课题2多聚酶链式反应扩增DNA片断.ppt

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1、专题专题5 DNA5 DNA和蛋白质技术和蛋白质技术课题课题2 2多聚酶链式反应扩增多聚酶链式反应扩增DNADNA片断片断分子生物学研究中最强大的实验技术之一分子生物学研究中最强大的实验技术之一分子生物学研究中最强大的实验技术之一分子生物学研究中最强大的实验技术之一其本质是在体外模拟胞内其本质是在体外模拟胞内其本质是在体外模拟胞内其本质是在体外模拟胞内DNADNADNADNA分子复制的过程分子复制的过程分子复制的过程分子复制的过程美美美美国国国国科科科科学学学学家家家家穆穆穆穆利利利利斯斯斯斯(K K K K.B B B B.M M M Mu u u ul l l ll l l li i i

2、is s s s)发发发发明明明明了了了了P P P PC C C CR R R R技技技技术术术术1 1 1 19 9 9 99 9 9 93 3 3 3年年年年诺诺诺诺贝贝贝贝尔尔尔尔奖奖奖奖 .DNA.DNA分子的结构分子的结构C C、H H、O O、N N、P P1.1.元素组成：元素组成：脱氧核苷酸脱氧核苷酸(dNMPdNMP)2.2.基本单位基本单位:一一.基础知识基础知识脱氧核脱氧核苷酸苷酸脱氧核苷脱氧核苷磷酸磷酸脱氧核糖脱氧核糖含氮含氮碱基碱基嘌呤嘌呤嘧啶嘧啶腺嘌呤（腺嘌呤（A A）鸟嘌呤（鸟嘌呤（G G）胞嘧啶（胞嘧啶（C C）胸腺嘧啶（胸腺嘧啶（T T）一个核苷酸上的一个核

3、苷酸上的一个核苷酸上的一个核苷酸上的磷酸基团上的磷酸基团上的磷酸基团上的磷酸基团上的“OHOHOHOH”和和和和另一个核苷酸分子的另一个核苷酸分子的另一个核苷酸分子的另一个核苷酸分子的第第第第3 3 3 3位碳原子上的羟基位碳原子上的羟基位碳原子上的羟基位碳原子上的羟基之间失去一分子水，形成之间失去一分子水，形成之间失去一分子水，形成之间失去一分子水，形成磷酸二酯键，磷酸二酯键，磷酸二酯键，磷酸二酯键，即即即即在在在在相邻的相邻的相邻的相邻的两个脱氧核苷酸的两个脱氧核苷酸的两个脱氧核苷酸的两个脱氧核苷酸的3 3 3 3和和和和5 5 5 5碳原子碳原子碳原子碳原子之间形成磷酸二酯之间形成磷酸二

4、酯之间形成磷酸二酯之间形成磷酸二酯键。数量庞大的四种脱氧核苷酸通过键。数量庞大的四种脱氧核苷酸通过键。数量庞大的四种脱氧核苷酸通过键。数量庞大的四种脱氧核苷酸通过3 3 3 3、5 5 5 5、磷酸二酯键彼、磷酸二酯键彼、磷酸二酯键彼、磷酸二酯键彼此连接起来形成脱氧核苷酸链。此连接起来形成脱氧核苷酸链。此连接起来形成脱氧核苷酸链。此连接起来形成脱氧核苷酸链。通常将通常将通常将通常将DNADNADNADNA的的的的羟基羟基羟基羟基“OHOHOHOH”末端末端末端末端称为称为称为称为3 3 3 3端，而磷酸基团的末端称为端，而磷酸基团的末端称为端，而磷酸基团的末端称为端，而磷酸基团的末端称为5 5

5、 5 5端端端端3.3.脱氧核苷酸链的形成脱氧核苷酸链的形成脱氧脱氧核苷核苷酸链酸链结构结构简图简图4.4.DNADNA分子的双螺旋结构分子的双螺旋结构.DNA.DNA分子是由分子是由 的（即一条的（即一条链为链为3 35 5，另一条链为，另一条链为5 53 3）脱氧）脱氧核苷酸长链盘旋而成的规则核苷酸长链盘旋而成的规则 结构。结构。.与与 交替连结，排列在外侧，构交替连结，排列在外侧，构成基本骨架；成基本骨架；排列在链的内侧。排列在链的内侧。.两条链上的碱基通过两条链上的碱基通过 连结起来，形成连结起来，形成碱基对。碱基对的组成有特定的规律：即腺嘌碱基对。碱基对的组成有特定的规律：即腺嘌呤一

6、定与呤一定与 配对，配对，一定同胞嘧一定同胞嘧啶配对。啶配对。双螺旋双螺旋两条反向平行两条反向平行脱氧核糖脱氧核糖磷酸磷酸碱基碱基氢键氢键胸腺嘧啶胸腺嘧啶鸟嘌呤鸟嘌呤2 2、时期、时期有丝分裂间期或减数第一次分裂前的间期有丝分裂间期或减数第一次分裂前的间期3 3、场所、场所细胞核（主）细胞核（主）（线粒体、叶绿体）（线粒体、叶绿体）4 4、模板、模板DNADNA母链母链1 1、概念、概念由一个由一个DNADNA形成两个完全相同的形成两个完全相同的DNADNA的过程的过程.DNA.DNA的复制的复制5 5、原材料、原材料脱氧核苷酸脱氧核苷酸6 6、基本条件、基本条件酶、酶、ATPATP、原料、模

7、板、原料、模板7 7、复制过程、复制过程 DNA DNA的解旋的解旋 亲代亲代DNADNA分子利用细胞提供的能量在解旋酶分子利用细胞提供的能量在解旋酶的作用下氢键断裂，部分双螺旋链解旋为两条的作用下氢键断裂，部分双螺旋链解旋为两条平行的双链平行的双链 RNA RNA引物的合成引物的合成以单股以单股DNADNA为模板，在引物酶的作用下合成为模板，在引物酶的作用下合成小段的小段的RNARNA引物。引物。DNA DNA的生成的生成以单股的以单股的DNADNA为模板，在为模板，在DNADNA聚合酶的作用下，聚合酶的作用下，在在RNARNA引物的末端由引物的末端由5 5端端3 3端合成端合成DNADNA

8、。边解旋边复制边解旋边复制(过程）过程）8 8、复制特点、复制特点半保留复制（结果）半保留复制（结果）9 9、遵循原则、遵循原则碱基互补配对原则碱基互补配对原则1010、精确复制的原因、精确复制的原因1111、复制的意义、复制的意义DNADNA分子通过复制使遗传信息从亲代传给了分子通过复制使遗传信息从亲代传给了后代，从而保持了遗传信息的连续性。后代，从而保持了遗传信息的连续性。规则的双螺旋结构为复制提供了精确的模板规则的双螺旋结构为复制提供了精确的模板碱基互补配对能力保证了复制准确无误的进行碱基互补配对能力保证了复制准确无误的进行参与的组分参与的组分参与的组分参与的组分在在在在DNADNADN

9、ADNA复制中的作用复制中的作用复制中的作用复制中的作用解旋酶解旋酶解旋酶解旋酶DNADNADNADNA母链母链母链母链4 4 4 4种脱氧核苷酸种脱氧核苷酸种脱氧核苷酸种脱氧核苷酸DNADNADNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶引物引物引物引物总结：胞内总结：胞内DNADNA复制的基本体系复制的基本体系打开打开打开打开DNADNADNADNA双链双链双链双链提供提供提供提供DNADNADNADNA复制的模板复制的模板复制的模板复制的模板合成子链的原料合成子链的原料合成子链的原料合成子链的原料催化合成催化合成催化合成催化合成DNADNADNADNA子链子链子链子链使使使使DNADNADNADN

10、A聚合酶能够从引物的聚合酶能够从引物的聚合酶能够从引物的聚合酶能够从引物的3 3 3 3端开始连接脱氧核苷酸端开始连接脱氧核苷酸端开始连接脱氧核苷酸端开始连接脱氧核苷酸.PCR(PCR(多聚酶链式反应）多聚酶链式反应）2.DNA2.DNA聚合酶特性聚合酶特性不能从头合成不能从头合成DNADNA，只能从，只能从DNADNA的的33端开始延端开始延伸伸DNADNA链，因此，链，因此，DNADNA复制需要引物。复制需要引物。3.DNA3.DNA聚合酶作用过程聚合酶作用过程当引物与当引物与DNADNA母链通过碱基互补配对结合后，母链通过碱基互补配对结合后，DNADNA聚合酶就能从引物的聚合酶就能从引物

11、的33端开始延伸端开始延伸DNADNA链，链，DNADNA的合成方向的合成方向总是从子链的总是从子链的55端向端向33端延端延伸。伸。1.1.定义：定义：是一种体外迅速扩增是一种体外迅速扩增DNADNA片段的技术。能以极片段的技术。能以极少量的少量的DNADNA为模板，在几小时内复制出上百万为模板，在几小时内复制出上百万份的份的DNADNA拷贝。拷贝。1234522557294时间（时间（minmin）温度（）适温延伸高温变性低温复性重复13步30轮DNA双链双链单链单链变性（加热变性（加热80-100）复性（缓慢冷却）复性（缓慢冷却）4.PCR4.PCR原理原理.在在8080100100C

12、C的温度范围内，的温度范围内，DNADNA的双螺旋结的双螺旋结构将解体，双链分开，这个过程称为变性。构将解体，双链分开，这个过程称为变性。.当温度缓慢降低后，当温度缓慢降低后，两条彼此分离的两条彼此分离的DNADNA链链又会重新结合成双链。又会重新结合成双链。.PCR.PCR利用了利用了DNADNA的热变性原理，通过控制温度的热变性原理，通过控制温度来控制双链的解聚与结合，现在使用的来控制双链的解聚与结合，现在使用的PCRPCR仪实仪实质上也是一台能够自动调控温度的仪器。质上也是一台能够自动调控温度的仪器。高温解决了打开双链的问题，但是，又导致高温解决了打开双链的问题，但是，又导致高温解决了打

13、开双链的问题，但是，又导致高温解决了打开双链的问题，但是，又导致DNADNADNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶失活的问题，耐高温的失活的问题，耐高温的失活的问题，耐高温的失活的问题，耐高温的TaqTaqTaqTaq DNA DNA DNA DNA聚合酶解决了高温导致聚合酶解决了高温导致聚合酶解决了高温导致聚合酶解决了高温导致DNADNADNADNA聚合酶失活的问题，促成了聚合酶失活的问题，促成了聚合酶失活的问题，促成了聚合酶失活的问题，促成了PCRPCRPCRPCR技术的自动化。技术的自动化。技术的自动化。技术的自动化。5.Taq DNA5.Taq DNA聚合酶的应用聚合酶的应用6.6.需要

14、为需要为PCRPCR反应提供的物质反应提供的物质缓冲液缓冲液、DNADNA模板，分别与两条模板链相结合模板，分别与两条模板链相结合的两种引物，四种脱氧核苷酸，耐热的的两种引物，四种脱氧核苷酸，耐热的DNADNA聚聚合酶，同时通过控制温度使合酶，同时通过控制温度使DNADNA复制在体外反复制在体外反复进行。复进行。PCRPCR技术是技术是8080年代中期发展起来的体外核酸年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出。简便、重复性好、易自动化等突出。7.PCR7.PCR技术的特点：技术的特点：8.8.细

15、胞内和细胞外细胞内和细胞外DNADNA复制环境的区别复制环境的区别体内体内DNADNA的复制的复制PCRPCR模板模板模板模板(母链母链母链母链)引物引物引物引物原料原料原料原料:dNTPdNTPdNTPdNTP聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶反应环境反应环境反应环境反应环境细胞内源细胞内源细胞内源细胞内源引物合成酶引物合成酶引物合成酶引物合成酶细胞内的环境细胞内的环境细胞内的环境细胞内的环境细胞内源细胞内源细胞内源细胞内源细胞内源细胞内源细胞内源细胞内源外源加入外源加入外源加入外源加入缓冲液缓冲液缓冲液缓冲液外源加入外源加入外源加入外源加入外源加入外源加入外源加入外源加入外源加入外源加入外源加入外源

16、加入.PCR.PCR过程需要的引物不是过程需要的引物不是RNARNA，而是人工合，而是人工合成的成的DNADNA单链，其长度通常为单链，其长度通常为20203030个脱氧核个脱氧核苷酸苷酸9.9.细胞内复制和细胞内复制和PCRPCR不同点不同点.PCR.PCR过程中过程中DNADNA的解旋不依靠解旋酶，而是通的解旋不依靠解旋酶，而是通过对反应温度的控制来实现的过对反应温度的控制来实现的10.PCR10.PCR的重要应用：的重要应用：广泛应用于遗传病的诊断、刑侦破案、古生物广泛应用于遗传病的诊断、刑侦破案、古生物学、基因克隆和学、基因克隆和DNADNA序列测定等。序列测定等。1 1、PCRPCR

17、仪仪.设备及用具设备及用具实质上一台能够实质上一台能够自动调控温度自动调控温度的仪器。的仪器。二二.PCR.PCR的实验操作的实验操作2 2、微量离心管、微量离心管一种一种薄壁塑料管薄壁塑料管，总容积为，总容积为0.5ml0.5ml3 3、微量移液器、微量移液器用于用于定量转移定量转移PCRPCR配方中的配方中的液液体，体，其上的一次性吸液枪头其上的一次性吸液枪头用一次更换一次。用一次更换一次。1.1.准备准备2.2.移液移液.实验操作步骤实验操作步骤按照按照PCRPCR反应体系的配方将所需用的反应体系的配方将所需用的试剂摆放在实验桌上。试剂摆放在实验桌上。用微量移液器按照用微量移液器按照PC

18、RPCR反应体系配方反应体系配方往微量离心管里面加入各种试剂。往微量离心管里面加入各种试剂。混合后盖严微量离心管口的盖子，混合后盖严微量离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁。用手指轻轻弹击管壁。3.3.混合混合过程：将微量离心管放在离心机上过程：将微量离心管放在离心机上,离心离心约约10s10s。4.4.离心离心离心目的：使反应液体集中在离心管底部，离心目的：使反应液体集中在离心管底部，提高反应效果。提高反应效果。将离心管放入将离心管放入PCRPCR仪上，设置好仪上，设置好PCRPCR仪的循仪的循环程序。环程序。5.5.反应反应循环数循环数循环数循环数变性变性变性变性复性复性复性复性延伸延伸延伸

19、延伸第一次第一次第一次第一次94949494，10min10min10min10min30303030次次次次94949494，30s30s30s30s55555555，30s30s30s30s72727272，1min1min1min1min最后一次最后一次最后一次最后一次94949494，1min1min1min1min55555555，30s30s30s30s72727272，1min1min1min1minPCRPCR一般经历一般经历三十多次三十多次循环，每次循环可以分循环，每次循环可以分为三个基本步骤为三个基本步骤变性、复性和延伸变性、复性和延伸.变性（模板变性（模板DNADNA解旋

20、）解旋）模板模板DNADNA经加热至经加热至90900 0C C以上。一定时间后，使以上。一定时间后，使模板模板DNADNA双链或经双链或经PCRPCR扩增形成的双链扩增形成的双链DNADNA解离，解离，使成为单链，以便于它与引物结合，为下轮反使成为单链，以便于它与引物结合，为下轮反应作准备。应作准备。.复性（退火）复性（退火）模板模板DNADNA经加热变性成单链后，温度降到经加热变性成单链后，温度降到50500 0C C左右，引物与模板左右，引物与模板DNADNA单链的互补序列配对结单链的互补序列配对结合。合。.延伸延伸DNADNA模板引物结合物在模板引物结合物在TaqDNATaqDNA聚合

21、酶的作聚合酶的作用下以脱氧核苷酸为原料，以母链为模板，按用下以脱氧核苷酸为原料，以母链为模板，按碱基互补配对的原则与半保留复制的原理，合碱基互补配对的原则与半保留复制的原理，合成一条新的成一条新的DNADNA链。链。靶序列靶序列靶序列靶序列靶序列靶序列靶序列靶序列PCR PCR 循环第一步：高温变性循环第一步：高温变性靶序列靶序列靶序列靶序列靶序列靶序列靶序列靶序列引物引物引物引物 引物引物引物引物 5 5 5 53 3 3 35 5 5 55 5 5 53 3 3 35 5 5 53 3 3 33 3 3 3PCR PCR 循环第二步循环第二步 ：引物与靶序列退火：引物与靶序列退火靶序列靶序

22、列靶序列靶序列靶序列靶序列靶序列靶序列引物引物引物引物引物引物引物引物5 5 5 53 3 3 35 5 5 55 5 5 53 3 3 35 5 5 53 3 3 33 3 3 3TaqTaqTaqTaq DNA DNA DNA DNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶PCR PCR 循环第三步循环第三步 ：引物延伸：引物延伸靶序列靶序列靶序列靶序列 靶序列靶序列靶序列靶序列第第1 1个个PCRPCR循环完成后循环完成后 ：得到两个靶序列：得到两个靶序列PCRPCR技术技术高度灵敏，高度灵敏，为了避免外源为了避免外源DNADNA等因素的等因素的污染而造成干扰实验，污染而造成干扰实验，PCRPCR操作时

23、要注意做到：操作时要注意做到：6.6.注意事项注意事项隔离操作区，所用微量离心管、枪头、缓冲隔离操作区，所用微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用必须进行高压灭菌；液以及蒸馏水等在使用必须进行高压灭菌；分装试剂，简化操作程序，使用一次性枪头分装试剂，简化操作程序，使用一次性枪头.理论上理论上DNADNA扩增数目的计算扩增数目的计算三三.课题成果评价课题成果评价1.1.一条一条DNADNA，复制，复制n n次，次，DNADNA为为2 2n n2.a2.a条条DNADNA，复制，复制n n次，次，DNADNA为为a a2 2n n.实验中实验中DNADNA含量的测定含量的测定1.1.原理原理

24、可以通过计算可以通过计算DNADNA含量来评价扩增的效果，含量来评价扩增的效果，DNADNA在在260nm260nm的紫外线波段有一强烈的吸的紫外线波段有一强烈的吸收峰，峰值的大小与收峰，峰值的大小与DNADNA的含量有关。的含量有关。2.2.过程过程.稀释稀释 2uLPCR2uLPCR反应液，加入反应液，加入98uL98uL蒸馏水，即蒸馏水，即将样品进行将样品进行5050倍稀释倍稀释.对照调零对照调零以蒸馏水作为空白对照，在波长以蒸馏水作为空白对照，在波长260nm260nm处，将处，将紫外分光光度计的读数调节至零。紫外分光光度计的读数调节至零。取取DNADNA稀释液稀释液100uL100u

25、L至比色杯中，测定至比色杯中，测定260nm260nm处处的光吸收值的光吸收值.计算计算.计算计算DNADNA含量含量(g g)5050(260nm(260nm的读数的读数)稀释倍数稀释倍数5050：1 1 g g/ml/ml的的DNADNA在厚度为在厚度为1cm1cm比色杯中的吸比色杯中的吸光值为光值为0.020.02光光吸吸收收波长波长nmnm2602602402402202202802800.10.10.20.2比色杯比色杯四四.课题延伸课题延伸例如：例如：PCRPCR产物每轮循环增加一倍，产物每轮循环增加一倍，3030轮循环轮循环扩增量达扩增量达2 23030个拷贝（个拷贝（10109

26、 9拷贝）拷贝）PCRPCR技术是技术是8080年代中期发展起来的体外核酸扩年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。增技术。它具有特异、敏感、产率高、它具有特异、敏感、产率高、快快速、速、简便、重复性好、易自动化等突出特点简便、重复性好、易自动化等突出特点五五.实验小结实验小结PCRPCR仪仪加加热热使使（）变变性性,复复性性使使引引物物与与模模板板DNADNA（）,延延伸伸需需将将反反应应温温度度升升至至中中温温(),),在在（）的的作作用用下下,以以 （）为为原原料料,以以（）为为复复制制的的起起点点,合合成成新新链链。如如此此重重复复改改变变反反应应温温度度,经经（）三三个个阶阶段段为为一一

27、个个循循环环,每每一一次次循循环环使使特特异异区区段段的的基基因因拷拷贝贝数数放放大大一一倍倍,一一般般样样品品是是经经过过3030次次循循环环,最最终终使使基基因因放放大大了了数数百百万万倍倍;将将扩扩增增产产物物进进行行电电泳泳,经经溴溴化化乙乙锭锭染染色色,在在紫紫外外灯灯照照射射下下肉肉眼眼能见到扩增特异区段的能见到扩增特异区段的DNADNA带。带。模板模板互补互补TaqTaq聚合酶聚合酶四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸引物引物变性、复性和延伸变性、复性和延伸7272练习练习 (课堂检测课堂检测)1 1、DNADNA单链的单链的_末端为末端为3 3端端,_末端为末端为5 5端端,在在DNA

28、DNA复制时复制时,引引物从模板链的物从模板链的_端配对结合端配对结合.在在_酶的作用下酶的作用下,从引物的从引物的_端端,使子链向下延伸使子链向下延伸.2 2每次循环可以分为每次循环可以分为_这三个过程这三个过程,对应温度分别为对应温度分别为_._.磷酸基团磷酸基团羟基羟基羟基羟基DNA聚合聚合3/变性、复性、延伸变性、复性、延伸9494、55 55 、72 72 9090以上、以上、5050左右左右 、72 72 左右左右练习巩固练习巩固1、关于、关于PCR技术的应用，错误的一项是技术的应用，错误的一项是A 古生物学、刑侦破案、古生物学、刑侦破案、DNA序列测定序列测定B 诊断遗传疾病、基

29、因克隆、古生物学诊断遗传疾病、基因克隆、古生物学C DNA序列测定、基因克隆、刑侦破案序列测定、基因克隆、刑侦破案D 诊断遗传疾病、合成核苷酸、诊断遗传疾病、合成核苷酸、DNA序列测定序列测定2、DNA的合成方向总是从子链的哪一端向的合成方向总是从子链的哪一端向哪一端延伸？哪一端延伸？3、PCR技术最突出的优点是技术最突出的优点是A 原理简单原理简单 B 原料易找原料易找C TaqDNA聚合酶有耐热性聚合酶有耐热性D 快速、高效、灵活、易于操作快速、高效、灵活、易于操作5/3/4、做、做PCR使用的微量离心管、枪头、缓使用的微量离心管、枪头、缓冲液及蒸馏水使用前必须进行的关键步骤冲液及蒸馏水使用前必须进行的关键步骤是是A 反复洗涤反复洗涤 B 不怕外源不怕外源DNA污染污染C 高压灭菌高压灭菌 D 在在20 储存储存