单克隆抗体的制备和应用.ppt

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1、第四章第四章 单克隆抗体与基因工程抗体的制备单克隆抗体与基因工程抗体的制备 第一节 杂交瘤技术的基本原理第一代抗体第一代抗体 多克隆抗体多克隆抗体（polyclonal polyclonal antibody)antibody)第二代抗体第二代抗体 单克隆抗体单克隆抗体（monoclonal monoclonal antibody)antibody)第三代抗体第三代抗体 基因工程抗体基因工程抗体（genetic genetic engineering antibody)engineering antibody)抗体种类。淋巴细胞。淋巴细胞发育。浆细胞。抗原接种BALB/c小鼠712周龄2025

2、g体重动物B B淋巴细胞淋巴细胞:寿命短寿命短,分泌特异系性抗体分泌特异系性抗体骨髓瘤细胞：寿命长骨髓瘤细胞：寿命长杂交瘤细胞：寿命长，单克隆抗体杂交瘤细胞：寿命长，单克隆抗体单克隆抗体聚乙二醇（聚乙二醇（PEGPEG）：）：细胞融合剂，使免疫的小鼠脾细细胞融合剂，使免疫的小鼠脾细胞胞与小鼠骨髓瘤细胞融合与小鼠骨髓瘤细胞融合HATHAT培养基的选择培养：培养基的选择培养：反复的免疫学检测筛选克隆化增反复的免疫学检测筛选克隆化增殖的杂交瘤殖的杂交瘤细胞系细胞系单克隆抗体生成：单克隆抗体生成：接种杂交瘤接种杂交瘤细胞于小鼠腹腔，腹水中细胞于小鼠腹腔，腹水中即可得到高效价的单克隆抗体即可得到高效价的

3、单克隆抗体杂交瘤技术原理流程RPM1640RPM1640培养液培养液DMEMDMEM培养液培养液培养液PEG:PEG:分子量分子量4000 4000 的的PEGPEG是最常用的细胞融合剂是最常用的细胞融合剂作用机理：作用机理：诱导细胞膜上脂类物质结构重排，使诱导细胞膜上脂类物质结构重排，使细胞膜易打开而有助于细胞融合细胞膜易打开而有助于细胞融合作用特点：作用特点：随机发生的，不同厂商、批号、分子随机发生的，不同厂商、批号、分子量的量的PEGPEG，其纯度与毒性有所不同，其纯度与毒性有所不同细胞融合剂次黄嘌呤磷酸核糖转化酶次黄嘌呤磷酸核糖转化酶胸腺嘧啶核苷激酶胸腺嘧啶核苷激酶HGPRT酶与TK酶

4、H H（HypoxanthineHypoxanthine）:次黄嘌呤次黄嘌呤A A（AminopterinAminopterin）：）：氨基喋呤；叶酸拮抗氨基喋呤；叶酸拮抗物，阻断物，阻断DNADNA合成主要途径合成主要途径 T(T(ThymidineThymidine)：胸腺嘧啶核苷；胸腺嘧啶核苷；“核苷核苷酸前体酸前体”，供细胞通过替代途径合成，供细胞通过替代途径合成DNADNAHAT培养基8-8-杂氮鸟嘌呤杂氮鸟嘌呤聚乙二醇聚乙二醇应用液不产生不产生IgIg的重链和轻链的重链和轻链HGPRT-;TK-HGPRT-;TK-与提供淋巴细胞的动物品系相同与提供淋巴细胞的动物品系相同骨髓瘤细胞系

5、的选择SP2/O:HGPRT-SP2/O:HGPRT-，TK-;TK-;长长命命淋巴细胞淋巴细胞:HGPRT+HGPRT+，TK+;TK+;短命短命(7(7天天)杂交杂交瘤细胞瘤细胞:HGPRT+HGPRT+，TK+;TK+;长长命命骨髓瘤细胞、淋巴细胞与杂交瘤细胞淋巴细胞：不能生长，淋巴细胞：不能生长，5-75-7天死亡；天死亡；DNADNA合成的合成的主要途径主要途径被被A A阻断阻断骨髓瘤细胞：不能生长，骨髓瘤细胞：不能生长，5-75-7天死亡；天死亡；HGPRTHGPRT缺缺乏，乏，DNADNA合成的替代途径合成的替代途径受阻受阻HAT选择作用长期生长繁殖。长期生长繁殖。利用淋巴细胞的

6、利用淋巴细胞的HGPRTHGPRT，将，将H H合成为嘌呤碱并最终与合成为嘌呤碱并最终与T T一起合成一起合成DNADNA，从淋巴细胞获得产生某种抗体的遗传信息从淋巴细胞获得产生某种抗体的遗传信息从骨髓瘤细胞获得不断繁殖的能力从骨髓瘤细胞获得不断繁殖的能力杂交瘤细胞有限稀释法有限稀释法显微操作法显微操作法FACSFACS法法半固体琼脂糖法半固体琼脂糖法克隆化特点：特点：不需任何特殊设备不需任何特殊设备克隆出现效率高克隆出现效率高实验室常用方法实验室常用方法方法：方法：细胞悬液通过系列稀释细胞悬液通过系列稀释每个培养孔含每个培养孔含0.50.51 1个细胞个细胞有限稀释法效率最高效率最高价格昂贵

7、价格昂贵FACS配制方案：配制方案：杂交瘤细胞（杂交瘤细胞（1 15x105x106 6/ml)+/ml)+细胞冻存液细胞冻存液(30%-40%(30%-40%牛血清，牛血清，50%-60%RPMI-164050%-60%RPMI-1640培养液，培养液，10%DMSO)10%DMSO)“慢冻慢冻”：分步冷冻，分步冷冻，30-7030-70液氮液氮“快融快融”：取出立即浸入取出立即浸入37-4037-40水浴中，使其迅速融水浴中，使其迅速融化、复苏化、复苏杂交瘤细胞的冻存与复苏防止污染防止污染避免染色体丢失避免染色体丢失防止非分泌细胞的过度生长防止非分泌细胞的过度生长防止细胞密度过高而死亡防止

8、细胞密度过高而死亡细胞冷冻的意义 第二节 单克隆抗体制备选择选择对数生长期对数生长期的细胞进行传代培养的细胞进行传代培养细胞形态：细胞形态：浑圆、透亮、均一、排列整齐浑圆、透亮、均一、排列整齐避免细胞返祖：避免细胞返祖：定期用定期用8-AG8-AG处理细胞处理细胞注意事项：注意事项：切忌过多传代培养，可将细胞分装冻存于切忌过多传代培养，可将细胞分装冻存于-80-80或液氮及干冰中或液氮及干冰中培养骨髓瘤细胞1110108 8 淋巴细胞淋巴细胞无菌手术无菌手术免疫脾细胞的制备细胞密度过低不利于细胞生长繁殖细胞密度过低不利于细胞生长繁殖常用小鼠腹腔细胞作饲养细胞常用小鼠腹腔细胞作饲养细胞其中其中M

9、QMQ还有清除死亡细胞的作用还有清除死亡细胞的作用饲养存活一般不超过饲养存活一般不超过2 2周，不影响杂交瘤细胞的纯化周，不影响杂交瘤细胞的纯化采取饲养细胞。饲养细胞骨髓瘤细胞与淋巴细胞骨髓瘤细胞与淋巴细胞(1:3)(1:3)50%50%PEG 1minPEG 1min内加完内加完;2 2minmin内加内加1010mlml培养液培养液融合方法SP2/0SP2/0细胞与脾细胞的比例为细胞与脾细胞的比例为1 1：2-52-51ml 50%1ml 50%的的PEGPEG（无菌，预温（无菌，预温3737）在）在1 1分钟内滴完分钟内滴完,静置静置9090秒秒,时间一到时间一到,将事先准备的培养液一滴

10、一滴加入将事先准备的培养液一滴一滴加入,停止停止PEGPEG作用作用根据细胞数量加入根据细胞数量加入HATHAT培养基，使之分加到培养基，使之分加到9696孔板中时每孔孔板中时每孔细胞数为细胞数为0.5-1.5100.5-1.5105 5个。融合后个。融合后7 7天，换用天，换用HTHT培养液。培养液。细胞融合10102020天出现克隆天出现克隆HATHAT筛选筛选挑克隆挑克隆融合细胞的早期培养可溶性抗原：可溶性抗原：ELISAELISA抗体捕获法抗体捕获法细胞、亚细胞结构上的抗原：免疫荧光法（用丙酮细胞、亚细胞结构上的抗原：免疫荧光法（用丙酮和甲醇按和甲醇按1:11:1比例固定细胞）比例固定

11、细胞）筛选常用方法ELISAELISA多头加样枪。免疫荧光法体外培养体外培养中空纤维培养系统中空纤维培养系统单抗含量不高，牛血清单抗含量不高，牛血清AbAb难以去除难以去除动物接种动物接种 每次用每次用BALB/cBALB/c或或F1F1代小鼠，代小鼠，5-10 105-10 105 5/只只 生产单克隆抗体 细胞性抗原：细胞性抗原：1-2 101-2 107 7/只，不加佐剂，只，不加佐剂，2-32-3周重复一次周重复一次 可溶性抗原：首次，完全福氏佐剂可溶性抗原：首次，完全福氏佐剂+100+100微克抗原，微克抗原，3-63-6周周 100-200100-200微克抗原，融合前微克抗原，融

12、合前3 3天，加强免疫天，加强免疫免疫小鼠腹腔注射法前前5 5天进行天进行,预先腹腔注射预先腹腔注射pristanepristane1 15 510106 6细胞细胞1 13 3w w形成腹水形成腹水高滴度腹水盐析沉淀盐析沉淀亲和层析亲和层析离子交换层析离子交换层析McAb的纯化IgIg类型、亚类测定：类型、亚类测定：双扩法或双扩法或ELISAELISA法法特异性测定：特异性测定：抗原类似物的交叉反应抗原类似物的交叉反应效价测定：效价测定：用腹水或培养液的稀释度表示用腹水或培养液的稀释度表示表位测定：表位测定：几株单抗是否为不同表位特异的几株单抗是否为不同表位特异的,用竞用竞争抑争抑制法，相加

13、指数法及微机集群分析制法，相加指数法及微机集群分析亲和性测定：亲和性测定：测定亲和常数测定亲和常数K K杂交瘤细胞染色体：杂交瘤细胞染色体：秋水仙素裂解法，小鼠秋水仙素裂解法，小鼠B B细胞染色体细胞染色体4040条，条，SP2/0SP2/0细胞细胞6868条，杂交瘤细胞一般条，杂交瘤细胞一般100100多条多条McAbMcAb靶抗原分子量：靶抗原分子量：常用常用western blotwestern blotMcAb的鉴定 McAbMcAb PcPcAbAb 抗原要求抗原要求 可以不纯可以不纯 纯度高纯度高得量得量 高高 低低特异性特异性 高高 低低 稳定稳定 低低 高高 沉淀反应沉淀反应

14、无无 有有成本成本 高高 低低McAb与PcAb的比较McAbandPcAb第三节 基因工程抗体 根据研究者的意图，采用基因工程方法，在根据研究者的意图，采用基因工程方法，在基因水平，对免疫球蛋白基因进行切割、拼接基因水平，对免疫球蛋白基因进行切割、拼接或修饰后导入受体细胞进行表达，产生新型抗或修饰后导入受体细胞进行表达，产生新型抗体。主要包括嵌合抗体、单链抗体、人源化抗体。主要包括嵌合抗体、单链抗体、人源化抗体、双价抗体和双特异性抗体。体、双价抗体和双特异性抗体。基因工程抗体Geneticengineeringantibody将小鼠的将小鼠的CDRCDR序列移植到人抗体可变区框架序列移植到人

15、抗体可变区框架中，产生的抗体称为中，产生的抗体称为CDRCDR移植抗体移植抗体将小鼠将小鼠IgIg基因敲除，转染人基因敲除，转染人IgIg基因，在小基因，在小鼠体内产生人鼠体内产生人AbAb，再经杂交瘤技术，产生大，再经杂交瘤技术，产生大量完全人源化抗体量完全人源化抗体人源化抗体方法：方法：从杂交瘤细胞分离出功能性可变区基因，与人从杂交瘤细胞分离出功能性可变区基因，与人IgIg恒定区恒定区基因连接，插入适当表达载体，转染宿主细胞，表达人基因连接，插入适当表达载体，转染宿主细胞，表达人-鼠鼠嵌合抗体嵌合抗体特点：特点：减少了鼠源性抗体的免疫原性减少了鼠源性抗体的免疫原性 保留了亲本抗体特异性结合

16、抗原的能力保留了亲本抗体特异性结合抗原的能力嵌合抗体chimericantibody嵌合抗体chimericantibody人抗体人抗体V V区的骨架区区的骨架区取代鼠源单抗取代鼠源单抗CDRCDR以外骨架区以外骨架区改型抗体reshapedantibody定义：定义：指利用基因工程技术，将指利用基因工程技术，将人抗体可变区（人抗体可变区（V V）中互）中互补决定簇（补决定簇（CDRCDR）序列）序列改换成改换成鼠源单抗鼠源单抗CDRCDR序列序列。重构成既。重构成既具有鼠源性单抗的特异性又保持抗体亲和力的人源化抗体。具有鼠源性单抗的特异性又保持抗体亲和力的人源化抗体。RAbRAb亦叫亦叫“重

17、构型抗体重构型抗体”，因其主要涉及，因其主要涉及CDRCDR的的“移植移植”，又可称为又可称为“CDRCDR移植抗体移植抗体意义：意义：多种特异的鼠源单抗有可能应用于临床治疗多种特异的鼠源单抗有可能应用于临床治疗改形抗体（RAb）FabFab ：抗原结合片断抗原结合片断 Fv Fv：可变区片段可变区片段 ScFvScFv：单链可变区片段单链可变区片段小分子抗体小分子抗体其它生物活性蛋白融合其它生物活性蛋白融合抗体融合蛋白许多抗原抗体反应要求双价的抗原结合位点，许多抗原抗体反应要求双价的抗原结合位点，使抗原分子上的两个表位交联或使两个抗原分子连使抗原分子上的两个表位交联或使两个抗原分子连接。将识

18、别肿瘤抗原的抗体和识别细胞毒性免疫效接。将识别肿瘤抗原的抗体和识别细胞毒性免疫效应细胞表面分子的抗体连结在一起，可使效应细胞应细胞表面分子的抗体连结在一起，可使效应细胞更容易与肿瘤细胞结合识别，取得杀伤肿瘤细胞的更容易与肿瘤细胞结合识别，取得杀伤肿瘤细胞的作用。作用。双特异性抗体化学交联化学交联BsAbBsAb分别分离纯化两种不同的分别分离纯化两种不同的McAbMcAb，使各抗体解离为单价抗体，再使，使各抗体解离为单价抗体，再使两种不同抗原特异性的单价抗体通过化学试剂交联起来，然后分离两种不同抗原特异性的单价抗体通过化学试剂交联起来，然后分离出目的组分。此法缺点是容易导致抗体失去活性，产物均一

19、性不佳。出目的组分。此法缺点是容易导致抗体失去活性，产物均一性不佳。基因工程基因工程BsAbBsAb多采用抗体分子片段多采用抗体分子片段,如如Fab,FvFab,Fv或或ScFvScFv,经基因操作修饰后经基因操作修饰后,或体或体外组装为外组装为BsAbBsAb,或直接表达分泌型的或直接表达分泌型的BsAbBsAb。双特异性抗体细胞工程细胞工程BsAbBsAb 将两种分泌不同特异性单抗的杂交瘤细胞进行再将两种分泌不同特异性单抗的杂交瘤细胞进行再次融合，产生四源杂交瘤次融合，产生四源杂交瘤 (quadromaquadroma)。但二次杂交瘤。但二次杂交瘤细胞株分泌的是两套重链，轻链的随机组合物。

20、细胞株分泌的是两套重链，轻链的随机组合物。BsAbBsAb在其中的比例可为在其中的比例可为10%10%50%50%不等。多倍杂交瘤细胞的不等。多倍杂交瘤细胞的稳定性差，稳定性差，BsAbBsAb的产量少且活性低，费时费力，临床的产量少且活性低，费时费力，临床应用时存在人抗鼠抗体免疫反应应用时存在人抗鼠抗体免疫反应 (HAMA)(HAMA)，因此不适用，因此不适用于临床。于临床。双特异性抗体定义：定义：将体外克隆的抗体基因片段插入噬菌体载将体外克隆的抗体基因片段插入噬菌体载体，转染工程细菌进行表达，然后用抗原筛选即可获体，转染工程细菌进行表达，然后用抗原筛选即可获得特异的单克隆噬菌体抗体。利用这

21、一技术可以得到得特异的单克隆噬菌体抗体。利用这一技术可以得到完全人源性的抗体，在完全人源性的抗体，在HIVHIV等病毒感染和肿瘤的诊断等病毒感染和肿瘤的诊断与治疗方面有其独特的优越性与治疗方面有其独特的优越性噬菌体抗体库技术用用PCRPCR扩增人抗体重链可变区扩增人抗体重链可变区(VH)(VH)和轻链可变区和轻链可变区(VL)(VL)基因基因克隆到噬菌体载体并以融合蛋白的形式表达在其外壳表面克隆到噬菌体载体并以融合蛋白的形式表达在其外壳表面用抗原抗体反应筛选出表达所需要抗体的克隆并扩增。用抗原抗体反应筛选出表达所需要抗体的克隆并扩增。使抗体基因以分泌的方式表达，获得可溶性的抗体片段。使抗体基因

22、以分泌的方式表达，获得可溶性的抗体片段。抗体库：抗体库：组合抗体文库：在建库过程中如果将组合抗体文库：在建库过程中如果将VHVH和和VLVL随机组合随机组合 人天然抗体库：抗体人天然抗体库：抗体mRNAmRNA来源于未经免疫的正常人来源于未经免疫的正常人基本原理噬菌体抗体库从外周血或脾、淋巴结等组织中分离从外周血或脾、淋巴结等组织中分离B B淋巴细胞，提取淋巴细胞，提取mRNAmRNA并逆转录为并逆转录为cDNAcDNA；应用抗体轻链和重链引物，根据建库的需要通过应用抗体轻链和重链引物，根据建库的需要通过PCRPCR技术技术扩增不同的扩增不同的IgIg基因片段；基因片段；构建噬菌体载体。噬菌体

23、抗体库载体有构建噬菌体载体。噬菌体抗体库载体有噬菌体、丝状噬菌体、丝状噬菌体和噬菌粒三种，其中后二者是目前构建表面表达的噬噬菌体和噬菌粒三种，其中后二者是目前构建表面表达的噬菌体抗体库菌体抗体库(surface display antibody library)(surface display antibody library)常用载体；常用载体；表达载体转化细菌，构建全套抗体库。通过多轮的抗原表达载体转化细菌，构建全套抗体库。通过多轮的抗原亲合吸附亲合吸附-洗脱洗脱-扩增，最终筛选出抗原特异的抗体克隆。扩增，最终筛选出抗原特异的抗体克隆。构建噬菌体抗体库模拟天然全套抗体库模拟天然全套抗体库抗

24、体文库可以达到或超过抗体文库可以达到或超过10101111库容库容,能包含能包含B B细胞全部克隆细胞全部克隆建库的外源基因来自人体多克隆细胞的总建库的外源基因来自人体多克隆细胞的总mRNAmRNA通用引物具有人的种属普遍性通用引物具有人的种属普遍性抗体的抗体的VHVH和和VLVL基因的随机重组也增加了抗体的多样性基因的随机重组也增加了抗体的多样性噬菌体抗体库特点避开了人工免疫和杂交瘤技术避开了人工免疫和杂交瘤技术抗体库抗体库的大容量的大容量抗体库极高的筛选效率抗体库极高的筛选效率可获得高亲和力的人源化抗体可获得高亲和力的人源化抗体VHVH和和VLVL基因的随机重组模拟了体内抗体亲和力成熟的过

25、程基因的随机重组模拟了体内抗体亲和力成熟的过程所用的抗体基因又来自人体所用的抗体基因又来自人体第四节单克隆抗体应用诊断病原体诊断病原体肿瘤的诊断肿瘤的诊断淋巴细胞表面标志物检测淋巴细胞表面标志物检测检验医学体外诊断试剂标记免疫测定肝炎病毒肝炎病毒:HAV,HBV,HCV,HDV,HEVHAV,HBV,HCV,HDV,HEVTORCHTORCH：弓形虫弓形虫,风疹病毒风疹病毒,巨细胞病毒巨细胞病毒 ，单纯疱疹病毒单纯疱疹病毒病原体测定CD4/CD8:CD4/CD8:Th/TcTh/Tc白血病的分型白血病的分型细胞表面CD测定内分泌疾病的诊断内分泌疾病的诊断激素的测定药物测定(TDM)抗排斥药物抗

26、排斥药物抗肿瘤药物抗肿瘤药物地高辛地高辛越来越多未知功能越来越多未知功能cDNAcDNA的克隆的克隆对复杂的基因功能和多肽蛋白功能的研究需求增加对复杂的基因功能和多肽蛋白功能的研究需求增加研究工作中的探针免疫沉淀干扰素的精制干扰素的精制物质的纯化MACS同位素标记同位素标记McAbMcAb进行影像诊断进行影像诊断体内定位诊断定义：定义：分子量较小但具有抗原结合功能的分子片段分子量较小但具有抗原结合功能的分子片段优点：优点：分子量小分子量小,穿透性强穿透性强,抗原性低抗原性低不含不含FcFc段，不会与带有段，不会与带有FcFc段受体的细胞结合，不良反应少段受体的细胞结合，不良反应少可在原核系统表

27、达及易于基因工程操作可在原核系统表达及易于基因工程操作半衰期短，有利于及时中和及清除毒素半衰期短，有利于及时中和及清除毒素小分子抗体用于肿瘤的导向治疗用于肿瘤的导向治疗肿瘤的影像分布肿瘤的影像分布基因治疗基因治疗细胞内抗体：细胞内抗体：在细胞内表达在细胞内表达 特异性识别某一基因产物特异性识别某一基因产物 可干扰该基因产物的生物活性可干扰该基因产物的生物活性 研究基因结构与功能的关系研究基因结构与功能的关系肿瘤的体内显像诊断肿瘤的体内显像诊断 单链抗体排除速度快，穿透力强，在肿瘤组织中的分布单链抗体排除速度快，穿透力强，在肿瘤组织中的分布指数较完整抗体分子高指数较完整抗体分子高 放射显像时，放

28、射性核素排除较快，对身体危害程度小，放射显像时，放射性核素排除较快，对身体危害程度小，显像的本底较低显像的本底较低 理想的显像定位诊断载体理想的显像定位诊断载体病毒的诊断和抗病毒感染病毒的诊断和抗病毒感染血液性疾病的诊断血液性疾病的诊断白血病的免疫诊断及分型白血病的免疫诊断及分型抗体融合蛋白抗体分子可与放射性核素、细胞毒药物、毒素、等多种抗体分子可与放射性核素、细胞毒药物、毒素、等多种分子相融合，这些分子在抗体结合靶分子后可提供重要辅分子相融合，这些分子在抗体结合靶分子后可提供重要辅助功能助功能双功能抗体可有效针对低水平的肿瘤相关抗原，并将细双功能抗体可有效针对低水平的肿瘤相关抗原，并将细胞毒

29、物质输送到肿瘤细胞胞毒物质输送到肿瘤细胞抗体还可与携带药物的脂质体、各种抗体还可与携带药物的脂质体、各种PEGPEG偶联，从而增强偶联，从而增强体内运输和药代动力学体内运输和药代动力学体内免疫治疗应用自身红细胞凝集试验自身红细胞凝集试验 快速检测快速检测HBVHBV和和HIVHIV病原体等病原体等避免化学交联减低两者的活性，从而提高酶免疫避免化学交联减低两者的活性，从而提高酶免疫检测的敏感度检测的敏感度用双特异抗体作为二抗，检测限达用双特异抗体作为二抗，检测限达1ng1ngmlml双特异抗体应用体外诊断方法：方法：双特异抗体的一只臂结合靶抗原，一只双特异抗体的一只臂结合靶抗原，一只臂结合半抗原螯合剂，后者可选择性地与放臂结合半抗原螯合剂，后者可选择性地与放射性核素结合，利用二次导向系统显示射性核素结合，利用二次导向系统显示特点：特点：更高的的灵敏度和清晰度更高的的灵敏度和清晰度体内肿瘤放射免疫显像