据据编编码码序序列列和和非非编编码码序序列的结构特点，便可确定基因的编码序列。列的结构特点，便可确定基因的编码序列。目录目录五、基因拷贝数分析技术五、基因拷贝数分析技术 分分析析某某种种基基因因的的种种类类及及拷拷贝贝数数，实实质质上上就就是是对对基基因因进进行行定定性性和和定定量量分分析析，常常用用的的技技术术包包括括DNA印印迹（迹（Southern印迹）、实时定量印迹）、实时定量PCR技术等。技术等。DNA印印迹迹是是根根据据探探针针信信号号出出现现的的位位置置和和次次数数判断基因的拷贝数判断基

21、因的拷贝数 实实时时定定量量PCR是是通通过过被被扩扩增增基基因因在在数数量量上上的的差差异推测模板基因拷贝数的异同异推测模板基因拷贝数的异同DNA测序是最精确的鉴定基因拷贝数的方法测序是最精确的鉴定基因拷贝数的方法目录目录第二节第二节 基因表达产物分析技术基因表达产物分析技术 目录目录一、通过检测一、通过检测RNA而在转录水平分析而在转录水平分析基因表达基因表达 根根据据分分析析方方法法的的原原理理和和功功能能特特性性，可可将将基基因因转录水平分析分为封闭和开放性系统研究方法。转录水平分析分为封闭和开放性系统研究方法。封封闭闭性性系系统统研研究究方方法法（如如DNA芯芯片片、RNA印印迹迹、

22、实实时时RT-PCR等等）的的应应用用范范围围仅仅限限于于已已知知基基因因。开开放放性性系系统统研研究究方方法法（如如差差异异显显示示PCR、双双向向基基因因表表达达指指纹纹图图谱谱、分分子子索索引引法法、随随机机引引物物PCR指纹分析等）可用于发现和分析未知基因。指纹分析等）可用于发现和分析未知基因。目录目录（一）用核酸杂交法检测（一）用核酸杂交法检测RNA表达水平表达水平 1.用用RNA印迹分析印迹分析RNA表达表达 RNA印印迹迹被被广广泛泛应应用用于于RNA表表达达分分析析，并并作为鉴定作为鉴定RNA转录本、分析其大小的标准方法。转录本、分析其大小的标准方法。2.用核糖核酸酶保护实验分

23、析用核糖核酸酶保护实验分析RNA水平及其剪接情况水平及其剪接情况 RNA酶酶 保保 护护 实实 验验（ribonuclease protection assay，RPA）是是一一种种基基于于杂杂交交原原理理分分析析RNA的的方方法，既可进行定量分析，又可研究其结构特征。法，既可进行定量分析，又可研究其结构特征。目录目录目录目录3.用原位杂交进行用原位杂交进行RNA区域定位区域定位 原原位位杂杂交交（ISH）是是通通过过设设计计与与目目标标RNA碱碱基基序序列列互互补补的的寡寡核核苷苷酸酸探探针针，利利用用杂杂交交原原理理在在组组织织原原位位检检测测RNA的的技技术术，其其可可对对细细胞胞或或组

24、组织织中中原原位位表表达达的的RNA进进行行区区域域定定位位，同同时时也也可可作为定量分析的补充。作为定量分析的补充。目录目录（二）用（二）用PCR技术检测技术检测RNA表达水平表达水平 1.用逆转录用逆转录PCR进行进行RNA的半定量分析的半定量分析 逆逆转转录录PCR（RT-PCR）一一般般用用于于RNA的的定定性性分分析析；如如果果设设置置阳阳性性参参照照，则则可可对对待待测测RNA样品进行半定量分析。样品进行半定量分析。2.用实时定量用实时定量PCR进行进行RNA的定量分析的定量分析 实实时时定定量量PCR是是定定量量分分析析RNA的的最最通通用用、最最快快速速、最最简简便便的的方方法

25、法，该该方方法法是是对对PCR反反应应进行实时监测，具有很高的灵敏度和特异性。进行实时监测，具有很高的灵敏度和特异性。目录目录（三）用基因芯片和高通量测序技术分析（三）用基因芯片和高通量测序技术分析RNA表达水平表达水平 1.基因芯片已成为基因表达谱分析的常用方法基因芯片已成为基因表达谱分析的常用方法 基基因因芯芯片片主主要要采采用用cDNA芯芯片片，其其便便于于对对不不同同状状态态下下的的基基因因表表达达谱谱进进行行比比较较，揭揭示示转转录录组组差差异异表表达达的的规规律律，对对探探索索发发病病机机制制、评评价价治治疗疗效效果果、筛筛选选药药物物靶靶标标具具有有重重要要意意义。义。2.用循环

26、芯片测序技术分析基因表达谱用循环芯片测序技术分析基因表达谱 运运用用循循环环芯芯片片测测序序技技术术，可可对对基基因因表表达达谱谱进进行行高高通通量量分分析析，一一次次可可完完成成几几十十万万到到几几百百万万个个DNA分分子子片片段段的的序序列列测定，从而快速获得转录组或基因组的全貌。测定，从而快速获得转录组或基因组的全貌。目录目录二、通过检测蛋白质二、通过检测蛋白质/多肽而在翻译水平多肽而在翻译水平分析基因表达分析基因表达（一）用蛋白质印迹技术检测蛋白质（一）用蛋白质印迹技术检测蛋白质/多肽多肽（二）用酶联免疫吸附实验分析蛋白质（二）用酶联免疫吸附实验分析蛋白质/多肽多肽 酶酶联联免免疫疫吸

27、吸附附实实验验（ELISA）也也是是一一种种建建立立在在抗抗原原-抗抗体体反反应应基基础础上上的的蛋蛋白白质质/多多肽肽分分析析方方法法，其主要用于测定可溶性抗原或抗体，其主要用于测定可溶性抗原或抗体，目录目录（三）用免疫组化实验原位检测组织（三）用免疫组化实验原位检测组织/细胞表达细胞表达的蛋白质的蛋白质/多肽多肽 免免疫疫组组化化实实验验包包括括免免疫疫组组织织化化学学和和免免疫疫细细胞胞化化学学实实验验，二二者者原原理理相相同同，都都是是用用标标记记的的抗抗体体在在组组织织/细细胞胞原原位位对对目目标标抗原（目标蛋白质抗原（目标蛋白质/多肽）进行定性、定量、定位检测。多肽）进行定性、定量

28、、定位检测。（四）用流式细胞术分析表达特异蛋白质的阳（四）用流式细胞术分析表达特异蛋白质的阳性细胞性细胞 流流式式细细胞胞术术（flow cytometry）通通常常利利用用荧荧光光标标记记抗抗体体与与抗抗原原的的特特异异性性结结合合，经经流流式式细细胞胞仪仪分分析析荧荧光光信信号号，根根据据细细胞胞表表达达特特定定蛋蛋白白质质的的水水平平对对某某种种蛋蛋白白质质阳阳性性细细胞胞做出判断。做出判断。目录目录（五）用蛋白质芯片和双向电泳高通量分析蛋（五）用蛋白质芯片和双向电泳高通量分析蛋白质白质/多肽表达水平多肽表达水平 1.用蛋白质芯片分析蛋白质用蛋白质芯片分析蛋白质/多肽的表达谱多肽的表达谱

29、 根根据据制制作作方方法法和和用用途途不不同同，可可将将其其分分为为蛋蛋白白质质检检测测和和功功能能芯芯片片两两大大类类。蛋蛋白白质质检检测测芯芯片片包包括括抗抗体体芯芯片片、抗抗原原芯芯片片、配配体体芯芯片片等等，它它是是将将具具有有高高亲亲和和力力的的特特异异性性探探针针分分子子固固定定在在基基片片上上，用用以以识识别别生生物物样样品品溶溶液液中中的的目目标标多多肽肽；蛋蛋白白质质功功能能芯芯片片可可用用来来研研究究蛋蛋白白质质修修饰饰、蛋蛋白白质质-蛋蛋白白质质蛋蛋白白质质-DNA蛋蛋白白质质-RNA，以以及及蛋蛋白白质质与与脂脂质质、蛋蛋白白质质与与药药物物、酶与底物、蛋白质酶与底物、

30、蛋白质-小分子等的相互作用。小分子等的相互作用。目录目录蛋白质芯片可用于检测组织蛋白质芯片可用于检测组织细胞来源的样细胞来源的样品中蛋白质的表达谱；其精确程度、信息范畴品中蛋白质的表达谱；其精确程度、信息范畴取决于芯片上已知多肽的信息多寡。取决于芯片上已知多肽的信息多寡。2.用双向电泳分析蛋白质用双向电泳分析蛋白质/多肽表达谱多肽表达谱 双向电泳可同时分离成百上千的蛋白质，双向电泳可同时分离成百上千的蛋白质，对差异表达的蛋白质进行鉴定。对差异表达的蛋白质进行鉴定。目录目录第三节第三节 基因的生物学功能鉴定技术基因的生物学功能鉴定技术目录目录一、用功能获得策略鉴定基因功能一、用功能获得策略鉴定基

31、因功能 基因功能获得策略的本质是将目的基因直基因功能获得策略的本质是将目的基因直接导入某一细胞或个体中，使其获得新的或更接导入某一细胞或个体中，使其获得新的或更高水平的表达，通过细胞或个体生物性状的变高水平的表达，通过细胞或个体生物性状的变化来研究基因功能。化来研究基因功能。方法：方法：转基因技术转基因技术基因敲入技术基因敲入技术 目录目录（一）用转基因技术获得基因功能（一）用转基因技术获得基因功能 转基因技术（转基因技术（transgenic technology）是指将外源基因导入）是指将外源基因导入受精卵或胚胎干细胞（受精卵或胚胎干细胞（embryonic stem cell），即），即

32、ES细胞，通过细胞，通过随机重组使外源基因插入细胞染色体随机重组使外源基因插入细胞染色体DNA，随后将受精卵或，随后将受精卵或ES细胞植入假孕受体动物的子宫，使得外源基因能够随细胞分裂遗细胞植入假孕受体动物的子宫，使得外源基因能够随细胞分裂遗传给后代。传给后代。转基因动物（转基因动物（transgenic animal）是指应用转基因技术培）是指应用转基因技术培育出的携带外源基因，并能稳定遗传的动物，其制备步骤主育出的携带外源基因，并能稳定遗传的动物，其制备步骤主要包括转基因表达载体的构建、外源基因的导入和鉴定、转要包括转基因表达载体的构建、外源基因的导入和鉴定、转基因动物的获得和鉴定、转基因

33、动物品系的繁育等。基因动物的获得和鉴定、转基因动物品系的繁育等。转基因转基因小鼠最为常见。小鼠最为常见。目录目录目录目录（二）用基因敲入技术获得基因的功能（二）用基因敲入技术获得基因的功能 基因敲入基因敲入（gene knock-in）是通过同源重组）是通过同源重组的方法，用某一基因替换另一基因，或将一个设的方法，用某一基因替换另一基因，或将一个设计好的基因片段插入到基因组的特定位点，使之计好的基因片段插入到基因组的特定位点，使之表达并发挥作用。表达并发挥作用。通过基因敲入可以研究特定基因在体内的功通过基因敲入可以研究特定基因在体内的功能；也可以与之前的基因的功能进行比较；或将能；也可以与之前

34、的基因的功能进行比较；或将正常基因引入基因组中置换突变基因以达到靶向正常基因引入基因组中置换突变基因以达到靶向基因治疗的目的。基因治疗的目的。目录目录基基因因敲敲入入是是基基因因打打靶靶（gene targeting）技技术术的的一一种种。基基因因打打靶靶是是一一种种按按预预期期方方式式准准确确改改造造生生物物遗遗传传信信息息的的实实验验手手段段。除除基基因因敲敲入入外外，基基因因打打靶靶还还包包括括基基因因敲敲除除、点点突突变变、缺缺失失突突变变、染染色色体体大片段删除大片段删除等。等。基基因因打打靶靶与与转转基基因因技技术术均均可可用用于于基基因因功功能能研研究究，但但二二者者的的最最大大

35、区区别别就就是是基基因因打打靶靶能能去去除除和和/或或替替换换生生物物体体内内的的固固有有基基因因，而而转转基基因因技技术术则则未未去去除除或或替替换换固固有有基基因因。目目前前，基基因因打打靶靶已已成成为为研研究究基因功能最直接和最有效的方法之一。基因功能最直接和最有效的方法之一。目录目录二、用功能失活策略鉴定基因功能二、用功能失活策略鉴定基因功能 基基因因功功能能失失活活策策略略的的本本质质是是将将细细胞胞或或个个体体的的某某一一基基因因功功能能部部分分或或全全部部失失活活后后，通通过过观观察察细细胞胞生生物物学学行行为为或或个个体体遗遗传传性性状状表表型型的的变变化化来来鉴定基因的功能。

36、鉴定基因的功能。方法：方法：基因敲除基因敲除基因沉默基因沉默 目录目录基基因因敲敲除除（gene knock-out）属属于于基基因因打打靶靶技技术术的的一一种种，其其利利用用同同源源重重组组的的原原理理，在在ES细细胞胞中中定定点点破破坏坏内内源源基基因因，然然后后利利用用ES细细胞胞发发育育的的全全能能性性，获获得得带带有有预预定定基基因因缺缺陷陷的的杂杂合合子子，通通过过遗遗传传育育种种最最终终获获得得目目的的基基因因缺缺陷陷的的纯合个体。纯合个体。（一）用基因敲除技术使基因功能完全缺失（一）用基因敲除技术使基因功能完全缺失 条条件件性性基基因因敲敲除除（conditional gene

37、 knock-out）可可以以更更加加明明确确地地在在时时间间和和空空间间上上操操作作基基因因靶靶位位，敲敲除除效效果果更更加加精精确确可可靠靠，理理论论上上可可达达到到对对任任何何基基因因在在不不同同发发育育阶阶段段和和不不同器官、组织的选择性敲除。同器官、组织的选择性敲除。目录目录目录目录（二）用基因沉默技术可使基因功能部分缺失（二）用基因沉默技术可使基因功能部分缺失 1.用用RNA干扰技术研究基因功能干扰技术研究基因功能 2.用用miRNA技术研究基因功能技术研究基因功能 3.用反义用反义RNA技术研究基因功能技术研究基因功能 4.核酶（核酶（ribozyme）技术）技术 利用利用RNA

38、i能在短时间内高效特异地抑制靶基因表能在短时间内高效特异地抑制靶基因表达的特点，可以很方便地研究基因的功能。达的特点，可以很方便地研究基因的功能。通过与通过与mRNA不完全互补配对结合而抑制翻译，不完全互补配对结合而抑制翻译，一种一种miRNA可沉默多个靶基因。可沉默多个靶基因。通过反义通过反义RNA与细胞中的与细胞中的mRNA特异性结合，从特异性结合，从而抑制相应而抑制相应mRNA的翻译。的翻译。核酶通过剪切靶核酶通过剪切靶RNA分子而抑制基因的表达。分子而抑制基因的表达。目录目录三、用随机突变筛选策略鉴定基因功能三、用随机突变筛选策略鉴定基因功能 随随机机突突变变筛筛选选策策略略的的第第一

39、一步步是是通通过过物物理理诱诱变变、化化学学诱诱变变或或生生物物技技术术产产生生大大量量的的基基因因组组DNA突突变变。乙乙基基亚亚硝硝基基脲脲（ENU）是是一一种种化化学学诱诱变变剂剂，它它通通过过对对基基因因组组DNA碱碱基基的的烷烷基基化化修修饰饰，诱诱导导DNA在在复复制制时时发发生生错错配配而而产产生生突突变变。它它主主要要诱诱发发单单碱碱基基突突变变，造造成成单单个个基基因因发发生生突突变变。ENU的的突突变变效效率率非常高。非常高。基基因因捕捕获获（gene trapping）技技术术也也是是一一种种产产生生大大规规模模随随机机插插入入突突变变的的便便利利手手段段，对对于于揭揭示示基基因序列所对应的基因功能具有重要的应用价值。因序列所对应的基因功能具有重要的应用价值。