第九章 吸光光度法.ppt

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1、第九章 吸光光度法 9.1 9.1 吸光光度法的特点吸光光度法的特点9.2 9.2 吸光光度法的原理吸光光度法的原理9.3 9.3 显色反应和显色条件的选择显色反应和显色条件的选择9.4 9.4 测量条件的选择测量条件的选择9.5 9.5 目视比色法和光度计的基本部件目视比色法和光度计的基本部件9.69.6*吸光光度法的应用吸光光度法的应用1了解吸光光度法的特点；2理解并掌握吸光光度法的原理，掌握朗伯比尔定律的 数学表达式及其意义并能进行有关计算；3了解显色反应的要求，掌握显色反应条件的选择；4掌握测量条件的选择；5了解吸光光度分析方法和分光光度计基本原理和结构。学习目标学习目标9.1 9.1

2、 吸光广度法的特点吸光广度法的特点分分光光光光度度法法 是基于物质分子对光的选择性吸收而建立起来的分析方法。按物质吸收光的波长不同，可分为可见分光光度法、紫外分光光度法及红外分光光度法。特点：*灵敏度较高（10-510-6molL-1），适用于微量组分的测定。但相对误差较大（25%）。*具有操作方便、仪器设备简单、灵敏度和选择性较好等优点，为常规的仪器分析方法。第九章第九章 吸光光度法吸光光度法 光度法：结果0.048%0.052%,满足要求容量法：V(K2Cr2O7)0.02mL,测不准重量法：m(Fe2O3)0.14mg,称不准例例:含Fe约0.05%的样品,称0.2g,则 m(Fe)0.

3、1mg光度分析光度分析：微量组分(10-310-6),相对误差1%5%依据物理或物理化学性质,需要特殊的仪器化学分析化学分析：常量组分(1%),相对误差 0.1%0.2%依据化学反应,使用玻璃仪器 准确度高准确度高灵敏度高灵敏度高9.29.2 吸光光度法的基本原理吸光光度法的基本原理 光是一种电磁波。所有电磁波都具有波粒二象性。光的波长、频率与光速c的关系为：（9-1）光速在真空中等于2.9979108ms-1。光子的能量与波长的关系为：（9-2）式中E为光子的能量；v为频率；h为普朗克常数，为6.62610-34JS。一、物质的颜色及对光的选择性吸收一、物质的颜色及对光的选择性吸收远紫外远紫

4、外近紫外近紫外 可见可见近红外近红外中红外中红外 远红外远红外（真空紫外）（真空紫外）10nm200nm200nm 380nm380nm 780nm780 nm 2.5 m2.5 m 50 m50 m 300 m光学光谱区光学光谱区二二、物质的颜色与光的关系物质的颜色与光的关系单色光单色光:只具有一种波长的光。混合光混合光:由两种以上波长组成的光。白白光光:是由红、橙、黄、绿、青、蓝、紫等各种色光按一定比例混合而成的。物物质质的的颜颜色色:是由于物质对不同波长的光具有选择性的吸收作用而产生的。例如：硫酸铜溶液因吸收白光中的黄色光而呈蓝色；高锰酸钾溶液因吸白光中的绿色光而呈紫色。因此，物质呈现的

5、颜色和吸收的光颜色之间是互补关系。如果把两种适当颜色的光按一定的强度比例混合也可以得白光，这两种光就叫互补色光互补色光互补色光互补色光。如果吸收光在可见区,吸收光的颜色与透过光的颜色为互补关系,物质呈现透过物质呈现透过物质呈现透过物质呈现透过光的颜色光的颜色光的颜色光的颜色。如果吸收光在紫外区，则物质不呈现颜色第九章第九章 吸光光度法吸光光度法/nm颜色颜色互补光互补光400-450紫黄绿450-480蓝蓝黄黄480-490绿蓝绿蓝橙橙490-500蓝绿蓝绿红红500-560绿绿红紫红紫560-580黄绿黄绿紫紫580-610黄黄蓝蓝610-650橙橙绿蓝绿蓝650-760红红蓝绿蓝绿吸收光谱

6、或吸收曲线吸收光谱或吸收曲线 测定某种物质对不同波长单色光的吸收程度，以波长为横坐标，吸光度为纵坐标作图。KMnO4溶液对波长525nm附近的绿色光吸收最强，而对紫色光吸收最弱。光吸收程度最大处的叫做最大吸收波长最大吸收波长，用max表示。不同浓度的KMnO4溶液所得的吸收曲线都相似，其最大吸收波长不变，只是相应的吸光度大小不同。苯苯(254nm)甲苯甲苯(262nm)A 230 250 270 苯苯和和甲苯甲苯在环己烷中的吸收光谱在环己烷中的吸收光谱三三、光的吸收定律光的吸收定律朗伯朗伯朗伯朗伯-比尔比尔比尔比尔定律定律定律定律第九章 吸光光度法1.1.朗伯定律朗伯定律A=lg(IA=lg(

7、I0 0/I)=kb/I)=kb2.2.比尔定律比尔定律A=lg(IA=lg(I0 0/I)=k/I)=k”c c第九章第九章 吸光光度法吸光光度法光源光源检测器检测器0.00吸光度吸光度检测器检测器b样品样品光源光源0.22吸光度吸光度光源光源检测器检测器0.44吸光度吸光度b样品样品b样品样品第九章第九章 吸光光度法吸光光度法 吸光度吸光度0.00光源光源检测器检测器 吸光度吸光度0.22光源光源检测器检测器b 吸光度吸光度0.42光源光源检测器检测器bT透光率（透射比）吸光度与透光率的关系吸光度与透光率的关系:A=lg(I0/I)=lg(1/T)=-lgT=kbc 1.吸光系数 a当c的

8、单位用gL-1表示时，用a表示.A abc a的单位:Lg-1cm-1 2.摩尔吸光系数 当c的单位用molL-1表示时，用表示.A bc 的单位:Lmol-1cm-1与a的关系为:=Ma 式中M为吸光物质的摩尔质量例例9-1 浓度为25.0 g/50mL的Cu2+溶液，用双环已酮草酰二腙分光光度法测定，于波长600nm处，用2.0cm比色皿测得T=50.1%，求吸光系数a和摩尔吸光系数。已知M(Cu)=64.0。解 已知T=0.501，则A=lgT=0.300，b=2.0cm,则根据朗伯比尔定律 A=abc，而=Ma=64.0gmol-13.00102 Lg-1cm-1=1.92104(Lm

9、ol-1cm-1)例例9-29-2 某有色溶液，当用1cm比色皿时，其透光度为T，若改用2cm比色皿，则透光度应为多少？解解:由A=-lgT=abc可得 T=10-abc 当b1=1cm时，T1=10-ac=T 当b2=2cm时，T2=10-2ac=T2 定量分析时，通常液层厚度是相同的，按照比尔定律，浓度与吸光度之间的关系应该是一条通过直角坐标原点的直线。但在实际工作中，往往会偏离线性而发生弯曲，见图9-4中的虚线。若在弯曲部分进行定量，将产生较大的测定误差。四四、偏离朗伯一比尔定律的原因偏离朗伯一比尔定律的原因图9-4 对比尔定律的偏离情况 朗伯一比尔定律只对一定波长的单色光才能成立，但在

10、实际工作中，即使质量较好的分光光度计所得的入射光，仍然具有一定波长范围的波带宽度。在这种情况下，吸光度与浓度并不完全成直线关系，因而导致了对朗伯一比尔定律的偏离。所得入射光的波长范围越窄，即“单色光”越纯，则偏离越小。单色光不纯所引起的偏离单色光不纯所引起的偏离由于溶液本身的原因所引起的偏离由于溶液本身的原因所引起的偏离 朗伯比尔定律是建立在均匀、非散射的溶液这个基础上的。如果介质不均匀，呈胶体、乳浊、悬浮状态，则入射光除了被吸收外，还会有反射、散射的损失，因而实际测得的吸光度增大，导致对朗伯比尔定律的偏离。溶质的离解、缔合、互变异构及化学变化也会引起偏离。其中有色化合物的离解是偏离朗伯比尔定

11、律的主要化学因素。例如，显色剂KSCN与Fe3+形成红色配合物Fe(SCN)3，存在下列平衡：Fe(SCN)3 Fe3+3SCN溶液稀释时，上述平衡向右，离解度增大。所以当溶液体积增大一倍时，Fe(SCN)3的浓度不止降低一半，故吸光度降低一半以上，导致偏离朗伯比尔定律。一、显色反应要求一、显色反应要求 这种被测元素在某种试剂的作用下，转变成有色化合物的反应叫显色反应显色反应，所加入试剂称为显色剂显色剂。常见的显色反应大多数是生成配合物的反应，少数是氧化还原反应和增加吸光能力的生化反应。显色剂显色剂9.3 显色反应和显色条件的选择显色反应和显色条件的选择 显色反应的要求显色反应的要求：选选选选

12、择择择择性性性性好好好好 所用的显色剂仅与被测组分显色而与其它共存组分不显色，或其它组分干扰少。灵灵灵灵敏敏敏敏度度度度要要要要足足足足够够够够高高高高 有色化合物有大的摩尔吸光系数，一般应有104105数量级。有有有有色色色色配配配配合合合合物物物物的的的的组组组组成成成成要要要要恒恒恒恒定定定定 显色剂与被测物质的反应要定量进行，生成有色配合物的组成要恒定。生成的有色配合物稳定性好生成的有色配合物稳定性好生成的有色配合物稳定性好生成的有色配合物稳定性好 即要求配合物有较大的稳定常数，有色配合物不易受外界环境条件的影响，亦不受溶液中其它化学因素的影响。有较好的重现性，结果才准确。色差大色差大

13、色差大色差大 有色配合物与显色剂之间的颜色差别要大，这样试剂空白小，显色时颜色变化才明显。二、显色反应条件的选择二、显色反应条件的选择显色剂的用量显色剂的用量显色反应一般可表示为M+R MRM+R MR图图 9-5 吸光度和显色剂用量曲线吸光度和显色剂用量曲线 溶液的酸度 许多显色剂都是有机弱酸或有机弱碱，溶液的酸度会直接影响显色剂的解离程度。对某些能形成逐级配合物的显色反应，产物的组成会随介质酸度的改变而改变，从而影响溶液的颜色。另外，某些金属离子会随着溶液酸度的降低而发生水解，甚至产生沉淀，使稳定性较低的有色配合物的解离。显色温度显色温度 有些反应需要加热。有些显色剂或有色配合物在较高温度

14、下易分解褪色。此外温度对光的吸收及颜色深浅也有影响，要求标准溶液和被测溶液在测定过程中温度一致。显色时间显色时间 显色反应有快慢，有的有色配合物容易褪色，因此不同的显色反应需放置不同的时间，并在一定的时间范围内进行比色测定。副反应的影响副反应的影响 例如，被测金属离子M与显色剂R反应，生成有色配合物MRn，此时，若M有配位效应，R有酸效应，影响M配位反应的完全程度。通常，当金属离子有99%以上被配位时，就可认为反应基本上是完全的。共存离子的影响共存离子的影响 吸光度增加，造成正干扰。被测组分或显色剂的浓度降低，引起负干扰。入射光波长的选择入射光波长的选择 以最大吸收波长max为测量的入射光波长

15、。在此波长处，摩尔吸光系数最大，测定的灵敏度最高。若干扰物在max处也有吸收，在干扰最小的条件下选择吸光度最大的波长。有时为了消除其它离子的干扰，也常常加入掩蔽剂。9.4 测量条件的选择测量条件的选择吸光度读数范围的选择吸光度读数范围的选择 透光度读数误差T是一个常数，但在不同的读数范围内所引起的浓度的相对误差却是不同的。因此，为了减小浓度的相对误差，提高测量的准确度，一般应控制被测液的吸光度A在0.20.7（透光度为65%20%）。当溶液的吸光度不在此范围时，可以通过改变称样量、稀释溶液以及选择不同厚度的比色皿来控制吸光度。参比溶液的选择参比溶液的选择原则:使试液的吸光度能真正反映待测物的浓

16、度。利用空白试验来消除因溶剂或器皿对入射光反射和吸收带来的误差。纯溶剂空白 当试液、试剂、显色剂均为无色时，用纯溶剂（或蒸馏水）作参比溶液。试剂空白 试液无色，而试剂或显色剂有色时，加入相同量的显色剂和试剂,作为参比溶液。试液空白 试剂和显色剂均无色，试液中其它离子有色时，用不加显色剂的溶液作为参比溶液。1.目视比色法第九章第九章 吸光光度法吸光光度法方便、灵敏，准确度差。常用于限界分析。c4c3c2c1c1c2c3c4观察方向第九章 吸光光度法通过滤光片得一窄范围的光通过滤光片得一窄范围的光(几十几十nm)光电比色计结构示意图光电比色计结构示意图灵敏度和准灵敏度和准确度较差确度较差第九章 吸

17、光光度法通过棱镜或光栅得到一束近似的单色光.波长可调,故选择性好,准确度高.光源单色器吸收池检测系统稳压电源分光光度计工作流程示意图第九章 吸光光度法1.光源：光源：发出所需波长范围内的连续光谱，有足够的光强度,稳定。可见光区可见光区：钨灯，碘钨灯(3202500nm)紫外区紫外区：氢灯，氘灯(180375nm)2.单色器：单色器：将光源发出的连续光谱分解为单色光的装置。棱镜棱镜:玻璃3503200nm,石英1854000nm 光栅光栅:波长范围宽,色散均匀,分辨性能好,使用方便3.吸收池：(比色皿)用于盛待测及参比溶液。可见光区：光学玻璃池 紫外区：石英池4.检测器：利用光电效应，将光能转换

18、成 电流讯号。光电池，光电管，光电倍增管5.显示器：低档仪器：刻度显示 中高档仪器：数字显示，自动扫描记录单色器介绍A.棱镜：依据不同波长光通过棱镜时折射率不同入射狭缝准直透镜棱镜聚焦透镜出射狭缝白光红紫12800 600 500400B.光栅：光栅：在镀铝的玻璃表面刻有数量很大的等宽度等间距条痕(600、1200、2400条/mm)。原理：利用光通过光栅时发生衍射和干涉现象而分光.M1M2出射狭缝光屏透镜平面透射光栅光栅衍射示意图第九章 吸光光度法A.硒光电池第九章 吸光光度法红敏管红敏管 625-1000 nm625-1000 nm蓝敏管蓝敏管 200-625 nm200-625 nmNi

19、环（片）碱金属光敏阴极h第九章 吸光光度法160-700 nm160-700 nm1个光电子可产生106107个电子分光光度计的主要类型分光光度计的主要类型单光束型第九章 吸光光度法第九章 吸光光度法标准曲线法标准曲线法 其方法是先配制一系列浓度不同的标准溶液，用选定的显色剂进行显色，在一定波长下分别测定它们的吸光度A。以A为纵坐标，浓度c为横坐标，绘制A-c曲线，若符合朗伯比尔定律，则得到一条通过原点的直线，称为标准曲线。然后用完全相同的方法和步骤测定被测溶液的吸光度，便可从标准曲线上找出对应的被测溶液浓度或含量，这就是标准曲线法。在仪器、方法和条件都固定的情况下，标准曲线可以多次使用而不必

20、重新制作，因而标准曲线法适用于大量的经常性的工作。二二、分光光度测定的方法分光光度测定的方法Blank Standard Sample Sample 标准对照法标准对照法(直接比较法直接比较法)将试样溶液和一个标准溶液在相同条件进行显色、定容，分别测出它们的吸光度，按下式计算被测溶液的浓度。k标=k测 b标=b测所以 要求A与c线性关系良好，被测样品溶液与标准溶液浓度接近，以减少测定误差。用一份标准溶液即可计算出被测溶液的含量或浓度，方便，操作简单。3 3吸光系数法吸光系数法 在没有标准品可供比较测定的条件下，按文献规定条件测定被测物的吸光度，从样品的配制浓度、测定的吸光度及文献查出的吸光系数

21、即可计算样品的含量，因为 则样品含量 例例9-49-4 已知维生素B12在361nm条件下a标=20.7Lg1cm1。精确称取样品30mg，加水溶解稀释至1000mL，在波长361nm下，用1.00cm吸收池测得溶液的吸光度为0.618，计算样品维生素B12的含量。解：A=a样bc则维生素B12的含量=*9.6 吸光光度法的应用吸光光度法的应用 应用:测量试样微量组分 测定配合物的组成及稳定常数、弱酸的解离常数、化学反应的速率常数、催化反应的活化能等.根据分子的紫外光谱数据判断分子的空间构型，确定分子结构。一一、单组分含量测定单组分含量测定实例一实例一：1.1,10-1.1,10-二氮菲测定微

22、量铁二氮菲测定微量铁 该试剂能与该试剂能与FeFe2+2+能形成能形成3 3：1 1的红色配离子：的红色配离子：maxmax=512nm=512nm，为为1.11.110104 4 L Lmolmol1 1cmcm1 1。在在pHpH为为3 3 9 9范范围围内内，反反应应能能迅迅速速完完成成，且且显显色色稳稳定定。在在铁铁含含量量0.50.5 8ug8ugmLmL1 1范范围围内内，浓浓度度与与吸吸光光度度符符合合朗朗伯伯比比尔尔定定律律。用用pH=4.5pH=4.5 5.05.0的的缓缓冲冲液液保保持持其其酸酸度度，并并用用盐盐酸酸羟羟胺胺还还原原其其中中的的FeFe3+3+，用用标标准曲

23、线法进行测定。准曲线法进行测定。实例二：磷钼蓝法测定全磷 用浓硫酸和高氯酸（HClO4）处理样品，使磷的各种形式转变为H3PO4，然后在HNO3介质中，H3PO4与（NH4）2MoO4反应形成磷钼黄杂多酸，反应如下：H3PO4+12(NH4)2MoO4+21HNO3=(NH4)3PO412MoO3+12NH4NO3+12H2O 用适当的还原剂如维生素C将其中的Mo(VI)还原为Mo(V)，即生成蓝色的磷钼蓝，其最大吸收波长为max=660nm，用标准曲线法可测得样品的全磷含量。二二、多组分含量测定多组分含量测定 溶液的总吸光度等于各组分的吸光度之和：A=A1+A2+A3+An吸收峰互不重叠 A

24、、B两组分的吸收峰相互不重叠，则可分别在处用单组分含量测定法测定组分A和B。吸收峰相互重叠吸收峰相互重叠A、B两组分的吸收峰相互重叠，可分别在和处测出A、B两组分的总吸光度A1和A2，然后根据吸光度的加和性列联立方程：在 处，在 处，式中 分别为A和B在波长 处的摩尔吸光系数 分别为A和B在 波长 处的摩尔吸光系数三、配合物组成的测定 物质的量比法物质的量比法 固定一种组分如金属离子M的浓度，改变配位剂R的浓度，分别测定其吸光度。以吸光度A为纵坐标，配位剂与金属离子的浓度比值为横坐标作图。当金属离子全部被配位剂配合后，再增加配位剂，其吸光度亦不会增加了，利用外推法可得一交叉点D，D点所对应的浓度比值就是配合物的配合比。连续变化法连续变化法 设配位反应为 M+nR MRnM为金属离子，R为配合剂。并设cM和cR为溶液中M和R两组分的浓度，cM+cR=c0（常数）金属离子和配位剂的物质的量分数分别为：配制一系列不同xM（或xR）值的溶液，溶液中配合物浓度随xM而改变，当xM（或xR）与形成的配合物组成相当时，即金属离子和配位剂物质的量之比和配合物组成一致时，配合物的浓度最大。根据与最大吸光度对应的x值，即可求出n。