工业微生物的菌种选育与保藏.ppt

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1、工业微生物的菌种选育与保藏第一节菌种的分离简介 一、菌种的来源一、菌种的来源一、菌种的来源一、菌种的来源n n根根据据资资料料直直接接向向有有科科研研单单位位、高高等等院院校校、工工厂厂或菌种保藏部门索取或购买；或菌种保藏部门索取或购买；n n从大自然中分离筛选新的微生物菌种。从大自然中分离筛选新的微生物菌种。二、分离思路 n n新新菌菌种种的的分分离离是是要要从从混混杂杂的的各各类类微微生生物物中中依依照照生生产产的的要要求求、菌菌种种的的特特性性，采采用用各各种种筛筛选选方方法法，快速、准确地把所需要的菌种挑选出来。快速、准确地把所需要的菌种挑选出来。n n实实验验室室或或生生产产用用菌菌

2、种种若若不不慎慎污污染染了了杂杂菌菌，也也必必须重新进行分离纯化。须重新进行分离纯化。n n有了优良的菌种，还要有合适的工艺条件和合有了优良的菌种，还要有合适的工艺条件和合理先进的设备与之配合。理先进的设备与之配合。n n定方案：定方案：定方案：定方案：首先要查阅资料，了解所需菌种的生长培养特性。首先要查阅资料，了解所需菌种的生长培养特性。n n采样：采样：采样：采样：有针对性地采集样品。有针对性地采集样品。n n增增增增殖殖殖殖：人人为为地地通通过过控控制制养养分分或或培培条条件件，使使所所需需菌菌种种增增殖殖培培养养后后，在数量上占优势。在数量上占优势。n n分离：分离：分离：分离：利用分

3、离技术得到纯种。利用分离技术得到纯种。n n发发发发酵酵酵酵性性性性能能能能测测测测定定定定：进进行行生生产产性性能能测测定定。这这些些特特性性包包括括形形态态、培培养养特特征征、营营养养要要求求、生生理理生生化化特特性性、发发酵酵周周期期、产产品品品品种种和和产产量量、耐耐受最高温度、生长和发酵最适温度、受最高温度、生长和发酵最适温度、最适最适pHpH值、提取工艺等。值、提取工艺等。三、新种分离与筛选的步骤三、新种分离与筛选的步骤（一）采样1 1、采样对象、采样对象以采集以采集土壤土壤土壤土壤为主。为主。田园土和耕作过的沼泽土中，以细菌和放线菌为主。田园土和耕作过的沼泽土中，以细菌和放线菌为

4、主。富富含含碳碳水水化化合合物物的的土土壤壤和和沼沼泽泽地地中中，酵酵母母和和霉霉菌菌较较多，如一些野果生长区和果园内。多，如一些野果生长区和果园内。采样的对象也可以是植物，腐败物品，某些水域等。采样的对象也可以是植物，腐败物品，某些水域等。从自然界筛选从自然界筛选n n2 2、采样季节：以温度适中，雨量不多的秋初为好。、采样季节：以温度适中，雨量不多的秋初为好。n n3 3、采采土土方方式式：在在选选好好适适当当地地点点后后，用用小小铲铲子子除除去去表表土土，取取离离地地面面5-15cm5-15cm处处的的土土约约10g10g，盛盛入入清清洁洁的的牛牛皮皮纸纸袋袋或或塑塑料料袋袋中中，扎扎好

5、好，标标记记，记记录录采采样样时时间间、地地点点、环环境境条条件件等等，以以备备查查考考。为为了了使使土土样样中中微微生生物物的的数数量量和和类类型型尽尽少少变变化化，宜宜将将样样品品逐逐步步分批寄回，以便及时分离。分批寄回，以便及时分离。（二）增殖培养n n 为为了了容容易易分分离离到到所所需需的的菌菌种种，让让无无关关的的微微生生物物至至少少是是在在数数量量上上不不要要增增加加，可可以以通通过过配配制制选选择性培养基，选择一定的培养条件来控制。择性培养基，选择一定的培养条件来控制。n n 例例如如碳碳源源利利用用的的控控制制，可可选选定定糖糖，淀淀粉粉、纤纤维维素素，或或者者石石油油等等，

6、以以其其中中的的一一种种为为唯唯一一碳碳源源，那那么么只只有有利利用用这这一一碳碳源源的的微微生生物物才才能能大大量量正正常常生生长长，而而其其它它微微生生物物就就可可能能死死亡亡或或淘淘汰汰。这这样样对下阶段的纯种分离就会顺利得多。对下阶段的纯种分离就会顺利得多。（三）培养分离n n尽尽管管通通过过增增殖殖培培养养效效果果显显著著，但但还还是是处处于于微微生生物物的的混混杂杂生生长长状状态态。因因此此还还必必须须分分离离，纯纯化化。在在这这步步，增增殖殖培培养养的的选选择择性性控控制制条条件件还还应应进进一一步步应应用用，而而且且控控制制得得细细一一点点，好好一一点点。纯纯种种分分离离的的方

7、方法法有有划划线分离法、稀释分离法。线分离法、稀释分离法。划划线线分分离离法法稀稀释释分分离离法法（四）筛选 n n这这一一步步是是采采用用与与生生产产相相近近的的培培养养基基和和培培养养条条件件，通通过过三三角角瓶瓶的的容容量量进进行行小小型型发发酵酵试试验验，以以求求得得适适合于工业生产用菌种。合于工业生产用菌种。（五）毒性试验n n 自自然然界界的的一一些些微微生生物物是是在在一一定定条条件件下下产产毒毒的的，将将其其作作为为生生产产菌菌种种应应当当十十分分当当心心，尤尤其其与与食食品品工工业业有有关关的的菌菌种种，更更应应慎慎重重。据据有有的的国国家家规规定定，微微生生物物中中除除啤啤

8、酒酒酵酵母母、脆脆壁壁酵酵母母、黑黑曲曲霉霉、米米曲曲霉霉和和枯枯草草杆杆菌菌作作为为食食用用无无须须作作毒毒性性试试验验外外，其其他他微微生物作为食用，均需通过两年以上的毒性试验。生物作为食用，均需通过两年以上的毒性试验。第二节培养分离n n 从从自自然然界界中中分分离离培培养养微微生生物物是是菌菌种种选选育育的的重重要要和和基基础础的步骤。的步骤。n n 到到目目前前为为止止，还还没没有有一一种种分分离离培培养养方方法法能能揭揭示示一一个个试试样中所包含的所有微生物总数和种类。样中所包含的所有微生物总数和种类。n n在在任任一一试试样样中中所所存存在在的的微微生生物物仅仅为为极极少少数数特

9、特定定种种类类的的菌菌株株；在在工工业业微微生生物物筛筛选选过过程程中中，应应及及时时调调整整检检测测方方法法，以与各种不同类型的生长和代谢之微生物相适应。以与各种不同类型的生长和代谢之微生物相适应。一、成功的分离培养方法(1)(1)认真考它所需产品的特征和生产过程；认真考它所需产品的特征和生产过程；(2)(2)制订初步的筛选标准；制订初步的筛选标准；(3)(3)将生态学方法运用到分离和筛选过程。将生态学方法运用到分离和筛选过程。二、培养分离中要解决的问题二、培养分离中要解决的问题1 1、“分离什么和从哪里分离出分离什么和从哪里分离出?”?”2 2、必必须须充充分分考考虑虑所所分分离离微微生生

10、物物的的生生产产能能力力、生生长长速速度度、生生物物群群体体培培养养和和产产品品生生产产工工艺艺及及其其提提纯纯的的难难易易和和费费用用，工工业业生生产产发发酵酵罐罐中中稳稳定定性及遗传操作的难易程度等。性及遗传操作的难易程度等。3 3、选择适宜的培养分离方法和检测方法。、选择适宜的培养分离方法和检测方法。三、将生态学方法用于培养分离的一般思路要点n n1 1罗列出所要分离的微生物类群；罗列出所要分离的微生物类群；n n2 2根根据据所所采采集集样样本本的的各各种种生生态态参参数数，描描述述所所要要分分离离的的微微生物之生态系统或栖息地：生物之生态系统或栖息地：n n3 3将将若若干干样样本本

11、分分成成若若干干类类型型，如如植植物物和和植植物物各各部部，土土壤壤(类型和土层类型和土层)、岩石、水、昆虫和发酵食品等；、岩石、水、昆虫和发酵食品等；n n4 4罗罗列列出出所所要要考考察察和和测测量量的的环环境境参参数数，如如pHpH、盐盐分分、水水分、氧化还原电势及温度等；分、氧化还原电势及温度等；5 5列出生物系统中有用的自然底物，如森林土壤中的列出生物系统中有用的自然底物，如森林土壤中的几丁质、葡萄表皮的果胶；几丁质、葡萄表皮的果胶；66根据上述根据上述1-51-5项中所获得的数据，设计分离方法，即项中所获得的数据，设计分离方法，即选择适宜的稀释液、底物、试样、天然浸出汁和培养条选择

12、适宜的稀释液、底物、试样、天然浸出汁和培养条件；件；77用标准方法作对照来评价生态学分离方法；用标准方法作对照来评价生态学分离方法；88根据待检材料的生态参数需要，修改已知的方法；根据待检材料的生态参数需要，修改已知的方法；99运用特定的富集方法，富集那些可能具有筛选意义的运用特定的富集方法，富集那些可能具有筛选意义的微生物类群。微生物类群。四、自然界中细菌的分离(一)采样和采集方法n n为为了了从从一一特特定定生生态态系系统统中中分分离离出出具具有有代代表表性性的的细细菌菌菌菌群群，特特别别是是分分离离那那些些在在唯唯一一微微环环境境区区域域中出现的菌群时，必须十分重视样本的采集。中出现的菌

13、群时，必须十分重视样本的采集。n n样样本本采采集集时时所所需需的的工工具具通通常常有有无无菌菌刮刮铲铲、土土样样采采集集器器、镊镊子子、解解剖剖刀刀、手手套套、无无菌菌小小塑塑料料袋袋和塑料瓶等。和塑料瓶等。采样的注意事项1 1、采样时应尽可能保持相对无菌；、采样时应尽可能保持相对无菌；2 2、所采集的样本必须具有某种代表性；、所采集的样本必须具有某种代表性；3 3、采采好好的的样样必必须须完完整整地地标标上上样样本本的的种种类类及及采采集集日日期期、地地点点以以及及采采集集地地点点的的地地理理、生生态态参参数数等；等；4 4、应应充充分分考考虑虑采采样样的的季季节节性性和和时时间间因因素素

14、，因因为为真正的原地菌群的出现可能是短暂的；真正的原地菌群的出现可能是短暂的；n n5 5、采好的样应及时处理，暂不能处理的也应、采好的样应及时处理，暂不能处理的也应贮存于贮存于44下，但贮存时间不宜过长。这是因下，但贮存时间不宜过长。这是因为一旦采样结束，试样中的微生物群体就脱为一旦采样结束，试样中的微生物群体就脱离了原来的生态环境，其内部生态环境就会离了原来的生态环境，其内部生态环境就会发生变化，微生物群体之间就会出现消长发生变化，微生物群体之间就会出现消长1土样采集方法n n森森林林、旱旱地地，草草地地可可先先掘掘洞洞，由由土土壤壤下下层层向向上上层层顺顺序序采采集；集；n n水水田田等

15、等浸浸水水土土壤壤在在不不损损土土层层结结构构的的情情况况下下插插入入圆圆筒筒采采集集。如如果果层层次次要要求求不不严严格格，可可取取离离地地面面5 515cm15cm处处的的土土。将将采集到的土样盛入聚乙烯袋或玻璃瓶中。采集到的土样盛入聚乙烯袋或玻璃瓶中。n n在在采采集集植植物物根根际际土土样样时时，一一般般方方法法是是自自土土壤壤中中慢慢慢慢拔拔出出植植物物根根，在在大大量量无无菌菌水水中中浸浸渍渍约约20min20min，洗洗去去粘粘附附在在根根上上的的土土壤壤，然然后后再再用用无无菌菌水水漂漂洗洗下下根根部部残残留留的的土土，这这部部分上却为根际土样。分上却为根际土样。2植物体采集方

16、法n n 在在采采集集叶叶面面时时，一一般般是是用用灭灭菌菌的的剪剪刀刀、打打孔孔器器、安安全全刀刀片片等等，由由几几片片新新鲜鲜叶叶片片的的同同一一部部位位切取一小块，并注意不要损伤周围边缘。切取一小块，并注意不要损伤周围边缘。n n选选择择叶叶面面时时应应考考虑虑叶叶位位、叶叶龄龄、叶叶片片正正反反面面和和在一片叶上的取样部位。在一片叶上的取样部位。n n采采集集植植物物根根及及根根系系时时，方方法法与与根根际际土土样样采采集集方方法法相相似似。将将洗洗净净的的根根装装入入采采样样袋袋中中，采采集集根根系系时，一般与根际土样一起保存。时，一般与根际土样一起保存。3水样采集方法n n用用于于

17、细细菌菌检检测测的的水水样样应应收收集集于于100m1100m1干干净净、灭灭菌菌的的广广口口塑料瓶中。塑料瓶中。n n由由于于表表层层水水中中含含有有泥泥沙沙，故故在在采采样样时时应应在在较较深深的的静静水水层层中采集水样。中采集水样。n n方方法法是是：握握住住采采样样瓶瓶底底浸浸入入水水中中30-50cm30-50cm处处，然然后后瓶瓶口口朝朝下下打打开开瓶瓶盖盖，让让水水样样进进入入。如如果果有有急急流流存存在在的的话话，应应直直接接将将瓶瓶口口反反向向于于急急流流。采采集集瓶瓶从从水水中中取取出出时时应应迅迅速速并并带带有有较较大大的的弧弧度度。水水样样不不应应装装满满采采样样瓶瓶。

18、所所有有水水样样都都应应在在24h24h之内迅速进行检测，或者之内迅速进行检测，或者44下贮存。下贮存。(二)生态学参数及培养基的组成原则1 1、加加入入培培养养基基中中的的天天然然提提取取物物种种类类和和用用量量、环环境境生生物物物物理理学学参参数数以以及及用用于于平平板板涂涂布布分分离离样样本本的的溶溶剂剂都都会会影影响响实实验验中中所所要要分分离离的的细细菌菌的的数数量量和种类。和种类。2 2、就就分分离离培培养养基基的的组组成成而而言言，部部分分培培养养基基中中必必须须含含有有10-50%10-50%的的天天然然提提取取物物。加加入入培培养养基基中中的的天天然然提提取取物物，部部分分培

19、培养养基基中中则则应应含含有有多多种种碳碳、氮源，如几丁质、纤维素或果胶。氮源，如几丁质、纤维素或果胶。3 3、所有分离培养基中都应含有抗真菌剂、所有分离培养基中都应含有抗真菌剂(如放线菌如放线菌酮和制霉素酮和制霉素)，掺加浓度一般为，掺加浓度一般为50g50gm1m1，以抑以抑制真菌的生长。制真菌的生长。4 4、琼脂平板在使用前应置于、琼脂平板在使用前应置于3737培养箱中孵育培养箱中孵育l l2 2天。天。5 5、培养基的生物物理学参数，如、培养基的生物物理学参数，如pHpH及盐分也应调及盐分也应调节到与试样的生态系统参数值相近。节到与试样的生态系统参数值相近。土中细菌的富集培养与分离土中

20、细菌的富集培养与分离n n分离土样中的大部分细菌的分离程序中无需分离土样中的大部分细菌的分离程序中无需进行富集。进行富集。n n但但对对某某些些少少数数细细菌菌则则要要求求特特殊殊的的富富集集或或选选择择技术才能很好地被分离培养。技术才能很好地被分离培养。富集方法n n运用细菌的酶诱导性，在分离培养基中添加若干运用细菌的酶诱导性，在分离培养基中添加若干抗生素、复杂底物及生长因子的前体物质来激活抗生素、复杂底物及生长因子的前体物质来激活细菌某一特殊基因组，可以建立起若干富集技术。细菌某一特殊基因组，可以建立起若干富集技术。n n富集可以促进抗性的产生并维持下来。富集可以促进抗性的产生并维持下来。

21、n n土样中细菌的富集：适度稀释后，取土样中细菌的富集：适度稀释后，取0.1m10.1m1涂布已添涂布已添加及未添加富集底物加及未添加富集底物(如几丁质、纤维素等如几丁质、纤维素等)的土浸出的土浸出汁平板。汁平板。n n植物体上细菌的分离：无菌富集，加植物浸出液适植物体上细菌的分离：无菌富集，加植物浸出液适度培养取样，洗涤，取度培养取样，洗涤，取1ml1ml经适度稀释后涂布平板。经适度稀释后涂布平板。n n水中细菌的分离：水样通过水中细菌的分离：水样通过0.22m0.22m无菌滤膜，取出无菌滤膜，取出滤膜用滤膜用1ml1ml无菌稀释液将滤膜上的沉积洗下。用样本无菌稀释液将滤膜上的沉积洗下。用样

22、本稀释液适度稀释稀释液适度稀释,涂布平板倒置培养或滤纸压印分离涂布平板倒置培养或滤纸压印分离法。法。水中细菌分离的简易富集技术n n 在在无无菌菌的的、用用棉棉团团塞塞好好的的广广口口三三角角烧烧瓶瓶中中连连续续培培养养，定定期取样涂布适宜分离琼脂平板上；期取样涂布适宜分离琼脂平板上；n n在在不不同同水水体体的的水水样样中中加加入入一一定定的的底底物物如如蔗蔗糖糖、多多糖糖及及蛋蛋白白质等，同样可以促进水中微生物的增殖。质等，同样可以促进水中微生物的增殖。n n培养过程中可加入低浓度的抗真菌剂以抑制真菌的生长。培养过程中可加入低浓度的抗真菌剂以抑制真菌的生长。n n另另一一富富集集方方法法是

23、是在在培培养养烧烧瓶瓶中中添添加加细细菌菌“附附着着材材料料”，如如无无菌的植物组织或土壤浸出液。菌的植物组织或土壤浸出液。n n通通过过改改变变培培养养温温度度和和培培养养周周期期可可选选择择性性富富集集嗜嗜冷冷性性细细菌菌、中温菌和嗜高温菌。中温菌和嗜高温菌。次代培养及纯化步骤 1 1、涂涂布布的的平平板板经经培培养养后后，如如生生长长出出菌菌落落，则则按按涂涂布布不不同同稀稀释释度度的的稀稀释释液液所所得得的的单单菌菌菌菌落落和和多多菌菌菌菌落落对对琼琼脂脂平平板板进行分类。进行分类。2 2、用用无无菌菌牙牙签签将将菌菌落落转转接接到到筛筛选选平平板板上上及及转转接接至至添添加加有有少少

24、量天然浸出液的适宜保藏琼脂斜面上。量天然浸出液的适宜保藏琼脂斜面上。3 3、筛筛选选平平板板经经培培养养后后，按按生生长长出出菌菌落落的的形形态态学学特特征征如如色色素素、菌落形态等进行最初分组。菌落形态等进行最初分组。4 4、将将认认为为有有希希望望的的菌菌落落用用牙牙签签转转接接到到另另一一模模拟拟分分离离琼琼脂脂平平板上进行筛选。板上进行筛选。五、放线菌的分离(一一)采样及采集方法采样及采集方法n n应尽可能实行无菌操作。应尽可能实行无菌操作。n n所采集的样本应具有一定的代表性。所采集的样本应具有一定的代表性。n n样样本本采采集集完完后后，应应及及时时处处理理或或在在44下下贮贮存存

25、，贮贮存存试试样样处处应应与与划划线线，筛筛选选平平板板分分开开，贮贮存存时时间间不不宜宜过长。过长。(二)生态学参数n n 放放线线菌菌分分离离培培养养过过程程中中所所需需考考虑虑的的生生态态参参数数有有温温度度、pHpH、离离子子强强度度、氧氧化化还还原原电电势势和和底物浓度。底物浓度。（三）培养基的组成原则n n大大多多数数放放线线菌菌的的分分离离培培养养是是在在贫贫脊脊或或复复杂杂底底物物的的琼琼脂脂平平板板上上进进行行的的。除除嗜嗜温温性性放放线线菌菌外外，其其他他放放线线菌菌一一般般在培养在培养4-204-20天内在分离平板上缓慢形成菌落。天内在分离平板上缓慢形成菌落。n n在在放

26、放线线菌菌分分离离琼琼脂脂中中通通常常都都加加入入抗抗真真菌菌剂剂制制霉霉菌菌素素或或放线菌酮，以抑制真菌的繁殖。放线菌酮，以抑制真菌的繁殖。n n选择性地添加抗生素。选择性地添加抗生素。n n分分离离琼琼脂脂平平板板制制备备好好后后，一一般般皆皆应应在在3737培培养养箱箱中中存存放放3 3天。天。放线菌的分离n n土样中放线菌的非选择性分离：土样风干，磨碎，土样中放线菌的非选择性分离：土样风干，磨碎，无菌海绵压印土样后压印平板后培养。无菌海绵压印土样后压印平板后培养。n n植物体上放线菌的分离：无菌取植物组织，干燥以植物体上放线菌的分离：无菌取植物组织，干燥以减少细菌数量，剪碎植物材料后植

27、入平板表层后培减少细菌数量，剪碎植物材料后植入平板表层后培养。也可洗下微生物后振荡培养。养。也可洗下微生物后振荡培养。n n水中放线菌的分离：水中放线菌的分离：为使所要分离的放线菌的数量为使所要分离的放线菌的数量种类增多，一般将水样离心或滤纸过滤，取离心沉种类增多，一般将水样离心或滤纸过滤，取离心沉积或滤纸表面沉积进行系列稀释和涂布。积或滤纸表面沉积进行系列稀释和涂布。次代培养及纯化n n菌菌落落形形成成后后可可根根据据肉肉眼眼可可见见的的菌菌落落形形态态上上的的差差异异，作作初初步步的鉴定和区分。的鉴定和区分。n n通过高倍放大进行镜检，可了解气生和营养孢子形成情况。通过高倍放大进行镜检，可

28、了解气生和营养孢子形成情况。n n成成功功地地分分离离出出各各种种不不同同的的放放线线菌菌属属及及种种的的关关键键是是所所采采集集样样本本的的本本身身及及其其分分离离用用的的琼琼脂脂培培养养基基；而而肉肉眼眼识识别别不不同同的的生生长长形形态态、从从而而初初步步地地加加以以鉴鉴定定，在在分分离离放放线线菌菌时时显显得得尤为重要。尤为重要。n n将将分分离离平平板板上上所所形形成成的的菌菌落落用用经经火火焰焰灼灼烧烧灭灭菌菌的的钩钩形形针针或或无无菌菌牙牙签签挑挑取取，点点接接到到琼琼脂脂平平板板上上进进行行影影印印培培养养，以以进进一步筛选和分离。一步筛选和分离。六、真菌分离、真菌分离1 1、

29、利利用用低低碳碳氮氮比比的的培培养养基基可可使使真真菌菌生生长长菌菌落落分分散散，利利于于计计数数，分分离离和和鉴鉴定定。这这里里主主要要是是利利用用营营养养成成分分的的减减少少而而使使生生长长减减慢慢，并并由由此此限限制制真真菌的迁涉生长。菌的迁涉生长。2 2、改变培养温度将有利于不同嗜温区真菌的分离。、改变培养温度将有利于不同嗜温区真菌的分离。3 3、有有时时，真真菌菌子子实实体体形形成成必必须须有有光光线线，这这在在分分离离培养时应加以考虑。培养时应加以考虑。4 4、选择性富集：是通过一定的方式使样本中一种、选择性富集：是通过一定的方式使样本中一种或一群微生物数量上的增加而利于分离的一种

30、技或一群微生物数量上的增加而利于分离的一种技术。术。富集可以是种水平的，如通过营养要求的改变富集可以是种水平的，如通过营养要求的改变来富集分离镰刀菌；也可以是组成群水平的，如来富集分离镰刀菌；也可以是组成群水平的，如以纤维素为唯一碳源的选择性培养基可选择性富以纤维素为唯一碳源的选择性培养基可选择性富集所有能降解纤维素的纤维素裂解微生物。集所有能降解纤维素的纤维素裂解微生物。5 5、选择性抑制培养基可使非目标微生物消除或减、选择性抑制培养基可使非目标微生物消除或减少到一定程度。在分离培养基中加入一定的抗生少到一定程度。在分离培养基中加入一定的抗生素即可有效地抑制细菌生长及菌落形成。素即可有效地抑

31、制细菌生长及菌落形成。真菌的分离方法n n土土中中真真菌菌的的分分离离：稀稀释释法法，混混入入法法，压压贴贴法法，粘粘附附法法，浮浮选法，注射器采集法，土过筛法，庶糖密度梯度离心法。选法，注射器采集法，土过筛法，庶糖密度梯度离心法。n n植植物物材材料料中中真真菌菌的的分分离离：植植入入法法，压压贴贴法法，洗洗涤涤法法，浸浸泡泡法。法。n n水水中中真真菌菌的的分分离离：水水样样稀稀释释后后涂涂布布分分离离。饵饵诱诱技技术术常常用用于于水中真菌的富集。水中真菌的富集。n n子子实实体体直直接接分分离离培培养养担担子子菌菌：新新采采集集的的子子实实体体组组织织植植入入平平板内或在放于液体培养基表

32、面放一小块无菌滤纸上培养。板内或在放于液体培养基表面放一小块无菌滤纸上培养。七、生产选种n n 是是在在长长年年累累月月的的生生产产实实践践中中，在在培培养养工工艺艺条条件件没没有有任任何何可可见见变变更更情情况况下下，突突然然发发现现某某些些批批次次生生产产水水平平提提高高较较大大，这这就就有有可可能能是是个个别别自自然然变变异异朝朝更更好好的的方方向向变变的的细细胞胞，在在这这种种条条件件下下很很适适应应于于培培养养条条件件，并并逐逐渐渐显显示示出出它它的的生生长长优优势势，这这种种优优势势的的发发展展，促促使使它它优优良良的的生生产产性性能能表露。表露。n n进进行行类类似似新新种种筛筛

33、选选分分离离，达达到到获获得得新新的的优优良良生生产菌种的目的。产菌种的目的。第三节 工业菌种的育种方针n n工业菌种的育种：工业菌种的育种：是是运运用用遗遗传传学学原原理理和和技技术术对对某某个个用用于于特特定定生生物物技技术术目目的的的的菌菌株株进进行行的的多多方方位位的的改改造造。通通过过改改造造，可可使使现现存存的的优优良良性性状状强强化化，或或去去除除不不良性质或增加新的性状。良性质或增加新的性状。工业菌种育种的方法n n诱变n n基因转移n n基因重组育种过程n n包括下列包括下列3 3个步骤：个步骤：n n(1)(1)在在不不影影响响菌菌种种活活力力的的前前提提下下，有有益益基基

34、因因型型的的引引入。入。n n(2)(2)希望基因型的选出。希望基因型的选出。n n(3)(3)改改良良菌菌种种的的评评价价(包包括括实实验验规规模模和和工工业业生生产产规规模模)。选择育种方法时综合考虑的因素(1)(1)待待改改良良性性状状的的本本质质及及与与发发酵酵工工艺艺的的关关系系(如如批批式或连续发酵试验式或连续发酵试验)；(2)(2)对对这这一一特特定定菌菌种种的的遗遗传传和和生生物物化化学学万万面面认认识识的明了程度；的明了程度；(3)(3)经济费用。经济费用。n n如如果果对对特特定定菌菌种种的的基基本本性性状状及及其其工工艺艺知知晓晓甚甚少少，则多半采用随机诱变、筛选及选育等

35、技术：则多半采用随机诱变、筛选及选育等技术：n n如如果果对对其其遗遗传传及及生生物物化化学学方方面面的的性性状状已已有有较较深深的的认认识识，则则可可选选择择基基因因重重组组等等手手段段进进行行定定向向育育种。种。工业菌种改良方法(1)(1)解解除除或或绕绕过过代代谢谢途途径径中中的的限限速速步步骤骤：通通过过增增加加特特定定基基因因的的拷拷贝贝数数或或增增加加相相应应基基因因的的表表达达能能力力来来提提高高限限速速酶酶的的含含量量；在在代代谢谢裔裔途途径径中中引引伸伸出出新的代谢步骤，由此提供一个旁路代谢途径。新的代谢步骤，由此提供一个旁路代谢途径。(2)(2)增加前体物的浓度。增加前体物

36、的浓度。(3)(3)改改变变代代谢谢途途径径，减减少少无无用用副副产产品品的的生生成成以以及及提提高高菌菌种种对对高高浓浓度度的的有有潜潜在在毒毒性性的的底底物物、前前体体或或产品的耐受力。产品的耐受力。(4)(4)抑制或消除产品分解酶。抑制或消除产品分解酶。(5)(5)改进菌种外泌产品的能力。改进菌种外泌产品的能力。(6)(6)消消除除代代谢谢产产品品的的反反馈馈抑抑制制。如如诱诱导导代代谢谢产产品品的的结结构类似物抗性。构类似物抗性。提高特定基因的表达水平n n(1)(1)引引入入强强转转录录及及翻翻译译信信号号，可可通通过过在在一一高高效效表表达达载载体体上上克克隆隆靶靶基基因因；在在靶

37、靶基基因因的的上上游游引引入入强强启启动动子子；修修改改现现有有表表达达信信号号，提提高基因效力等。高基因效力等。n n(2)(2)诱导解除基因表达抑制的突变。诱导解除基因表达抑制的突变。改进菌种的生长效率n n提高菌株对底物的利用率方法：提高菌株对底物的利用率方法：n na.a.通过确定并改变代谢中的耗能部分通过确定并改变代谢中的耗能部分;n nb.b.由另一菌株的高效低能代谢途径代谢来实现。由另一菌株的高效低能代谢途径代谢来实现。n n c.c.赋赋予予菌菌种种对对多多种种底底物物，特特别别是是价价廉廉而而丰丰富富的的底底物的利用能力，由此可降低操作费用。物的利用能力，由此可降低操作费用。

38、第四节 诱变育种n n以以微微生生物物的的自自然然变变异异作作为为基基础础的的生生产产选选种种的的机机率率并并不不很很高高，一一个个基基因因的的自自然然突突变变频频率率仅仅10-6-10-1010-6-10-10左右。左右。n n诱诱变变育育种种：以以诱诱发发突突变变为为基基础础的的育育种种，是是迄迄今今为为止国内外提高菌种产量、性能的主要手段。止国内外提高菌种产量、性能的主要手段。诱变诱变物理、化学或生物诱变方法物理、化学或生物诱变方法 一、诱变剂和诱变处理一、诱变剂和诱变处理n n 物物理理诱诱变变剂剂：射射线线如如紫紫外外线线、XX射射线线、射线，快中子；射线，快中子；n n物物理理因因

39、素素中中目目前前使使用用得得最最方方便便而而且且十十分分有有效效的的是是紫紫外外线线。许许多多高高产产菌菌株株的的选选育育都都用用过过紫紫外外线线，对对于于一一般般实实验验室室、中中小小型型工工厂厂都都适适用用，也很安全。也很安全。n n其其他他的的几几种种射射线线都都是是电电离离性性质质的的，有有一一定定的的穿穿透透力力，一一般般都都由由专专业业人人员员在在专专门门的的设设备备中中使用，否则有一定危险性。使用，否则有一定危险性。化学诱变剂：化学诱变剂：化学因子如碱基类似物、化学因子如碱基类似物、55氟尿嘧啶、烷化剂等。氟尿嘧啶、烷化剂等。化学诱变剂中使用最多、最有效的是烷化剂。化学诱变剂中使

40、用最多、最有效的是烷化剂。使用化学诱变剂的优缺点：使用化学诱变剂的优缺点：1 1、大大多多数数情情况况下下，就就突突变变数数量量而而言言，要要比比电电离离辐辐射射更有效。更有效。2 2、化化学学诱诱变变剂剂是是很很经经济济的的，因因为为只只需需要要少少量量的的合合适适的的诱诱变变剂剂，设设备备是是实实验验室室的的一一般般玻玻璃璃器器皿皿，一一个个蒸蒸气气罩罩。而而用用电电离离辐辐射射行行工工作作时时，设设备备费用大，并要注意安全性。费用大，并要注意安全性。3 3、大大部部分分诱诱变变剂剂是是致致癌癌剂剂，所所以以在在使使用用中中必必须须非非常常谨谨慎慎，要要避避免免化化学学诱诱变变剂剂与与皮皮

41、肤肤接接触触，且且切切勿勿吸吸入入其其蒸蒸气气，有有人人对对某某些些诱诱变变剂剂极极其其敏敏感，甚至未直接接触就会过敏，这就更要当心。感，甚至未直接接触就会过敏，这就更要当心。诱变剂的选择1 1碱碱基基类类似似物物和和羟羟胺胺具具有有很很高高的的特特异异性性，但但很很少少使用，回复突变率高，效果不大。使用，回复突变率高，效果不大。2 2亚亚硝硝酸酸和和烷烷化化剂剂应应用用的的范范围围较较广广，造造成成的的遗遗传传损损伤伤较较多多。其其中中亚亚硝硝基基胍胍和和甲甲基基磺磺酸酸乙乙酯酯常常被被称称为为“超超诱诱变变剂剂”，甲甲基基磺磺酸酸乙乙酯酯是是毒毒性性最最小小的诱变剂之一。的诱变剂之一。3

42、3吖吖啶啶类类诱诱变变剂剂可可以以造造成成生生化化代代谢谢途途径径的的完完全全中断。中断。4 4紫紫外外线线仍仍十十分分有有效效。电电离离辐辐射射是是造造成成染染色色体体巨巨大大损损伤伤的的最最好好诱诱变变剂剂，它它能能造造成成不不可可回回复复的缺突变。但它可能影响邻近基因的性能。的缺突变。但它可能影响邻近基因的性能。二、诱变育种步骤二、诱变育种步骤出发菌株的选择处理菌悬液的制备诱变处理中间培养分离和筛选(一)出发菌株的选择1 1自自然然界界新新分分离离的的野野生生型型菌菌株株，对对诱诱变变处处理理较较敏感，容易达到好的效果。敏感，容易达到好的效果。2 2在在生生产产中中经经生生产产选选种种得

43、得到到的的菌菌株株与与野野生生型型较较相像，也是良好的出发菌株。相像，也是良好的出发菌株。3 3每每次次诱诱变变处处理理都都有有一一定定提提高高的的菌菌株株，往往往往多多次诱变能积累较多的提高。次诱变能积累较多的提高。4 4出出发发菌菌株株开开始始时时可可以以同同时时选选2 23 3株株，在在处处理理比较后，将更适合的出发菌株留作继续诱变。比较后，将更适合的出发菌株留作继续诱变。55要尽量选择单倍体细胞、单核或核少的多细要尽量选择单倍体细胞、单核或核少的多细胞体来作出发诱变细胞，这是由于变异性状大部胞体来作出发诱变细胞，这是由于变异性状大部分是隐性的，特别是高产基因。分是隐性的，特别是高产基因

44、。66根据采用的诱变剂或根据细胞生理状态或诱根据采用的诱变剂或根据细胞生理状态或诱变谱选择诱变剂，因为同一诱变剂的重复处理会变谱选择诱变剂，因为同一诱变剂的重复处理会使细胞产生抗性，使诱变效果下降。有的诱变剂使细胞产生抗性，使诱变效果下降。有的诱变剂是作用于营养细胞，就要选对数期的细胞：有的是作用于营养细胞，就要选对数期的细胞：有的作用于休止期，就可选用孢子。作用于休止期，就可选用孢子。(二)处理菌悬液的制备n n这这一一步步骤骤的的关关键键是是制制备备单单细细胞胞和和单单孢孢子子状状态态的的、活活力力类类似似的的菌菌悬悬液液，为为此此要要进进行行合合适适培培养养基基的的培养，并要离心，洗涤，

45、过滤。培养，并要离心，洗涤，过滤。(三)诱变处理 根根据据前前面面有有关关诱诱变变剂剂及及诱诱变变处处理理的的介介绍绍，结结合诱变对象的实际，设计诱变处理方案。合诱变对象的实际，设计诱变处理方案。(四)中间培养 由由于于在在发发生生了了突突变变尚尚未未表表现现出出来来之之前前，有有一一个个表表现现延延迟迟的的过过程程，即即细细胞胞内内原原有有酶酶量量的的稀稀释释过过程程(生生理理延延迟迟)，需需3 3代代以以上上的的繁繁殖殖才才能能将将突突变变性性状状表表现现出出来来。这这个个过过程程对对今今后后的的筛筛选和获得稳定菌株都是极为重要的。选和获得稳定菌株都是极为重要的。方法：方法：让让变变异异处

46、处理理后后细细胞胞在在液液体体培培养养基基中中培培养养几几小小时时，以以让让细细胞胞的的遗遗传传物物质质复复制制，让让细细胞胞繁繁殖殖几几代代，以以得得到到纯纯的的变变异异细细胞胞。这这样样，隐隐性性的的变变异异就就会会显显现现出出来来，若若不不经经液液体体培培养养基基的的中中间间培培养养，直直接接在在平平皿皿上上分分离离就就会会出出现现变变异异和和不不变变异异细细胞胞同同时时存存在在于于一一个个菌菌落落内内的的可可能能，形形成成混混杂杂菌菌落落，以致造成筛选结果的不稳定和将来的菌株退化。以致造成筛选结果的不稳定和将来的菌株退化。(五)分离和筛选n n筛筛选选分分初初筛筛和和复复筛筛。初初筛筛

47、以以迅迅速速筛筛出出大大量量的的达达到初步要求的分离菌落为目的，以量为主。到初步要求的分离菌落为目的，以量为主。n n复复筛筛则则是是精精选选，以以质质为为主主，也也就就是是以以精精确确度度为为主。因此在具体方法上就有差异主。因此在具体方法上就有差异.例例如如初初筛筛可可以以在在平平皿皿上上直直接接以以菌菌落落的的代代谢谢产产物物与与某某些些染染料料或或基基质质的的作作用用形形成成的的变变色色圈圈或或透透明明圈圈的的大大小小来来挑挑取取参参加加复复筛筛者者，而而将将90%90%的的菌菌落落淘淘汰汰。在在数数量量减减少少后后就就要要仔仔细细比比较较参参加加复复筛筛和和再再复复筛筛的的菌菌株株，最

48、最后后才才能能选选得得优优秀秀菌菌株株。在在以以后后的的复复筛筛阶阶段段，还还应应不不断断结结合合自自然然分分离离，纯纯化化菌菌株。株。紫外线的诱变育种n n紫紫外外线线诱诱变变一一般般采采用用15W15W紫紫外外线线杀杀菌菌灯灯，波波长长为为2537A2537A灯灯与与处处理理物物的的距距离离为为151530cm30cm，照照射射时时间间依依菌菌种种而而异异，一一般般为为几几秒秒至至几几十十分分钟钟。一一般般我我们们常常以以细细胞胞的的死死亡亡率率表表示示，希希望望照照射射的的剂剂量量死死亡亡率控制在率控制在707080%80%为宜。为宜。亚硝基胍诱变曲霉菌n nNN甲甲基基N-N-硝硝基基

49、-N-N-亚亚硝硝基基胍胍(NGN(NGN，MNNGMNNG或或TG)TG)对对真真核核或或原原核核微微生生物物都都有有强强烈烈的的诱诱变变作作用用。其其精精确确的的作作用用机机制制尚尚不不很很清清楚楚，据据认认为为是是伴伴随随着着重重氮氮甲甲烷烷的的生生成成及及在在酸酸性性条条件件下下生生成成亚亚硝硝酸酸，直直接接作作用用于于细细胞胞内内的的DNADNA复复制制系系统统，从从而而诱诱发发了了变变异。异。MNNGMNNG的诱变作用随的诱变作用随pHpH的升高而增强。的升高而增强。第五节 营养缺陷型的选育n n营营养养缺缺陷陷型型是是指指通通过过诱诱变变而而产产生生的的缺缺乏乏合合成成某某些些营

50、营养养物物质质如如氨氨基基酸酸、维维生生素素和和碱碱基基等等的的能能力力，必必须须在在其其基基本本培培养养基基中中加加入入相相应应的的营营养养成成分分才才能能正正常生长的变异株。常生长的变异株。n n与营养缺陷型对应的是野生型与营养缺陷型对应的是野生型。n n能能满满足足野野生生型型菌菌株株正正常常生生长长的的培培养养基基称称基基本本培培养基养基(MM)(MM)；n n在在基基本本培培养养基基中中加加入入相相应应的的营营养养成成分分的的称称补补充充培养基培养基(SM)(SM)；n n能能满满足足各各种种营营养养缺缺陷陷型型生生长长的的称称完完全全培培养养基基(CM)(CM)，如如牛牛肉肉膏膏蛋