实验1-大肠杆菌的培养与分离55802.ppt

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1、第一部分第一部分:微生物的应用微生物的应用实验实验1大肠杆菌的培养与分离大肠杆菌的培养与分离实验目的实验目的:1.进行进行大肠杆菌的扩增大肠杆菌的扩增，利用，利用液体培养基液体培养基进进行细菌培养的操作行细菌培养的操作2.进行进行大肠杆菌的分离大肠杆菌的分离,用用固体平板培养基固体平板培养基进行细菌的划线培养进行细菌的划线培养3.说明大肠杆菌培养的条件和操作要求的原说明大肠杆菌培养的条件和操作要求的原理理特点：特点：结构都相当结构都相当简单简单,个体多数十分个体多数十分微小微小.通常要用通常要用光学显微镜或电子显微镜才能看到，有的甚至没有细光学显微镜或电子显微镜才能看到，有的甚至没有细胞结构胞

2、结构.微生物包括哪五类：微生物包括哪五类：病毒病毒细菌细菌放线菌放线菌真菌真菌原生动物原生动物 原核生物界原核生物界 原生生物界原生生物界真菌界真菌界病毒界病毒界实验实验1-大肠杆菌的培大肠杆菌的培养与分离养与分离55802：是一切肉眼看不见或看不清：是一切肉眼看不见或看不清楚的微小生物的总称楚的微小生物的总称(二二)细菌的常识细菌的常识1、结构、结构2、分裂、分裂3、生殖、生殖4、变异类型、变异类型5、在基因工程中的、在基因工程中的应用应用大肠杆菌大肠杆菌实验实验1-大肠杆菌的培养与分离大肠杆菌的培养与分离55802大肠杆菌属于杆状菌大肠杆菌属于杆状菌图图1-1常见的三种细菌典型形态常见的三

3、种细菌典型形态A.球菌球菌B.杆菌杆菌C.弧菌弧菌n根据细菌所利用的根据细菌所利用的能源和碳源能源和碳源的不同的不同将细菌分为两大营养类型。将细菌分为两大营养类型。n自养菌自养菌:n异养菌异养菌:腐生菌腐生菌寄生菌寄生菌 大部分病原菌大部分病原菌实验实验1-大肠杆菌的培养与分离大肠杆菌的培养与分离55802光能自养型光能自养型:光合细菌光合细菌化能自养型化能自养型:硝化细菌硝化细菌,铁细菌铁细菌,硫细菌硫细菌大肠杆菌属于异养兼性厌氧菌大肠杆菌属于异养兼性厌氧菌细菌的革兰氏染色细菌的革兰氏染色 革兰氏染色法是一种用于细菌的染革兰氏染色法是一种用于细菌的染色法。此法将细菌分为两类，即色法。此法将细

4、菌分为两类，即革兰革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌氏阳性菌和革兰氏阴性菌。所谓革兰。所谓革兰氏阳性菌就是用革兰氏染液染色后，氏阳性菌就是用革兰氏染液染色后，再用脱色液处理，细菌仍保留染色液再用脱色液处理，细菌仍保留染色液的颜色；革兰氏阴性菌则相反。这两的颜色；革兰氏阴性菌则相反。这两种菌的种菌的差别在于细胞壁的成分不同差别在于细胞壁的成分不同。大肠杆菌属于革兰氏阴性菌大肠杆菌属于革兰氏阴性菌培养基培养基培养基（培养液）是培养基（培养液）是由人工方法配制由人工方法配制而成的，专供微生物生长繁殖使用的混而成的，专供微生物生长繁殖使用的混合营养合营养液。液。固体培养基固体培养基和和液体培养基、半固体培养基

5、液体培养基、半固体培养基。1.1.培养基的类型培养基的类型(三三)细菌的培养细菌的培养成分区别：琼脂成分区别：琼脂2.2.不同的微生物往往需要采用不同的不同的微生物往往需要采用不同的培养基配方培养基配方 3.3.不管哪种培养基，一般都含有不管哪种培养基，一般都含有水水、碳碳源源、和、和氮源氮源、无机盐无机盐、生长因子生长因子等等营养营养物质，另外还需要满足微生物生长对物质，另外还需要满足微生物生长对pH pH、氧气氧气、渗透压渗透压的要求的要求细菌喜荤，霉菌喜素细菌喜荤，霉菌喜素大肠杆菌配方：酵母提取物大肠杆菌配方：酵母提取物0.25g蛋白胨蛋白胨0.5gNacl0.5g琼脂琼脂1g水水:50

6、ml4.4.培养基的用途培养基的用途液体培养基：液体培养基：扩增细菌扩增细菌、工业生产、工业生产固体培养基：固体培养基：纯化（分离），纯化（分离），鉴定、保鉴定、保藏菌种藏菌种n单个或少数细菌在单个或少数细菌在固体培养基固体培养基上大量繁殖上大量繁殖时，就会形成一个肉眼可见的，具有一定时，就会形成一个肉眼可见的，具有一定形态结构的形态结构的子细胞群体子细胞群体，叫做菌落，叫做菌落。n菌落是菌落是鉴定菌种鉴定菌种的重要依据。的重要依据。菌落菌落液体培养基：液体培养基：表面生长表面生长均匀混浊生长均匀混浊生长沉淀生长沉淀生长无菌技术无菌技术1.1.无菌技术的概念无菌技术的概念无菌操作泛指在培养微生

7、物的操作中，无菌操作泛指在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法。所有防止杂菌污染的方法。成功地培养微生物的关键。成功地培养微生物的关键。（）（）消毒定义：消毒定义：2.2.消毒与灭菌的概念及两者的区别消毒与灭菌的概念及两者的区别（2 2）灭菌的定义：）灭菌的定义：3.3.常用的消毒与灭菌的方法常用的消毒与灭菌的方法是指杀灭大部分病原微生物的方法。是指杀灭大部分病原微生物的方法。是指杀灭或清除环境中一切微生物（包括是指杀灭或清除环境中一切微生物（包括芽胞芽胞、孢子孢子）的方法的方法消毒的方法：消毒的方法：1 1、100100煮沸煮沸5-6min5-6min2 2、巴氏消毒法：、巴氏消毒法：

8、70-75 70-75 下煮下煮30min30min或或 80 80 下煮下煮15min15min3 3、用、用75%75%酒精、新洁尔灭等进行皮肤消毒酒精、新洁尔灭等进行皮肤消毒4 4、氯气消毒水源、氯气消毒水源5 5、紫外线消毒、紫外线消毒灭菌的方法：灭菌的方法：1 1、灼烧灭菌、灼烧灭菌2 2、干热灭菌：、干热灭菌：160-170 160-170 下加热下加热1-2h。3、高压蒸气灭菌：、高压蒸气灭菌：100kPa、121下维持下维持15-30min.1 1、灼烧灭菌、灼烧灭菌灭菌的方法：灭菌的方法：2 2、干热灭菌：、干热灭菌：160-170 160-170 下加热下加热1-2h1-2

9、h。3 3、高压蒸气灭菌：、高压蒸气灭菌：100kPa100kPa、121 121 下下维持维持15-30min.15-30min.1.1.无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？外来微生物污染外，还有什么目的？2.2.请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的方法。如果需要，请选择合适的方法。（1 1）培养细菌用的培养基与培养皿培养细菌用的培养基与培养皿（2 2）玻棒、试管、烧瓶和吸管玻棒、试管、烧瓶和吸管（3 3）实验操作者的双手实验操作者的双手答：无菌技

10、术还能有效避免操作者自身被微生物感染。答：无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。答：（答：（1）、（）、（2）需要灭菌；（）需要灭菌；（3）需要消毒。）需要消毒。实验用具nLB固体培养基固体培养基n大肠杆菌菌液（大肠杆菌菌液（LB液体培养基）液体培养基）n培养皿培养皿n接种环接种环n酒精棉酒精棉n酒精灯酒精灯n镊子、火柴、记号笔镊子、火柴、记号笔配制培养基配制培养基包器材包器材灭菌灭菌菌种扩增菌种扩增倒平板倒平板接种、划线接种、划线培养培养观察记录观察记录实验流程二、大肠杆菌的培养和分离实验操作二、大肠杆菌的培养和分离实验操作（一）培养基的配置与灭菌（一）培养基的配置与灭菌取取2个个25

11、0ml的三角瓶中分别装入的三角瓶中分别装入50mlLB液体培养液体培养基和基和50mlLB固体培养基（刚配好，尚未凝固），加上固体培养基（刚配好，尚未凝固），加上封口膜，牛皮纸包装后高压锅灭菌封口膜，牛皮纸包装后高压锅灭菌15min。LB液体培养基液体培养基细菌的扩大培养细菌的扩大培养LB固体培养基固体培养基细菌的划线分离细菌的划线分离封口膜：既通气封口膜：既通气又不使菌进入又不使菌进入（二）倒平板（二）倒平板灭菌后的培养基在灭菌后的培养基在无菌操作台无菌操作台上倒入上倒入4个培养皿中，倒后个培养皿中，倒后立即置于立即置于水平水平位置上，轻轻晃动，使培养基铺满平皿底部，位置上，轻轻晃动，使培养

12、基铺满平皿底部，待凝，使之形成平面待凝，使之形成平面注意事项：注意事项：1.培养基灭菌后，需要冷却到培养基灭菌后，需要冷却到60左右时，才能用来左右时，才能用来倒平板倒平板2.灭菌及消毒：无菌操作台用超净紫外灯和过滤风灭灭菌及消毒：无菌操作台用超净紫外灯和过滤风灭菌；桌面及人手用酒精棉球消毒菌；桌面及人手用酒精棉球消毒3.操作时右手无名指和小指操作时右手无名指和小指夹住封口膜夹住封口膜,另外三指持三另外三指持三角瓶角瓶,左手拿培养皿并打开上盖的一边左手拿培养皿并打开上盖的一边,在在酒精灯火焰旁酒精灯火焰旁操作操作.4.需要使锥形瓶的瓶口通过火焰，需要使锥形瓶的瓶口通过火焰，灼烧灭菌灼烧灭菌5.

13、平板冷凝后，要将平板冷凝后，要将平板倒置平板倒置,既可以使培养基表面的既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染基，造成污染.（三）大肠杆菌的扩大培养（三）大肠杆菌的扩大培养将斜面上培养的大肠杆菌菌种接种到将斜面上培养的大肠杆菌菌种接种到灭菌后的液体灭菌后的液体培养基培养基中中,使其在使其在37摇床培养摇床培养12小时。小时。注意事项注意事项:1.火焰旁火焰旁从斜面上用接种环取菌从斜面上用接种环取菌;2.取菌前取菌前接种环要接种环要用酒精灯用酒精灯灼烧灼烧灭菌灭菌,冷却后方能取菌冷却后方能取菌;3.取菌后封口膜和

14、棉塞复原取菌后封口膜和棉塞复原.菌种扩增摇床震荡培养摇床震荡培养12h（于（于LB液体培养基中）液体培养基中）本图来自十一学校（四四）大肠杆菌的划线分离）大肠杆菌的划线分离分离方法分离方法:划线分离法和涂布分离法划线分离法和涂布分离法1、划线分离法、划线分离法无菌操作台上用接种环取菌后在固体培养基的无菌操作台上用接种环取菌后在固体培养基的平板上连续划线平板上连续划线.不能使用脱不能使用脱脂棉，否则脂棉，否则容易吸水，容易吸水，造成污染。造成污染。一旦划破，会造成划线不均匀，难一旦划破，会造成划线不均匀，难以达到分离单菌落的目的；以达到分离单菌落的目的；二是存留在划破处的单个细胞无法二是存留在划

15、破处的单个细胞无法形成规矩的菌落，菌落会沿着划破形成规矩的菌落，菌落会沿着划破处生长，会形成一个条状的菌落。处生长，会形成一个条状的菌落。（四四）大肠杆菌的划线分离）大肠杆菌的划线分离注意事项注意事项:1.接种环接种环只蘸一次菌液只蘸一次菌液,但要在培养基不同位置但要在培养基不同位置连续划连续划线多次线多次.2.划线划线首尾不能相接首尾不能相接3.划线后划线后,培养皿培养皿倒置培养倒置培养1224h1、划线分离法、划线分离法 1.1.为什么在操作的第一步以及每次划线之前为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种

16、环吗？为什么？要灼烧接种环吗？为什么？答：操作的第一步灼烧接种环是为了答：操作的第一步灼烧接种环是为了避免接避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划每次划线前灼烧接种环是为了线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。目逐渐减少，以便得到菌落。划线结束后灼烧划线结束后灼烧接种环

17、，能及时接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。免细菌污染环境和感染操作者。2.2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？再进行划线？答：以免接种环温度太高，杀死菌种。答：以免接种环温度太高，杀死菌种。3.3.在作第二次以及其后的划线操作时，为在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？什么总是从上一次划线的末端开始划线？答：答：划线后，线条末端细菌的数目比线条起划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，始处要少，每次从上一次划线的末端开始

18、，能能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。分离后分离后,一个菌体一个菌体便会形成一个菌便会形成一个菌落落,这是这是消除污染消除污染杂菌的通用方法杂菌的通用方法,也是用于也是用于筛选高筛选高表达量菌株表达量菌株的最的最简便方法之一简便方法之一2、涂布分离法、涂布分离法:是指将培养的菌液稀释一定的倍数是指将培养的菌液稀释一定的倍数,然后取一定量然后取一定量稀释液加在固体培养基上稀释液加在固体培养基上,用玻璃刮刀涂布在培养基平面上用玻璃刮刀涂布在培养基平面上.划线分离法和涂布分离法

19、哪个更好呢？划线分离法和涂布分离法哪个更好呢？划线分离：划线分离：方法简单，但单菌落较难分开。方法简单，但单菌落较难分开。涂布分离：涂布分离：单菌落更易分开，但操作复杂。单菌落更易分开，但操作复杂。（五五）大肠杆菌分离后保存）大肠杆菌分离后保存1 1、临时保藏：接种到固体斜面培养基，菌落长成、临时保藏：接种到固体斜面培养基，菌落长成后置于后置于44冰箱保存。冰箱保存。2 2、长期保存：甘油冷冻管藏法、长期保存：甘油冷冻管藏法1.如何操作才可以尽量避免被杂菌污染如何操作才可以尽量避免被杂菌污染?(1)(1)胆大心细，操作快捷。（胆大心细，操作快捷。（2 2）注意灭菌操作）注意灭菌操作原则，灭菌彻

20、底，降低环境污染概率。（原则，灭菌彻底，降低环境污染概率。（3 3）注）注意微生物生长条件，如意微生物生长条件，如PHPH、渗透压、温度等。、渗透压、温度等。细菌喜碱，喜蛋白质，喜细菌喜碱，喜蛋白质，喜3737度；霉菌喜酸，喜度；霉菌喜酸，喜糖，喜糖，喜25-3025-30度度2.在培养后如何判断是否有杂菌污染在培养后如何判断是否有杂菌污染?（1）菌落的形态菌落的形态看，是否湿润，透明，粘稠，颜色看，是否湿润，透明，粘稠，颜色等。是区别细菌、酵母、放线菌和霉菌关键指标。等。是区别细菌、酵母、放线菌和霉菌关键指标。（2）显微镜观察其形态、大小显微镜观察其形态、大小、看是否有菌丝、孢、看是否有菌丝

21、、孢子、芽孢。是区别细菌、酵母、放线菌和霉菌关键指子、芽孢。是区别细菌、酵母、放线菌和霉菌关键指标。标。（3）上述方法较难区别同类的不同物种，需借助化）上述方法较难区别同类的不同物种，需借助化学和进一步的形态观察，如用学和进一步的形态观察，如用革兰氏染色法革兰氏染色法等。等。3.进行恒温培养时为什么要将培养皿倒置进行恒温培养时为什么要将培养皿倒置?恒温培养时，培养基中的水分会以水蒸气恒温培养时，培养基中的水分会以水蒸气的形式蒸发，倒放培养皿则会使水蒸气凝的形式蒸发，倒放培养皿则会使水蒸气凝结成水滴留在盖上；如果正放，则水分形结成水滴留在盖上；如果正放，则水分形成的水滴会落入培养基表面并扩散开。

22、如成的水滴会落入培养基表面并扩散开。如果培养皿中已形成菌落，则会导致菌随水果培养皿中已形成菌落，则会导致菌随水扩散，很难再分成单菌落，达不到分离目扩散，很难再分成单菌落，达不到分离目的。的。4.实验完成后实验完成后,接种过细菌的器皿应如何处理接种过细菌的器皿应如何处理?所有接触过菌的器皿都要先高压灭菌后所有接触过菌的器皿都要先高压灭菌后再洗涤（特别是培养基）；使用后的废再洗涤（特别是培养基）；使用后的废弃物也要高压灭菌后再抛弃弃物也要高压灭菌后再抛弃5.如果分离的是转基因的大肠杆菌如果分离的是转基因的大肠杆菌,如何保证不被普通的如何保证不被普通的大肠杆菌所污染大肠杆菌所污染?转基因用的质粒不是

23、细菌中原有的，而是经转基因用的质粒不是细菌中原有的，而是经过改造的，通常加入了抗性基因的过改造的，通常加入了抗性基因的DNADNA序列，序列，所以可用含有相应抗生素的培养基对菌体进所以可用含有相应抗生素的培养基对菌体进行培养。行培养。【课堂练习课堂练习】例例1 1关微生物营养物质的叙述中，正确的是（关微生物营养物质的叙述中，正确的是（）A.A.是碳源的物质不可能同时是氮源是碳源的物质不可能同时是氮源 B.B.凡碳源都提供能量凡碳源都提供能量 C.C.除水以外的无机物只提供无机盐除水以外的无机物只提供无机盐 D.D.无机氮源也能提供能量无机氮源也能提供能量D例例2 2下面对发酵工程中灭菌的理解下

24、面对发酵工程中灭菌的理解不正确不正确不正确不正确的是的是（）A.A.防止杂菌污染防止杂菌污染 B.B.接种前菌种要进行灭菌接种前菌种要进行灭菌C.C.培养基和发酵设备都必须灭菌培养基和发酵设备都必须灭菌 D.D.灭菌必须在接种前灭菌必须在接种前B编号编号成分成分含量含量粉状硫粉状硫10g10g（NHNH4 4）2 2SOSO4 40.4g0.4gK K2 2HPOHPO4 44.0g4.0gMgSOMgSO4 49.25g9.25gFeSOFeSO4 40.5g0.5gCaClCaCl2 20.5g0.5gH H2 2OO100ml100ml例例3 3右表是某微生物培右表是某微生物培养基成分，

25、请据此回答：养基成分，请据此回答：（1 1）右表培养基可培养）右表培养基可培养的微生物类型是的微生物类型是 。（2 2）若不慎将过量）若不慎将过量NaClNaCl加入培养基中。加入培养基中。如不想浪费此培养基，如不想浪费此培养基，可再加入可再加入 .自养型微生物自养型微生物含碳有机物含碳有机物（3 3）若除去成分）若除去成分，加入（，加入（CH2OCH2O），），该培养基可用于培养该培养基可用于培养 。（4 4）表中营养成分共有）表中营养成分共有 类。类。（5 5）不论何种培养基，在各种成分都）不论何种培养基，在各种成分都溶化后分装前，要进行的是溶化后分装前，要进行的是 。（6 6）右表中各成分重量确定的原则是）右表中各成分重量确定的原则是 。（7 7）若右表培养基用于菌种鉴定，应）若右表培养基用于菌种鉴定，应该增加的成分该增加的成分 。固氮微生物固氮微生物3调整调整pHpH依微生物的生长需要确定依微生物的生长需要确定琼脂（或凝固剂）琼脂（或凝固剂）