分子生物学-复制.ppt

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1、基因信息的传递地球生命的传奇生命简史生命简史u The Big Bang 150200亿年u Milky Way galaxy 136亿年 u solar system 46亿年The Life Story 40亿年u 古细菌、真细菌、真核原生生物The Life Story 40亿年u寒武纪生命大爆炸寒武纪生命大爆炸 5 56 6亿年亿年 多细胞生物多细胞生物u植物登陆植物登陆 4 4亿年亿年u动物登陆动物登陆 3.6 3.6亿年亿年u哺乳动物诞生哺乳动物诞生 2.3 2.3亿年亿年u灵长类动物诞生灵长类动物诞生 5500 5500万万 8000 8000万万 年年u人类直系祖先诞生人类直系

2、祖先诞生 700 700万万 500 500 万万u现代人诞生现代人诞生 5 51010万年万年u人类文明史人类文明史 1 1万年万年科学家复原的“杜马伊”形象学科简史u 1859 1859 年年 Charles Robert Darwin Charles Robert Darwin u 1865 1865年年 Mendels Pea Mendels Peau 1941 1941年年 One Gene,One Enzyme One Gene,One Enzymeu 1953 1953年年 DNA double helix DNA double helixu 1966 1966年年 Geneti

3、c Code Cracked Genetic Code Cracked u 1972 1972年年 First recombinant DNA First recombinant DNAu 1982 1982年年 First transgenic mice First transgenic miceu 2003 2003年年 人类基因组测序基本完成人类基因组测序基本完成 分子生物学发展阶段u 准备和酝酿阶段准备和酝酿阶段 蛋白质是生命的主要基础物质蛋白质是生命的主要基础物质 生物遗传的物质基础是生物遗传的物质基础是DNA DNA u现代分子生物学的建立和发展阶段现代分子生物学的建立和发展阶段遗

4、传信息传递遗传信息传递中心法则的建立中心法则的建立分子生物学发展阶段u初步认识生命本质及改造生命的深入发展阶段初步认识生命本质及改造生命的深入发展阶段重组重组DNADNA技术的建立和发展技术的建立和发展 基因组研究的发展基因组研究的发展 单克隆抗体及基因工程抗体的建立和发展单克隆抗体及基因工程抗体的建立和发展 基因表达调控机理基因表达调控机理 细胞信号转导机理研究成为新的前沿领域细胞信号转导机理研究成为新的前沿领域第十章第十章 DNA DNA的生物合成的生物合成 Biosynthesis of DNABiosynthesis of DNA复制过程复制过程起始、延伸、终止起始、延伸、终止损伤修复

5、损伤修复光、切除、重组、光、切除、重组、SOS修复修复复制条件复制条件其它蛋白其它蛋白酶酶聚合酶聚合酶引物酶引物酶引发体引发体连接酶连接酶复制特点复制特点半保留复制半保留复制半不连续合成半不连续合成冈崎片断冈崎片断u复制复制DNADNA遗传信息遗传信息 亲代亲代子代；子代；u转录和翻译转录和翻译基因表达基因表达基本的三类基本的三类RNARNA制造蛋白质，决定生物的表现型制造蛋白质，决定生物的表现型中心法则中心法则the central dogma中心法则的补充中心法则的补充uRNA病毒复制RNA遗传信息 亲代子代逆转录RNA DNADNA dependent DNA polymerase DD

6、DPDNA dependent RNA polymerase DDRPRNA dependent RNA polymerase RDRPRNA dependent DNA polymerase RDDP第一节第一节 复制基本规律复制基本规律 复制的特点复制的特点 一、半保留复制 semiconservative replication u亲代DNA链为模板，合成子代DNA链u子代DNA双链中含一条亲代DNA链 DNA复制机制的三种假说使子代使子代DNA与亲代与亲代DNA不同不同u1958年 M.Messelson 和 F.Stahl u15N培养基14N培养基 u提取DNA，作密度梯度离心 复

7、制基本方式的证明阐明半保留复制的意义u 从原则上保证了遗传的相对保守性从原则上保证了遗传的相对保守性u 奠定了奠定了DNADNA是遗传物质的地位是遗传物质的地位二、复制起始点 originuDNA复制从特定的位点起始（复制子）富含ATu原核生物 一个u真核生物 多个 三、双向复制三、双向复制bidirectional replicationbidirectional replicationu复制起始点为中心，向两个方向同时进行复制u微生物中，也可进行单向复制如滚环复制四、需要引物 primer u DNA Polymerase不能从头开始只能延伸已有核酸链u 引物酶 Primase合成一小段R

8、NA链(引物)提供3端自由羟基（3-OH）u 引物的大小原核生物:50100个核苷酸真核生物：约为10个核苷酸 五、半不连续复制uDNA聚合酶合成方向 5 3 uDNA双链逆向平行uDNA的解链和复制同时进行55端端3端端CGA5 5 33u ATATu TTTTTATATu ATATTTTTTu领头链(leading strand)连续u随从链(lagging strand)不连续冈崎片断(Okazaki fragment)原核生物 1K2K真核生物 100 第二节第二节 酶学和拓扑学变化酶学和拓扑学变化 DNADNA复制的条件复制的条件 u 底物&模板u 解旋解链u DNA聚合酶u DNA

9、连接酶底物底物 substrate substrate 模板模板templatetemplateudATP，dGTP，dCTP，dTTPuDNA复制是模板依赖性的(dNMP)n+1+PPi(dNMP)n+dNTPDNA解链及拓扑学变化解链及拓扑学变化u解螺旋酶（unwinding enzyme）解链酶 或 rep蛋白解开DNA双链2ATP/bp base pair 解螺旋酶解螺旋酶引发体和引发体和RNARNA引物引物u引发体:引发前体+引物酶u引发前体:由若干蛋白因子聚合而成DnaA蛋白识别复制起始点，并具有ATPase活性。u引物酶 特殊的DDRP单链单链DNADNA结合蛋白结合蛋白u单链D

10、NA结合蛋白（single strand binding protein,SSB）又称螺旋反稳蛋白（HDP）稳定ssDNA，便于复制 保护ssDNA，免受核酸酶的降解拓扑异构拓扑异构酶酶(topoisomerase)(topoisomerase)u拓扑异构酶切断DNA双链中的一条链松开双螺旋后再将DNA链连接起来避免出现链的缠绕。u拓扑异构酶可切断DNA双链使DNA的超螺旋松解后，再将其连接起来。解链过程中正超螺旋的形成解链过程中正超螺旋的形成DNADNA聚合聚合酶酶(DDDP)（一）种类和生理功能：u原核生物 DNA聚合酶（pol）1958年 A.KornbergDNA聚合酶（pol）DNA

11、聚合酶（pol）主力upol 由十种亚基组成全酶的核心部分（核心酶）、和三种亚基组成亚基 5 3聚合活性亚基 3 5外切活性 保证DNA复制的精确性/保真性upol 无 5 3外切活性外切酶活性的方向uATTAGCACC AMP+TTAGCACC CMP+ATTAGCAC 亚基与模板的结合亚基与模板的结合 亚基形成一个围绕亚基形成一个围绕DNA的环状钳的环状钳upol 单一肽链可被某些蛋白酶水解为两个片段大片段称为Klenow fragment常用的工具酶323个氨基酸个氨基酸小片段小片段5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性大片段大片段/Klenow 片段片段 604个氨基酸个氨基酸DNA聚合酶活

12、性聚合酶活性 5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性N 端端C 端端木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶DNA-pol Klenow片段是实验室合成片段是实验室合成DNA，进行，进行分子生物学研究中常用的工具酶。分子生物学研究中常用的工具酶。原核生物中的三种DNA聚合酶u真核生物 五种pol、pol、pol、pol、polpol 具有引物酶活性pol 主力Pol 参与线粒体DNA复制Pol 损伤修复、校读和填补缺口pol 低保真参与应急修复 碱基配对碱基配对碱基选择碱基选择及时校读及时校读DNA复制的保真性复制的保真性DNADNA连接酶连接酶uDNA连接酶(DNA ligase)催化DNA片段之间磷酸二酯键形成uD

13、NA连接酶催化的条件是：3-OH，5-P未封闭的缺口位于双链DNA中（局部）消耗能量原核生物中由NAD+供能真核生物中由ATP供能。HO5335DNA连接酶连接酶ATPADP5353DNA连接酶在复制中起接合缺口的作用连接酶在复制中起接合缺口的作用在在DNA修复、重组及剪接中起同样作用修复、重组及剪接中起同样作用基因工程的重要工具酶基因工程的重要工具酶DNA聚合酶、DNA连接酶、拓扑酶都形成磷酸二酯键区别？小结u 基本特征基本特征 origin semiconservative semi-discontinuous Primeru 主要酶 Dna B，ssb，topo Primase DNA

14、Polymerase DNA ligase一、复制的起始u预引发：DnaA+DnaB+DnaC+SSB解旋解链，形成复制叉：组装引发体：u引发引物酶合成引物DnaG拓扑酶解旋第三节第三节 DNA DNA生物合成过程生物合成过程 oriC结构特征u 含三组串连重复序列富含ATu 2对反向重复序列两个相同顺序的互补拷贝在同一DNA链上反向排列而成 复制起始识别区 二、复制的延长二、复制的延长（一）聚合子代DNA：uDNA聚合酶沿模板链35方向滑动，在53方向聚合子代DNA链（二）引发体移动：u引发体向前移动，解开新的局部双螺旋，形成新的复制叉，随从链重新合成RNA引物，继续进行链的延长。三、复制的

15、终止三、复制的终止（一）去除引物，填补缺口：uDNA聚合酶 53 外切酶活性 53 聚合酶活性（二）连接冈崎片段：u在DNA连接酶的催化下，形成最后一个磷酸酯键，将冈崎片段连接起来，形成完整的DNA长链。（三）真核生物端粒的形成：u端粒（telomere）真核生物染色体末端的结构通常膨大成粒状富含G、T的短重复序列构成末端由于引物RNA的水解而可能缩短u端粒酶端粒酶RNA(human telomerase RNA,hTR)端 粒 酶 协 同 蛋 白(human telomerase associated protein 1,hTP1)端粒酶逆转录酶(human telomerase rever

16、se transcriptase,hTRT)端粒端粒酶酶(telomerase)(telomerase)的作用机制的作用机制第四节第四节 逆转录和其它复制方式逆转录和其它复制方式自学自学u 逆转录病毒逆转录病毒 逆转录酶逆转录酶u cDNA cDNA文库文库u 其它复制方式其它复制方式 滚环复制滚环复制 噬菌体噬菌体DNADNA D D环复制环复制 线粒体线粒体DNADNA第五节第五节 DNA DNA的损伤与修复的损伤与修复u DNA损伤突变 mutation 突变的意义 突变的类型 突变的效应u 损伤修复 直接修复 取代修复涉及DNA的合成第五节第五节 DNA DNA的损伤与修复的损伤与修复

17、 uDNA一级结构的任何改变称为突变 mutationu常见形式碱基脱落碱基修饰/去修饰交联链的断裂重组 一、突变的意义一、突变的意义u 突变是演化的分子基础 横向 自然界生命的多样性 纵向 生命的复杂性u 突变是某些疾病的发病基础二、引起突变的因素二、引起突变的因素自发因素：u 自发脱碱基：糖苷键的自发断裂，引起碱基脱落u 自发脱氨基C-UA-Hu 复制错配 物理因素：u紫外线、电离辐射、X射线X射线和电离辐射常引起DNA链的断裂紫外线常引起嘧啶二聚体的形成 TT，TC，CC等二聚体 引起复制障碍。化学因素化学因素u脱氨剂：亚硝酸与亚硝酸盐，可加速C生成U，A生成Hu烷基化剂uDNA加合剂苯

18、并芘u碱基类似物u断链剂过氧化物，巯基化合物三、三、DNADNA突变的类型突变的类型u点突变转换 同类型碱基的取代颠换 不同类型碱基的取代 镰形红细胞贫血链第6位氨基酸突变 CTC -CAC 插入 增加一碱基对 缺失 减少一碱基对碱基的转换碱基的转换三、三、DNADNA突变的类型突变的类型u复突变插入 增加一段顺序缺失 减少一段顺序倒位 一段碱基顺序发生颠倒移位 一段碱基顺序的位置发生改变重排 一段碱基顺序与另一段碱基顺序发生交换DNADNA突变的效应突变的效应u同义突变 有时引起翻译效率下降u误义突变 氨基酸顺序改变u无义突变 多肽链提前终止u移码突变(框移突变)四、四、DNADNA损伤的修

19、复损伤的修复 uDNA损伤的修复方式可分为直接修复和取代修复两大类。（一）直接修复：1光复活：（light repairing）：u修复嘧啶二聚体的损伤u修复过程光复活酶（photolyase)识别嘧啶二聚体并与之结合形成复合物300600nm可见光获得能量将嘧啶二聚体的丁酰环打开光复活酶从DNA上解离。2转甲基作用u转甲基酶u去除修饰的甲基 3直接连接uDNA连接酶 （二）取代修复：1切除修复(excision repairing)：u广泛存在的修复机制，可适用于多种DNA损伤的修复u核酸内切酶；DNA糖苷酶。切除修复的过程切除修复的过程u DNA DNA糖苷酶切除碱基形成AP位点 无碱基的

20、片断u 核酸内切酶u Polu DNA连接酶着色性干皮病着色性干皮病(xeroderma pigmentosisxeroderma pigmentosis，XPXP)u 切除修复缺陷性遗传病u 不能修复紫外线照射引起的DNA损伤，易发生皮肤癌。2重组修复(recombination repairing)：u这是DNA的复制过程中所采用的一种有差错倾向的修复方式。u重组蛋白RecA、B、C 等催化等催化 3SOS修复：uDNA复制过程中出现u DNA分子受到长片段高密度损伤u特异性较低的DNA聚合酶u重组酶等 小结u DNA DNA复制复制 特点特点 origin origin 条件条件 primer primer 方向方向 过程过程 真核生物端粒真核生物端粒