基因工程第三章克隆载体.ppt

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1、什么是病毒什么是病毒?病毒：由病毒：由DNA（或（或RNA）和外壳蛋白组成，）和外壳蛋白组成，经包装后成为病毒颗粒。经包装后成为病毒颗粒。1/311 1噬菌体的溶原性周期和溶菌性周期 天天然然的的转转基基因因过过程程2/312 2 噬菌体（Bacteriophage lambda）头部尾部尾丝3/313 3（1）DNA：线状，双链DNA，48502bp（linear，double-stranded DNA，dsDNA）cos位点：位点：DNA两端各有12bp的粘性末端，两者互补，进入宿主后可连成环状DNA。1.1、噬菌体的性质4/314 4宿主细胞头部尾部尾丝DNA5/315 56/316 6

2、（2）DNA 有有56个限制酶识别序列，个限制酶识别序列，50个基因，个基因，左臂，右臂和中央片段，中央片段可以被替代。左臂，右臂和中央片段，中央片段可以被替代。Cos头部合成尾部合成删除与结合重组DNA合成晚期控制阻遏阻遏早期控制溶菌成熟左臂 left arm右 臂 right arm中央片段 central stuffer7/317 7(3)、噬菌体的侵染8/318 81.2、噬菌体载体的构建噬菌体载体的构建（1）切去）切去DNA的中央片段的中央片段BamHI sitesLeft armRight armCOSCOSBamHICOSCOSLRCOSCOSLR回收9/319 9（2）插入标记

3、基因（）插入标记基因（marker gene）例如：例如：lacZ 基因，转化的菌斑在含有基因，转化的菌斑在含有X-gal的的培养基因上表现篮色培养基因上表现篮色.10/311010（3）插入外源基因（）插入外源基因（foreign gene）可插入可插入20kb的的目的基因。目的基因。11/311111部分消化DNA ligase基因组DNACOSCOSLRAim geneLRAim geneCOS12/3120kb的的DNA片段片段1212（4）建立）建立DNA体外包装系统（体外包装系统（packing system）包装后方可侵染包装后方可侵染.13/311313重组的噬菌体重组的噬菌体

4、体外包装体外包装14/3114142 2、柯斯质粒载体（柯斯质粒载体（Cosmid vectorCosmid vector）2.1 2.1 含义：含有含义：含有噬菌体粘性末端（噬菌体粘性末端（cos位点）位点）的质粒，又称粘粒的质粒，又称粘粒2.2 2.2 特点：特点：l带有带有coscos 位点位点l4-6kb4-6kbl有标记基因有标记基因l常用于构建常用于构建cDNAcDNA文库（文库（cDNAcDNA library library）l可携带大的基因片段，可携带大的基因片段，45kb45kb。2.3 2.3 构建过程构建过程15/311515体外包装体外包装16/311616基因整合平

5、台系统：包括整合平台和定位整合克基因整合平台系统：包括整合平台和定位整合克隆载体。隆载体。整合平台：受体细胞基因组上给定的一个整合平台：受体细胞基因组上给定的一个DNA区区域，是外源域，是外源DNA定位整合的位置。定位整合的位置。定位整合克隆载体：质粒克隆载体，有一个或两定位整合克隆载体：质粒克隆载体，有一个或两个与整合平台个与整合平台DNA区域同源的区域同源的DNA片段。片段。17/311717一、定位整合模式一、定位整合模式Foreign DNAHomologous sequenceVector DNAGenome DNA of receptor cellGenome DNA of rec

6、eptor cellHomologous sequenceVector DNA18/311818与受体细胞和同源序列长短有关，一般较与受体细胞和同源序列长短有关，一般较低低(10-7-10-3).会出现随机插入，筛选困难。会出现随机插入，筛选困难。二、定位整合效率二、定位整合效率19/3119191 定义定义酵母人工染色体：具有酵母染色体的着酵母人工染色体：具有酵母染色体的着丝粒（丝粒（cen4）、自主复制序列）、自主复制序列(ARS1)和端粒等功能序列的质粒载体。和端粒等功能序列的质粒载体。可容纳可容纳1000至至3000kb的的DNA大片段。大片段。第四节第四节 YAC YAC克隆载体克隆

7、载体20/312020是是Yeast和和E.coli.的的穿梭载体穿梭载体(shuttle vector)YAC在在E.coli.中按质粒形式复制，转入酵母菌后中按质粒形式复制，转入酵母菌后按染色体形式复制。按染色体形式复制。穿梭载体穿梭载体:含有不止一个复制起始位点、能携带插含有不止一个复制起始位点、能携带插入序列在不同种类宿主细胞中繁殖的载体入序列在不同种类宿主细胞中繁殖的载体21/312121着丝粒端粒自主复制序列22/31端粒E.coli.origin of replicationmarker genes in yeastmarker genes In E.coli.marker ge

8、nes in yeast2222外源基因EcoRI23/31YAC克隆载体的构建克隆载体的构建23232 应用应用 2.1 构建基因组文库（构建基因组文库（genome library）：）：特别适于动植物等基因组较大的生物。特别适于动植物等基因组较大的生物。2.2、基因治疗、基因治疗(Gene therapy)：可复制，安全可复制，安全 24/312424一、启动子探针型载体一、启动子探针型载体质粒载体，含有一个检测部件（一个无转质粒载体，含有一个检测部件（一个无转录功能的标记基因和克隆位点）录功能的标记基因和克隆位点）25/312525The gene which can not expr

9、essGFP geneMultiple cloning sitesAMPr26/312626二、诱导型表达载体：二、诱导型表达载体：启动子在特殊的诱导条件下才有转录活性。启动子在特殊的诱导条件下才有转录活性。外源基因处于这样的启动子下，必须有诱外源基因处于这样的启动子下，必须有诱导条件才能表达。导条件才能表达。优点：易于人的控制，安全，可用于基因优点：易于人的控制，安全，可用于基因治疗。治疗。27/312727三、组织特异性表达载体三、组织特异性表达载体只能在特定组织中表达的载体。只能在特定组织中表达的载体。乳腺组织特异性表达载体：利用牛、羊等乳腺组织特异性表达载体：利用牛、羊等动物的乳腺产生

10、药物。动物的乳腺产生药物。肿瘤细胞特异性表达载体：基因治疗药物肿瘤细胞特异性表达载体：基因治疗药物的定向导入。的定向导入。28/312828四、分泌型表达载体四、分泌型表达载体基因表达的蛋白可分泌到胞外，利于产物基因表达的蛋白可分泌到胞外，利于产物分离纯化。分离纯化。29/312929本章主要内容小结：1.常用质粒载体、Ti质粒载体。2.病毒载体3.染色体定位整合载体4.酵母人工染色体载体5.特殊用途的克隆载体上述载体的结构特点及构建方法及原理。课后到“生物工程学院网站主页”中精品课程中的基因工程原理网络课程中复习30/313030复习题1.什么是质粒，质粒载体，如何构建质粒载体?2.Ti质粒载体的构建方法及其步骤？3.噬菌体载体的构建步骤噬菌体载体的构建步骤?4.染色体定位整合载体的原理？染色体定位整合载体的原理？31/313131