分子生物学-技术.ppt

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1、分子生物学分子生物学大理学院生化学院大理学院生化学院阿周存阿周存第三节：聚合酶链反应（第三节：聚合酶链反应（PCRPCR）聚合酶链反应（聚合酶链反应（polymerase chain reaction polymerase chain reaction PCRPCR ）技术是技术是Kary MullisKary Mullis发明的。它发明的。它是一种对特定的是一种对特定的DNADNA片段在体外进行快速扩增的新方法。片段在体外进行快速扩增的新方法。在年的一在年的一次学术会议上，此方法首次被介绍，在分子生物科学次学术会议上，此方法首次被介绍，在分子生物科学家中也引起了链锁反应，大家很快地纷纷采用这

2、个方家中也引起了链锁反应，大家很快地纷纷采用这个方法在短短的几年内，迅速成为分子生物学的一法在短短的几年内，迅速成为分子生物学的一项常规手段，并得到了广泛的实际应用，被许多科学项常规手段，并得到了广泛的实际应用，被许多科学家视为近三十年来分子生物学领域最重要的一项技术家视为近三十年来分子生物学领域最重要的一项技术突破。年，突破。年，MullisMullis因此获得诺贝尔化学奖。因此获得诺贝尔化学奖。PCR PCR主要由高温主要由高温变性、低温退火变性、低温退火和和适温延伸适温延伸三三个步骤反复的热循环构成，通过变性，待扩增的靶个步骤反复的热循环构成，通过变性，待扩增的靶DNADNA双链成为两条

3、单链双链成为两条单链DNADNA模板；退火时模板；退火时,两条人工合两条人工合成的寡核苷酸引物与互补的单链成的寡核苷酸引物与互补的单链DNADNA模板结合，形成模板结合，形成部分双链；在部分双链；在TaqTaq酶的最适温度下，以引物酶的最适温度下，以引物33端为端为合成的起点，以单核苷酸为原料，沿模板以合成的起点，以单核苷酸为原料，沿模板以5353方向延伸，合成方向延伸，合成DNADNA新链。这样，每一双链新链。这样，每一双链的的DNADNA模板，经过一热循环后就成了两条双链模板，经过一热循环后就成了两条双链DNADNA分分子。如此反复进行，每一次循环所产生的子。如此反复进行，每一次循环所产生

4、的DNADNA均能成均能成为下一次循环的模板为下一次循环的模板.经过经过2530个循环后，理论上个循环后，理论上可使基因扩增可使基因扩增109倍以上，实际上一般可达倍以上，实际上一般可达106107倍。倍。一、一、PCRPCR的原理的原理二、二、PCR反应系统的组成反应系统的组成引物引物酶酶dNTPdNTP模板模板Mg2+Mg2+TaqDNATaqDNATaqDNATaqDNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶Buffer(Buffer(Buffer(Buffer(缓冲液缓冲液缓冲液缓冲液)（一）模板（一）模板模板浓度过高会导致解链不完全，扩增效率下模板浓度过高会导致解链不完全，扩增效率下降，有时过高的

5、浓度导致扩增不能启动；浓度过低，降，有时过高的浓度导致扩增不能启动；浓度过低，会影响产物的产率。会影响产物的产率。一般在一般在25-50ul的反应体系，模板量的反应体系，模板量100ng-200ng左右。左右。单、双链单、双链DNA或或RNA都可以作为都可以作为PCR的样品。的样品。若起始材料是若起始材料是RNA，须先通过逆转录得到第一，须先通过逆转录得到第一条条cDNA。（二）四种脱氧三磷酸核苷酸（二）四种脱氧三磷酸核苷酸（4dNTPs）dNTP终浓度高于终浓度高于50mmol/L会抑制会抑制Taq酶的酶的活性，高浓度活性，高浓度dNTPs易产生错误掺入，导致产物易产生错误掺入，导致产物中的

6、某些碱基发生改变。而浓度太低，降低反应中的某些碱基发生改变。而浓度太低，降低反应物的产量物的产量。一般浓度为。一般浓度为200mol/L。四种四种dNTP的浓度应相同，其中任何一种的浓度应相同，其中任何一种浓度偏高或偏低，都会诱导聚合酶的错误掺入，浓度偏高或偏低，都会诱导聚合酶的错误掺入，降低合成速度，过早终止反应。降低合成速度，过早终止反应。（三）引物（三）引物（primer)引物在引物在PCR反应中非常关键，引物是决定反应中非常关键，引物是决定PCR扩增片段长度、位置和结果（特异性和效率）扩增片段长度、位置和结果（特异性和效率）。设计一对好的引物，。设计一对好的引物，PCR基本成功基本成功

7、。引物的量对反应也有较大的影响，浓度过高引物的量对反应也有较大的影响，浓度过高易形成引物二聚体且产生，非特异性产物出现，易形成引物二聚体且产生，非特异性产物出现，低浓度引物经济、特异，但浓度过低，不足以完低浓度引物经济、特异，但浓度过低，不足以完成成30个循环的扩增反应，则会降低个循环的扩增反应，则会降低PCR的产率的产率，常用量：常用量：25-50ul反应体系反应体系10-20pmol如何引物设计。如何引物设计。三、三、TaqDNA聚合酶聚合酶 最适延伸温度最适延伸温度7075，在，在PCR反应混合液中，反应混合液中，Taq酶在酶在95的半寿期为的半寿期为40min，故在，故在PCR循环中选

8、循环中选用的变性温度，用的变性温度，不宜高于不宜高于95。普通的普通的Taq酶没有酶没有35外切酶活性，如果发生外切酶活性，如果发生dNTP错误掺入，这种酶错误掺入，这种酶没有校正能力没有校正能力，因此运用，因此运用Taq酶进行酶进行PCR，产物中可能出现点突变，对克隆，产物中可能出现点突变，对克隆不利。不利。Taq酶延伸片段长度为酶延伸片段长度为10kb以内。以内。现在利用高保真的现在利用高保真的VentTMDNA多聚酶可解决上述问多聚酶可解决上述问题。该酶具有校正功能。在题。该酶具有校正功能。在95的半寿期达的半寿期达23h。Taq酶的活力受酶的活力受Mg2+离子的影响离子的影响,Mg2+

9、过量易过量易生成非特异性扩增产物，生成非特异性扩增产物，Mg2+不足易使产量降不足易使产量降低。低。最佳浓度为最佳浓度为1.5mmol/L,也可以根据具体情况调节。也可以根据具体情况调节。五、五、PCR缓冲液缓冲液 维持反应体系中维持反应体系中PH值的稳定。值的稳定。四四Mg2+三、三、PCR的特点的特点1 1、高度的灵敏性、高度的灵敏性、高度的灵敏性、高度的灵敏性:极微量的模板极微量的模板极微量的模板极微量的模板DNADNA即可扩增即可扩增即可扩增即可扩增大量产物，大量产物，大量产物，大量产物，pgpg级扩增到紫外线可见的级扩增到紫外线可见的级扩增到紫外线可见的级扩增到紫外线可见的ugug级

10、级级级（10106 6)。3 3、稳定可靠、重复性好，操作简便快速、稳定可靠、重复性好，操作简便快速、稳定可靠、重复性好，操作简便快速、稳定可靠、重复性好，操作简便快速2 2、高度的特异性、高度的特异性、高度的特异性、高度的特异性:19个个bp的引物随机出现的频率的引物随机出现的频率419=2.751010bp/次；其次，反应退火温度较高，次；其次，反应退火温度较高，引物非特异性结合很低引物非特异性结合很低.2-3h可完成实验。可完成实验。4.对标本的纯度要求低：对标本的纯度要求低：DNA粗制品及总粗制品及总RNA均可作为扩增模板。均可作为扩增模板。四、四、PCR的基本过程的基本过程(一）引物

11、的设计与合成一）引物的设计与合成（二）构建反应体系（加样）（二）构建反应体系（加样）（三）循环反应（三）循环反应在循环反应开始前进行预变性：在循环反应开始前进行预变性：944-5min1、变性：、变性：变性温度是决定变性温度是决定PCR反应中双链反应中双链DNA解链的温度，达不到变性温度就不会产生单链解链的温度，达不到变性温度就不会产生单链DNA模板，模板，PCR也就不会启动也就不会启动,过高会影响酶活过高会影响酶活性性。9430s（或（或951-2min)2、复性：复性：复性温度过高会影响引物与模板的结复性温度过高会影响引物与模板的结合，降低扩增效率，太高则不能扩增，复性温度合，降低扩增效率

12、，太高则不能扩增，复性温度可通过下列公式估计。时间一般为可通过下列公式估计。时间一般为30s。Ta=Tm-5=4(G+C)+2(A+T)-53、延伸：、延伸：72时酶催化核苷酸的标准速率可达时酶催化核苷酸的标准速率可达35100个核苷酸个核苷酸/秒。延伸时间根据扩增片断的秒。延伸时间根据扩增片断的长度而定长度而定1kb以上的以上的DNA片段，可根据片段长度片段，可根据片段长度将延伸时间控制在将延伸时间控制在17min。4 4、循环次数：、循环次数：一般为一般为25253535个周期个周期 。次数太少扩增效率低，次数太多则易出现次数太少扩增效率低，次数太多则易出现错误和非特异性背景。错误和非特异

13、性背景。25个循环后一般可达到平台期（不再按指数增加）。个循环后一般可达到平台期（不再按指数增加）。9494949455557272五、五、PCR中应注意的事项中应注意的事项PCR反应中可能出现的问题反应中可能出现的问题：假阴性（不出现扩增条带）、假阳性、出现假阴性（不出现扩增条带）、假阳性、出现非特异扩增带非特异扩增带（一）防止污染（一）防止污染试剂小量分装试剂小量分装吸头及吸头及EP管一次性使用管一次性使用器皿及工作区域要分开，无菌操作器皿及工作区域要分开，无菌操作（二）设立对照：（二）设立对照：阳性对照：阳性对照：阳性模板阳性模板阴性对照：阴性对照：阴性模板阴性模板注意的事项注意的事项：

14、六、六、PCR相关技术相关技术1 1、巢式巢式巢式巢式PCRPCR（nestPCRnestPCR）：）：）：）：用两对引物分两步扩用两对引物分两步扩用两对引物分两步扩用两对引物分两步扩增目的片断，第一对在第二对引物的外则，先用第一增目的片断，第一对在第二对引物的外则，先用第一增目的片断，第一对在第二对引物的外则，先用第一增目的片断，第一对在第二对引物的外则，先用第一对引物扩增，然后以第一次扩增的产物作模板进行第对引物扩增，然后以第一次扩增的产物作模板进行第对引物扩增，然后以第一次扩增的产物作模板进行第对引物扩增，然后以第一次扩增的产物作模板进行第二次扩增，以增强目的片断的扩增效率和特异性。二次

15、扩增，以增强目的片断的扩增效率和特异性。二次扩增，以增强目的片断的扩增效率和特异性。二次扩增，以增强目的片断的扩增效率和特异性。2、多重、多重PCR（mutiplexPCR：在同一在同一在同一在同一PCRPCR体系中体系中体系中体系中加入数对不重叠区域的引物，同时扩增多个加入数对不重叠区域的引物，同时扩增多个加入数对不重叠区域的引物，同时扩增多个加入数对不重叠区域的引物，同时扩增多个DNADNA片片片片段。段。段。段。各对引物的退火温度相近。各对引物的退火温度相近。多重多重多重多重PCRPCRPCRPCR常用来检测同一基因的多个外显子的缺常用来检测同一基因的多个外显子的缺常用来检测同一基因的多

16、个外显子的缺常用来检测同一基因的多个外显子的缺失、多个基因的缺失，或在检测缺失设置内对照。失、多个基因的缺失，或在检测缺失设置内对照。失、多个基因的缺失，或在检测缺失设置内对照。失、多个基因的缺失，或在检测缺失设置内对照。3 3、反向、反向PCRPCR（Inverse PCR或或Reverse PCR）是用反向的互补引物来扩增两引物以外的是用反向的互补引物来扩增两引物以外的是用反向的互补引物来扩增两引物以外的是用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNADNADNADNA片段，对某个已知片段，对某个已知片段，对某个已知片段，对某个已知DNADNADNADNA片段两侧的未知序列进行扩片段两侧的未知序

17、列进行扩片段两侧的未知序列进行扩片段两侧的未知序列进行扩增。增。增。增。可对未知序列扩增后进行分析可对未知序列扩增后进行分析可对未知序列扩增后进行分析可对未知序列扩增后进行分析,如探索邻接如探索邻接如探索邻接如探索邻接已知已知已知已知DNADNA片段的序列。片段的序列。片段的序列。片段的序列。4 4、LP-PCRLP-PCR（Labelledprimers)Labelledprimers)（标记（标记（标记（标记PCRPCR，彩色，彩色，彩色，彩色PCRPCR）荧光素等对引物进行标记，用以直观地检荧光素等对引物进行标记，用以直观地检荧光素等对引物进行标记，用以直观地检荧光素等对引物进行标记，用

18、以直观地检测目的基因。测目的基因。测目的基因。测目的基因。特别适合大量临床标本的基因诊断，可同时检测特别适合大量临床标本的基因诊断，可同时检测特别适合大量临床标本的基因诊断，可同时检测特别适合大量临床标本的基因诊断，可同时检测多种基因成分多种基因成分多种基因成分多种基因成分5 5 5 5、不对称、不对称、不对称、不对称PCRPCRPCRPCR 扩增产生特异长度的单链扩增产生特异长度的单链扩增产生特异长度的单链扩增产生特异长度的单链DNADNADNADNA的。的。的。的。方法：方法：方法：方法：采用两种不同浓度的引物。其比例一般是采用两种不同浓度的引物。其比例一般是采用两种不同浓度的引物。其比例

19、一般是采用两种不同浓度的引物。其比例一般是150150150150。用途：用途：用途：用途：制备核酸序列测定的模板制备核酸序列测定的模板制备核酸序列测定的模板制备核酸序列测定的模板制备杂交探针制备杂交探针制备杂交探针制备杂交探针6、逆转录、逆转录PCR（reversetranscriptionPCR,RT-PCR)RT-PCRRT-PCR是以是以是以是以mRNAmRNA为模板，经逆转录酶作用为模板，经逆转录酶作用为模板，经逆转录酶作用为模板，经逆转录酶作用合成合成合成合成cDNAcDNA，再以，再以，再以，再以cDNAcDNA为模板进行为模板进行为模板进行为模板进行PCRPCR的扩增技的扩增技

20、的扩增技的扩增技术。术。术。术。使微量的使微量的mRNA（pg水平）迅速扩增（达水平）迅速扩增（达ngug水平），大大提高水平），大大提高mRNA的检出灵敏度。应的检出灵敏度。应用于基因表达与调控的研究。用于基因表达与调控的研究。用于构建用于构建cDNA文库文库7、定点突变技术、定点突变技术（1）寡核苷酸介导的定点突变技术）寡核苷酸介导的定点突变技术Smith70年代创立，年代创立，1993年获诺贝尔奖。年获诺贝尔奖。有目的使基因在特定的位置发生突变，从有目的使基因在特定的位置发生突变，从而研究基因的功能，以及氨基酸对结构和功能而研究基因的功能，以及氨基酸对结构和功能的影响。的影响。(2)重叠

21、延伸介导的定点突变技术重叠延伸介导的定点突变技术利用PCR技术进行基因的定点突变，操作简便。1遗传病的遗传病的诊断和产前诊断遗传病的遗传病的诊断和产前诊断2致病病原体的检测致病病原体的检测3癌基因的检测和诊断癌基因的检测和诊断4个体识别、亲子关系鉴别及法医物证个体识别、亲子关系鉴别及法医物证5动、植物检疫动、植物检疫6高科技生物医学领域中的应用高科技生物医学领域中的应用基因克隆、分子杂交、测序、转基因动植物等基因克隆、分子杂交、测序、转基因动植物等七、七、PCR应用领域应用领域第四节第四节DNA测序测序DNA碱基序列测定即碱基序列测定即DNA一级结构的测定，一级结构的测定，经典方法为经典方法为

22、Maxam-Gilbert（1977）建立的化学）建立的化学裂解法和裂解法和Sanger（1977）建立的建立的双脱氧末端终止双脱氧末端终止法法。随着随着PCR技术的发展，在技术的发展，在双脱氧末端终止法的双脱氧末端终止法的基础结合基础结合PCR技术，建立了技术，建立了循环测序法（目前最常循环测序法（目前最常用的）。用的）。一、双脱氧末端终止法一、双脱氧末端终止法双脱氧核苷酸（双脱氧核苷酸（ddNTP)具有阻断具有阻断DNA复制的作复制的作用用，若以待测得，若以待测得DNA片断为模板，在片断为模板，在DNA聚合和引物、聚合和引物、四种四种dNTP（四个反应管中又各含一种（四个反应管中又各含一种

23、ddDNAP)存在存在的情况下进行复制，则在每个反应管中会得到具有相的情况下进行复制，则在每个反应管中会得到具有相同末端而长度不同的片断。如在含有同末端而长度不同的片断。如在含有ddATP的反应管的反应管中，中，DNA链终止于链终止于A的位置，从而得到一系列的位置，从而得到一系列A为末端为末端的不同长度的片，其它三个反应管分别得到的不同长度的片，其它三个反应管分别得到T、G、C为末端的片断。反应终止后，四个反应管的产物同时为末端的片断。反应终止后，四个反应管的产物同时在一块聚丙烯酰胺凝胶上电泳，即可读出在一块聚丙烯酰胺凝胶上电泳，即可读出DNA的碱基的碱基顺序。顺序。二、循环测序法二、循环测序

24、法在体外反应体系中，加入待测的在体外反应体系中，加入待测的DNA模板、测模板、测序引物、序引物、TagDNA聚合酶、四种聚合酶、四种dNTP、四种分别、四种分别用不用颜色荧光标记的用不用颜色荧光标记的ddNTP，然后进行循环反，然后进行循环反应，形成长短不一的末端不同的应，形成长短不一的末端不同的(荧光颜色不同的荧光颜色不同的DNA片断，然后在片断，然后在DNA自动测序仪上电泳，同时自动测序仪上电泳，同时检测荧光信号，并通过电脑分析，读出待测检测荧光信号，并通过电脑分析，读出待测DNA的序列。的序列。引物设计的原则引物设计的原则:1、引物长度一般不低于、引物长度一般不低于18bp,最佳为最佳为

25、20-24bp,位于目的片断的两侧。位于目的片断的两侧。5aatgtaacctattgatggacattttggttgttttctgtttggggaagtgccatttttcacagttaagaaaaagtcagaaatttatcctaaaaattctgcagaatcaaaaaccacaatgaccctcggggtttccacttggaaaattattacaaactgtatttttgcttatgagctttatattgcactgccctga正向引物正向引物5ttgcatctgaaggagtgc3actgtgacctgttggagttgtttgcatctgaaggagtgcttaaaaccctt

26、ttctccccagTTCCCAGAGGCACCGACATCACTAAACAGATTATAATTGGCACTCCTGGGACTGTCCTAGATTGGTGTTTTAAACTAAAATTGATTGATTTGACTAAGATTCGTGTGTTTGTCCTGGATGAAGCAGATGTGATGATTGACACTCAAGGATTCTCAGATCATAGTATTCGTATTCAAAGgtaatcttcagagtcttcctctcttcctcagccttctgtccagatggggaatttcatttgtttactcctccacatt3gtcggaagacaggtctac5反向引物反向引物atctttat

27、tgcttaactcctcaccaccttcacctctaaaataaatttgagtttttacattattttcaccagttcaagggtccctcagactgct3有时引物不起作用，理由不明，可移动位置来解决。有时引物不起作用，理由不明，可移动位置来解决。2 2引物的（引物的（G+CG+C）%含量组成应均匀，尽量避免含有含量组成应均匀，尽量避免含有相同的碱基多聚体。两个引物中（相同的碱基多聚体。两个引物中（G+CG+C）%含量应尽含量应尽量相似，在已知扩增片段（量相似，在已知扩增片段（G+CG+C）%含量时宜接近于含量时宜接近于待扩增片段；一般以待扩增片段；一般以40%40%60%60

28、%为佳。为佳。两条引物的两条引物的Tm值的差异最好不要超过值的差异最好不要超过2。3引物内部引物内部应应避免内部形成明避免内部形成明显显的次的次级结级结构，构，尤其是尤其是发夹结发夹结构（构（hairpinstructures）。）。4引物之间两个引物之间不应发生互补，特别是引物之间两个引物之间不应发生互补，特别是在引物在引物3端，即使无法避免，其端，即使无法避免，其3端互补碱基也不端互补碱基也不应大于应大于2个碱基，否则易生成个碱基，否则易生成“引物二聚体引物二聚体”。（Primerdimer）所谓引物二聚体实质上是在所谓引物二聚体实质上是在DNA聚合酶作用聚合酶作用下，一条引物在另一条引物

29、序列上进行延伸所形成下，一条引物在另一条引物序列上进行延伸所形成的与二条引物长度相近的双链的与二条引物长度相近的双链DNA片段，是片段，是PCR常见的副产品，有时甚至成为主要产物。常见的副产品，有时甚至成为主要产物。5、DNA聚合酶是在引物聚合酶是在引物3端添加单核苷酸，所端添加单核苷酸，所以，引物以，引物3端端56个碱基与靶个碱基与靶DNA的配对要求必的配对要求必须精确和严格须精确和严格。55端无严格限制。端无严格限制。端无严格限制。端无严格限制。33555 5限制性内切酶的识别序列限制性内切酶的识别序列限制性内切酶的识别序列限制性内切酶的识别序列3355在扩增目的片断的同时，引入限制性内切

30、酶切点在扩增目的片断的同时，引入限制性内切酶切点556、引物设计后以后，还需通过、引物设计后以后，还需通过internet与人类基因与人类基因组数据库比对，了解其特异性。组数据库比对，了解其特异性。5gaaaaagtcagaaatttatcctaaaaattctgcagaatcaaaaaccacaatgaccctcggggtttccacttggaaaattattacaaactgtatttttgcttatgagctttatattgcactgccctgaactgtgacctgttggagttgtttgcatctgaaggagtgcttaaaacccttttctccccagTTCCCAGAGGCAC

31、CGACATCACTAAACAGATTATAATTGGCTGATTTGACTAAGATTCGTGTGTTTGTCCTGGATGAAGCAGATGTGATGATTGACACTCAAGGATTCTCAGATCATAGTATTCGTATTCAAAGgtaatcttcagagtcttcctctcttcctcagccttctgtccagatggggaatttcatttgtttactcctccacattatctttattgcttaactcctcaccaccttcacctctaaaataaatttgagtttttacattattttcaccagttcaagggtccctcagactgct35ctgtattt

32、ttgcttatgagctttatattgcactgccctgaactgtgacctgttggagttgtttgcatctgaaggagtgcttaaaacccttttctccccAgTTCCCAGAGGCACCGACATCACTAAACAGATTATAATTGGCTGATTTGACTAAGATTCGTGTGTTTGTCCTGGATGAAGCAGATGTGATGATTGACACTCAAGGATTCTCAGATCATAGTATTCGTATTCAAAGgtaatcttcagagtcttcctctcttcctcagccttctgtccagatggggaatttcatttgtttactcctccaca

33、ttatctttattgcttaactcctcaccaccttcacc35aaacccttttctccccagTTCCCAGAGGCACCGACATCACTAAACAGATTATAATTGGCTGATTTGACTAAGATTCGTGTGTTTGTCCTGGATGAAGCAGATGTGATGATTGACACTCAAGGATTCTCAGATCATAGTATTCGTATTCAAAGgtaatcttcagagtcttc3(第一对引物扩增）第一对引物扩增）(第二对引物扩增）第二对引物扩增）用于检测特定基因序列的存在或缺失。电电电电泳泳泳泳引物引物内对照123AZFAZF区的缺失检测区的缺失检测已知序列已

34、知序列已知序列已知序列未知序列未知序列未知序列未知序列未知序列未知序列未知序列未知序列限制酶限制酶限制酶限制酶限制酶限制酶限制酶限制酶连接酶连接酶连接酶连接酶病毒病毒1 1 病毒病毒2 2 病毒病毒 3 3 病毒病毒4 4不同病毒的引物用不同颜色的荧光标记不同病毒的引物用不同颜色的荧光标记标记引物标记引物标记引物标记引物观察观察PCRPCR产物产物高浓度引物低浓度引物逆转录酶聚合酶mRNAmRNAcDNAcDNA模板模板杂化双链杂化双链PCR扩增cDNA文库的构建文库的构建1、制备、制备mRNA从总从总RNA中分离中分离mRNA。2、逆转录合成、逆转录合成cDNA用寡聚用寡聚T引物（引物（12

35、-18bp）和随机寡核苷酸（）和随机寡核苷酸（6bp)引物进引物进行逆转录行逆转录PCR。cDNA第一链第一链cDNA第二链第二链PCR(加接头）加接头）限制酶切点限制酶切点3、与载体连接、与载体连接，导入宿主细胞。，导入宿主细胞。诱变寡核苷酸引物诱变寡核苷酸引物单链单链M13噬菌体噬菌体DNA聚合酶延伸引物聚合酶延伸引物转染大肠杆菌，转染大肠杆菌，进行复制进行复制筛选突变体，测序鉴定筛选突变体，测序鉴定突变体突变体FMR2F1RMPCR3PCR1变性变性复性复性延伸延伸FM、RM错配引物错配引物PCR2PCR4F1R2dNTPddNTPDNA沿沿3端延伸端延伸ddATP参入后，参入后，DNA

36、延伸终止延伸终止循环反应循环反应（变性、复性、延伸）（变性、复性、延伸）本章小结本章小结1、基因工程的基本程序、工具酶、限制性内切酶的特基因工程的基本程序、工具酶、限制性内切酶的特点、载体的要求及常用类型，点、载体的要求及常用类型，2、核酸分子杂交的原理、影响因素、探针的类型、核酸分子杂交的原理、影响因素、探针的类型、3、PCR的原理和特点及其用途。的原理和特点及其用途。4、双脱氧末端终止测序法的基本原理双脱氧末端终止测序法的基本原理5、基本概念基本概念分子克隆、限制性内切酶、分子克隆、限制性内切酶、cos质粒、基因组文质粒、基因组文库、库、cDNA文库、核酸分子杂交、探针、缺口平移、文库、核

37、酸分子杂交、探针、缺口平移、PCR、退火、退火、ddNTP，RT-PCR。1、分子克隆中常用的酶有、分子克隆中常用的酶有：A限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶BDNA连接酶连接酶CDNA解链酶解链酶DKlenow片段片段E、碱性磷酸酶、碱性磷酸酶2、核酸分子杂交中不需要的物质、核酸分子杂交中不需要的物质A、待测、待测DNAB、核酸探针、核酸探针C、引物、引物RNAD、4NTP3、那种探针不能用于核酸过分子杂交。、那种探针不能用于核酸过分子杂交。A、RNA探针探针B、DNA双链探针双链探针C、cDNA探针探针D、多肽链探针、多肽链探针4、PCR主要原理主要原理A、变性、变性B、复性、复性C、延伸、延伸D、连接、连接1.用图示说明用图示说明PCR的原理。的原理。2、核酸分子杂交的原理及其影响因素、核酸分子杂交的原理及其影响因素3、Lac操纵子的结构及调控机制。操纵子的结构及调控机制。