海洋药用活性化学成分分离分析的基本方法.ppt

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1、第二章第二章 海洋药用活性化学成分海洋药用活性化学成分 分离分析的基本方法分离分析的基本方法 药物化学海洋药物成分研究海洋药物成分研究结构结构鉴定鉴定预鉴定预鉴定提取提取纯化纯化分离分离 第一节第一节 预实验检测化合物成分预实验检测化合物成分 海洋天然产物经溶剂提取以后，经生物活性筛选确定海洋天然产物经溶剂提取以后，经生物活性筛选确定活性部位，确定活性部位以后，要分离出药用活性成分，活性部位，确定活性部位以后，要分离出药用活性成分，就要借助预实验，检测该活性部位含有哪种类型的化学成就要借助预实验，检测该活性部位含有哪种类型的化学成分，以便于选用合适的分离手段和方法进行下一步活性化分，以便于选用

2、合适的分离手段和方法进行下一步活性化学成分的分离和分析。学成分的分离和分析。（1）一般检查：石油醚提取液滴于滤纸上。如滤纸上的油斑）一般检查：石油醚提取液滴于滤纸上。如滤纸上的油斑在大气中能挥发，就可能含有挥发油。如果油斑不消失，可在大气中能挥发，就可能含有挥发油。如果油斑不消失，可能含有挥发油油脂或类脂体。能含有挥发油油脂或类脂体。挥发油和油脂挥发油和油脂（2）0.05荧光素水溶液：将石油醚提取液点在纸片上，喷荧光素水溶液：将石油醚提取液点在纸片上，喷洒洒0.05荧光素水溶液后，将纸片暴露在溴蒸气中荧光素水溶液后，将纸片暴露在溴蒸气中(或碘蒸或碘蒸气中）。含有双键的萜类就呈黄色，背景很快就变

3、为淡红色。气中）。含有双键的萜类就呈黄色，背景很快就变为淡红色。挥发油和油脂挥发油和油脂（3）25磷钼酸乙醇溶液：将石油醚提取液点在滤纸片上，磷钼酸乙醇溶液：将石油醚提取液点在滤纸片上，喷洒喷洒25磷钼酸乙醇溶液后，将纸片放在磷钼酸乙醇溶液后，将纸片放在115118烘箱烘箱中中2min，对油脂、三萜及甾醇等呈蓝色，背景为黄绿色或，对油脂、三萜及甾醇等呈蓝色，背景为黄绿色或藏青色。藏青色。挥发油和油脂挥发油和油脂（1）用用PH试纸检查。生物样的水浸液和酒精提取液如呈酸试纸检查。生物样的水浸液和酒精提取液如呈酸性，就可能含有游离酸或酚性化合物。性，就可能含有游离酸或酚性化合物。有机酸有机酸（2）溴

4、酚蓝溶液：点样于滤纸片上，喷洒溴酚蓝溶液：点样于滤纸片上，喷洒0.1溴酚蓝溶液，溴酚蓝溶液，溶于溶于70乙醇中，立即在蓝色的背景上显黄色的斑点。如乙醇中，立即在蓝色的背景上显黄色的斑点。如觉得这样还不够明显，再喷洒氨水，然后暴露在盐酸气体中，觉得这样还不够明显，再喷洒氨水，然后暴露在盐酸气体中，背景逐渐由蓝色变为黄色，而有机酸盐的斑点仍然为蓝色。背景逐渐由蓝色变为黄色，而有机酸盐的斑点仍然为蓝色。经过这样一个反复，用经过这样一个反复，用pH试纸难以肯定的有机酸样品也可试纸难以肯定的有机酸样品也可检出。检出。有机酸有机酸（1）间二硝基苯试剂：间二硝基苯试剂：使用前制备使用前制备2的间二硝基苯乙醇

5、溶的间二硝基苯乙醇溶液和液和14的氢氧化钾乙醇溶液的等量混合液。将样品点在的氢氧化钾乙醇溶液的等量混合液。将样品点在纸上。喷洒上述试剂后，置空气中干燥约纸上。喷洒上述试剂后，置空气中干燥约10min，就呈黄褐，就呈黄褐色或紫色。色或紫色。甾体甾体（2）三氯化锑溶液：先制备三氯化锑的氯仿饱和溶液。临用三氯化锑溶液：先制备三氯化锑的氯仿饱和溶液。临用时加氯化亚砜时加氯化亚砜(1/101/5 量量)，甾体化合物能呈各种颜色，甾体化合物能呈各种颜色，若不加氯化亚砜，单独使用三氯化锑的氯仿溶液也能呈色。若不加氯化亚砜，单独使用三氯化锑的氯仿溶液也能呈色。有些甾体样品需要加热有些甾体样品需要加热100左右

6、左右35min才能呈现各种颜才能呈现各种颜色。（三氯化锑反应与强心甙、三萜类均能呈类似颜色）色。（三氯化锑反应与强心甙、三萜类均能呈类似颜色）甾体甾体（3）醋酐浓硫酸试验醋酐浓硫酸试验：取乙醇浸出液将溶剂蒸干，残渣加入：取乙醇浸出液将溶剂蒸干，残渣加入1mL冰醋酸使其溶解，再加冰醋酸使其溶解，再加lmL醋配酐最后滴入醋配酐最后滴入1滴浓硫酸。滴浓硫酸。若试管颜色逐渐由黄若试管颜色逐渐由黄红红紫紫蓝蓝墨绿进行变化，则表示墨绿进行变化，则表示有甾醇、甾体皂甙的甙元及三萜类化合物。有甾醇、甾体皂甙的甙元及三萜类化合物。甾体甾体（1）取水浸液取水浸液12mL置于试管内，激烈振摇，如果产生持置于试管内，

7、激烈振摇，如果产生持续性泡沫，就可能含有皂甙、高级脂肪酸盐、蛋白质或者粘续性泡沫，就可能含有皂甙、高级脂肪酸盐、蛋白质或者粘液。皂素和脂肪酸盐，泡沫特别显著，甾试管内能持续液。皂素和脂肪酸盐，泡沫特别显著，甾试管内能持续10min以上，即使加热加酒精，泡沫液不会明显减少。以上，即使加热加酒精，泡沫液不会明显减少。皂甙皂甙（2）醋酐浓硫酸反应醋酐浓硫酸反应（LiebermannBurchard反应）：取反应）：取酒精提取液，蒸干酒精，残渣溶解或悬浮于醋酐酒精提取液，蒸干酒精，残渣溶解或悬浮于醋酐0.5mL中，中，加入一滴浓硫酸，如果呈紫红色，并且溶液上层逐渐变绿，加入一滴浓硫酸，如果呈紫红色，并

8、且溶液上层逐渐变绿，就表明含有甾体三萜类或者皂甙。就表明含有甾体三萜类或者皂甙。皂甙皂甙（1）三氯醋酸：将制备好的中性乙酸乙酯溶液点于纸上。配）三氯醋酸：将制备好的中性乙酸乙酯溶液点于纸上。配制三氯醋酸制三氯醋酸1.5乙醇溶液及氯胺乙醇溶液及氯胺3的水溶液，将三氯醋酸：的水溶液，将三氯醋酸：氯胺氯胺(15：1V/V)的混合液喷在纸上，纸片于的混合液喷在纸上，纸片于110120烘烘10min。取出在紫外线照射下，呈蓝紫、蓝、黄褐、黄等。取出在紫外线照射下，呈蓝紫、蓝、黄褐、黄等各种颜色。各种颜色。强心甙强心甙（2）苦味酸试剂：）苦味酸试剂：0.9g苦味酸溶于苦味酸溶于95mL甲醇，再加甲醇，再加

9、l氢氧氢氧化钠化钠2.5mL，最后用蒸馏水稀释至，最后用蒸馏水稀释至50mL。将中性乙酸乙酯。将中性乙酸乙酯液取出少量蒸干，将样品溶于少量甲醇，加入上述试剂液取出少量蒸干，将样品溶于少量甲醇，加入上述试剂23mL，放置，放置15min左右即有红色出现。对狄戈辛等强心甙立左右即有红色出现。对狄戈辛等强心甙立刻呈红色。刻呈红色。强心甙强心甙（3）Kedde试剂：将中性乙酸乙酯部位，点于纸片上，取试剂：将中性乙酸乙酯部位，点于纸片上，取3,5二硝基苯甲酸二硝基苯甲酸lg溶于溶于50mL甲醇，再加甲醇，再加9N氢氧化钾氢氧化钾50mL。喷洒上述试剂，强心甙能呈紫红色斑点。（本反应对喷洒上述试剂，强心甙

10、能呈紫红色斑点。（本反应对、不饱和内酯化合物有同样的颜色）不饱和内酯化合物有同样的颜色）强心甙强心甙（1）内酯化合物的开环与闭环反应：取）内酯化合物的开环与闭环反应：取1mL乙醇浸提液，加乙醇浸提液，加2mL1氢氧化钠，于沸水中煮氢氧化钠，于沸水中煮34min，液体比未加热前，液体比未加热前清晰很多。再加清晰很多。再加2盐酸酸化，液体变未混浊。说明被检出盐酸酸化，液体变未混浊。说明被检出样品中含有萜类内酯或者香豆素类化合物。样品中含有萜类内酯或者香豆素类化合物。萜类内酯与香豆素类化合物萜类内酯与香豆素类化合物（2）香豆素的呈色反应：将中性乙酸乙酯溶液点于纸上，先）香豆素的呈色反应：将中性乙酸乙

11、酯溶液点于纸上，先喷洒喷洒0.5的碳酸钠水溶液，于的碳酸钠水溶液，于 60加热加热20min左右，香豆左右，香豆素内酯开环后产生酚性羟基，进行酚的呈色反应。另外液可素内酯开环后产生酚性羟基，进行酚的呈色反应。另外液可以喷洒以喷洒0.94-氨基安替比林和氨基安替比林和5.4的铁氰化钾水溶液，就的铁氰化钾水溶液，就呈紫红色斑点。（如香豆素开环后的羟基再对位有取代基时，呈紫红色斑点。（如香豆素开环后的羟基再对位有取代基时，不显色。）不显色。）萜类内酯与香豆素类化合物萜类内酯与香豆素类化合物（3）羟胺反应：制备：）羟胺反应：制备：(a)新鲜的新鲜的1N盐酸羟胺的甲醇液；盐酸羟胺的甲醇液；(b)1.1N

12、氢氧化钾的甲醇液。将中性的乙酸乙酯溶液点于纸氢氧化钾的甲醇液。将中性的乙酸乙酯溶液点于纸片上再将片上再将a、b二溶液按二溶液按1：1(V/V)混合后喷在纸上。于空气混合后喷在纸上。于空气中干燥中干燥10min左右。再用溶于左右。再用溶于1盐酸中的盐酸中的1三氯化铁溶液三氯化铁溶液喷于纸上。内酪化合物和一些酯类化合物呈红色斑点。喷于纸上。内酪化合物和一些酯类化合物呈红色斑点。萜类内酯与香豆素类化合物萜类内酯与香豆素类化合物（4）间硝基甲苯试剂）间硝基甲苯试剂(Zimmermanns)：取中性的乙酸乙酯：取中性的乙酸乙酯液，点在纸上。配制液，点在纸上。配制2的间硝基甲苯乙醇液，待乙醇挥发的间硝基甲

13、苯乙醇液，待乙醇挥发后，再用后，再用2.5N氢氧化钾水溶液喷于纸上。随后将纸片放在氢氧化钾水溶液喷于纸上。随后将纸片放在70100的烘箱中，如有内酯存在就出现紫红色斑点。的烘箱中，如有内酯存在就出现紫红色斑点。萜类内酯与香豆素类化合物萜类内酯与香豆素类化合物（1）碘化汞钾试剂碘化汞钾试剂(Mayerr试剂试剂)：取水溶液加盐酸至酸性，：取水溶液加盐酸至酸性，或取酒精提取物稀盐酸溶解部分，加碘化汞钾试剂，如有白或取酒精提取物稀盐酸溶解部分，加碘化汞钾试剂，如有白色或淡黄色沉淀可能含有生物碱。因为反应沉淀物能溶解于色或淡黄色沉淀可能含有生物碱。因为反应沉淀物能溶解于该试剂中，所以试剂不能加得过多。

14、该试剂中，所以试剂不能加得过多。生物碱生物碱（2）碘化铋钾试剂）碘化铋钾试剂(Dragendorff试剂试剂)：试样同上，也呈酸性，加碘化铋钾试剂立即有橘红色或黄色试样同上，也呈酸性，加碘化铋钾试剂立即有橘红色或黄色沉淀出现亦可能有生物碱。本反应于纸片上进行较为敏感。沉淀出现亦可能有生物碱。本反应于纸片上进行较为敏感。生物碱生物碱（3）硅钨酸试剂：）硅钨酸试剂：1g硅钨酸溶于硅钨酸溶于20mL水中，加水中，加10盐酸使呈酸性。试液如盐酸使呈酸性。试液如有生物碱，与硅钨酸试剂相遇即产生灰白色或浅黄色沉淀。有生物碱，与硅钨酸试剂相遇即产生灰白色或浅黄色沉淀。（碱性氨基酸、内酯化合物和生物胺也发生类

15、似显色反应。）（碱性氨基酸、内酯化合物和生物胺也发生类似显色反应。）生物碱生物碱（1）茚三酮（茚三酮（Ninhydrin）试剂：）试剂：样品点在纸片上，滴上或喷洒样品点在纸片上，滴上或喷洒0.2茚三酮酒精溶液后，茚三酮酒精溶液后，在在100左右的烘箱中放置左右的烘箱中放置2min，如有氨基酸和肽，就呈紫，如有氨基酸和肽，就呈紫红色或蓝色斑点，也有少数氨基酸呈黄色斑点。亦可以在试红色或蓝色斑点，也有少数氨基酸呈黄色斑点。亦可以在试管中进行，取水提取液管中进行，取水提取液lmL加试剂加试剂23滴而后在沸水浴上加滴而后在沸水浴上加热热5min，冷后有蓝或蓝紫色出现表明有氨基酸或多肽。，冷后有蓝或蓝紫

16、色出现表明有氨基酸或多肽。氨基酸和肽氨基酸和肽（2）吲哚醌（）吲哚醌（Isatin 试剂）溶液：试剂）溶液：100mL1的吲哚醌丙酮溶液，加的吲哚醌丙酮溶液，加10mL醋酸即可。将醋酸即可。将样品点在纸上，滴上或喷洒吲哚醌试剂后，用吹风机吹干，样品点在纸上，滴上或喷洒吲哚醌试剂后，用吹风机吹干，在在120加热加热5min就呈各种颜色。本试剂主要对氨基酸、氨就呈各种颜色。本试剂主要对氨基酸、氨基酸衍生物及小肽有颜色反应，肽越大灵敏度越差。基酸衍生物及小肽有颜色反应，肽越大灵敏度越差。氨基酸和肽氨基酸和肽（3）双缩脲反应：）双缩脲反应：试剂为试剂为1硫酸铜和硫酸铜和40氢氧化钠溶液等量混合。本试氢

17、氧化钠溶液等量混合。本试剂主要是剂主要是Cu与蛋白质或肽分子中肽键与蛋白质或肽分子中肽键CONH 络合络合呈色。取呈色。取1ml水浸液加入上述试剂，振摇，冷时显紫红表示水浸液加入上述试剂，振摇，冷时显紫红表示可能有蛋白质或肽。可能有蛋白质或肽。氨基酸和肽氨基酸和肽（4）酸性蒽醌紫）酸性蒽醌紫(商品名：商品名：Solway purple)：100 mL 0.05酸性蒽醌紫溶液，加酸性蒽醌紫溶液，加0.5 mL硫酸即成。硫酸即成。将水浸出液点在纸片上，就呈紫色。氨基酸、肽均不显色。将水浸出液点在纸片上，就呈紫色。氨基酸、肽均不显色。氨基酸和肽氨基酸和肽（5）溴百里蓝钠盐溶液：）溴百里蓝钠盐溶液：将

18、水浸出液点在纸上，喷洒上述试剂，就呈此紫色或将水浸出液点在纸上，喷洒上述试剂，就呈此紫色或绿色。若显色不够明显，稍烘一下即可，背景为黄色。绿色。若显色不够明显，稍烘一下即可，背景为黄色。氨基酸和肽氨基酸和肽 用用酸酸性性蒽蒽醌醌紫紫、溴溴百百里里蓝蓝钠钠盐盐溶溶液液、双双缩缩脲脲反反应应来鉴别，方法同上。来鉴别，方法同上。蛋白质蛋白质（1）费林试剂费林试剂(Fehling试剂试剂)：水浸液试样加费林试剂，在沸水浴上加热数分钟。如果水浸液试样加费林试剂，在沸水浴上加热数分钟。如果产生红色的氧化亚铜沉淀，证明含有还原糖。若试样不含还产生红色的氧化亚铜沉淀，证明含有还原糖。若试样不含还原糖，可将水浸

19、液加少量盐酸煮沸约原糖，可将水浸液加少量盐酸煮沸约30min，加氢氧化钠溶，加氢氧化钠溶液中和至碱性，然后加费林试剂在沸水浴上加热数分钟。如液中和至碱性，然后加费林试剂在沸水浴上加热数分钟。如果产生红色沉淀，就可能含有配糖体或者多糖类化合物。果产生红色沉淀，就可能含有配糖体或者多糖类化合物。糖、多糖和配糖体（甙）糖、多糖和配糖体（甙）（2）萘酚试剂（萘酚试剂（Molish试剂）：试剂）：配置配置10的的萘酚乙醇溶液。样品以稀乙醇或水溶解，萘酚乙醇溶液。样品以稀乙醇或水溶解，置试管内，加入置试管内，加入萘酚试液数滴，此后再沿着试管壁滴加萘酚试液数滴，此后再沿着试管壁滴加少量浓硫酸，如与浓硫酸的接

20、触面产生紫红色环即有还原糖少量浓硫酸，如与浓硫酸的接触面产生紫红色环即有还原糖或其他还原性物质存在。或其他还原性物质存在。糖、多糖和配糖体（甙）糖、多糖和配糖体（甙）（3）氨性硝酸银试剂：）氨性硝酸银试剂：0.1N硝酸银溶液和硝酸银溶液和5N的氨水等量混和。样品点再纸上，的氨水等量混和。样品点再纸上，喷洒上述试剂，再喷洒上述试剂，再100加热加热510min，还原糖就呈褐色。，还原糖就呈褐色。糖、多糖和配糖体（甙）糖、多糖和配糖体（甙）（4）苯胺邻苯二甲酸盐：）苯胺邻苯二甲酸盐：苯胺苯胺0.93g和邻苯二甲酸和邻苯二甲酸1.6g溶于溶于100mL水饱和的正丁水饱和的正丁醇中。将样品点在纸上，喷

21、洒上述试剂，在醇中。将样品点在纸上，喷洒上述试剂，在105加热加热5min，还原糖就呈桃红色。有时也呈棕色斑点，一般来讲，呈红，还原糖就呈桃红色。有时也呈棕色斑点，一般来讲，呈红色的为戊醛糖和色的为戊醛糖和2己酮糖酸，呈棕色的为己醛糖和己酮糖酸，呈棕色的为己醛糖和5己己酮糖酸。酮糖酸。糖、多糖和配糖体（甙）糖、多糖和配糖体（甙）（5）间苯二胺试剂：）间苯二胺试剂：0.2N间苯二胺间苯二胺70乙醇溶液。将样品点在纸上，喷洒乙醇溶液。将样品点在纸上，喷洒上述试剂，在在上述试剂，在在105加热加热5min呈黄色荧光即证明含糖。呈黄色荧光即证明含糖。糖、多糖和配糖体（甙）糖、多糖和配糖体（甙）蒽醌类蒽

22、醌类（1）1硼酸水溶液：将乙醇提取液点于纸片上喷洒上述试硼酸水溶液：将乙醇提取液点于纸片上喷洒上述试剂，就呈黄、橙、红色荧光。剂，就呈黄、橙、红色荧光。（2）10氢氧化钾水溶液：将乙醇提取液点于纸上，喷洒氢氧化钾水溶液：将乙醇提取液点于纸上，喷洒上述试剂，就呈黄、橙、红色荧光。上述试剂，就呈黄、橙、红色荧光。（3）5醋酸镁的甲醇溶液：将乙醇浸取点在纸片上，喷洒醋酸镁的甲醇溶液：将乙醇浸取点在纸片上，喷洒上述试剂，就呈橙红色、紫色。上述试剂，就呈橙红色、紫色。黄酮类黄酮类（1）1的三氯化铝乙醇溶液的三氯化铝乙醇溶液(或或5三氯化铝水溶液三氯化铝水溶液)：将样品点在纸上，喷洒上述试剂，干燥后，黄色

23、斑点于将样品点在纸上，喷洒上述试剂，干燥后，黄色斑点于紫外荧光灯下显明显荧光。紫外荧光灯下显明显荧光。（2）浓氨水溶液：）浓氨水溶液：把进行层析后的滤纸在浓氨水瓶上熏，立即置于荧光下把进行层析后的滤纸在浓氨水瓶上熏，立即置于荧光下产生极明显的黄色荧光斑点。产生极明显的黄色荧光斑点。黄酮类黄酮类（3）盐酸镁粉反应：）盐酸镁粉反应：取酒精提取液取酒精提取液1mL于试管中加镁粉或锌粉适量，再注入浓于试管中加镁粉或锌粉适量，再注入浓盐酸数滴盐酸数滴(1次加入次加入)，在泡沫处如呈桃红色则可能含有黄酮体。，在泡沫处如呈桃红色则可能含有黄酮体。在水在水 浸液中也可进行：取水浸液浸液中也可进行：取水浸液34mL在蒸发皿内蒸干，再在蒸发皿内蒸干，再加加95乙醇加热使溶解乙醇加热使溶解(不溶物不用过滤不溶物不用过滤)，在这溶液中如上法，在这溶液中如上法进行黄酮体反应。如被检出的溶液不加镁粉直接加浓盐酸，就进行黄酮体反应。如被检出的溶液不加镁粉直接加浓盐酸，就产生红色，说明被检的溶液中含有花青色素。（少数黄酮体不产生红色，说明被检的溶液中含有花青色素。（少数黄酮体不显色）显色）